Summary
Целью данного протокола является неинвазивным оценки сердечной структурные и функциональные изменения в модели мыши болезни сердца, созданной поперечным сужением аорты, используя B- и M-режим эхокардиографии и цвет / пульсовой волны, допплерографии.
Protocol
Протокол следует рекомендациям Институциональным животных по уходу и использованию комитетом Университета штата Вашингтон.
1. Хирургическая процедура и подготовка для работы с изображениями
- Тема мышей C57BL / 6 , в ТБК или фиктивной операции , как описано выше 10.
- Через неделю после того, как TAC или мнимого операции, анестезию мыши в индукционной камере с 2% изофлуран в смеси с 1 л / мин O 2. Подтвердите надлежащее обезболивание путем зависания до ног или хвоста щипать. Используйте ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Удалите волосы на груди, применяя крем для удаления волос. Лечить кожу мыши с 70% этанола.
- Закрепите мышь на платформе животного обработки в положении лежа на спине. Для того, чтобы поддерживать постоянный уровень анестезии, использовать головная часть для доставки 0,5 - 1% изофлуран смешивают с 1 л / мин O 2.
- Нанесите гель электрода к лапам мыши и ленты их к электродной площадке,
- Вставьте ректальный зонд для контроля температуры тела. Поддерживать температуру тела при 37 ° С с помощью грелки или лампы.
- Нанесите слой подогретого ультразвукового геля к грудной клетке мыши, в основном области, покрывающей сердце. Примечание: удалите ультразвуковой гель и высушить мышь с стерильную марлю после процедуры визуализации.
2. В Arch View Аортальной, использование B-режим и допплерографии для оценки Поперечная сужением аорты
- Используйте параметр B-режим, чтобы получить аортального вид арки для визуализации аорты, крупных артериальных ветвей, и участок сужения.
- Наклоните левую сторону платформы вверх, насколько это возможно, чтобы повернуть мышь в левое положение пролежни. Держите ультразвуковой датчик на стенде в вертикальном положении и поместите его на груди вдоль правой парастернальной линии, с насечкой, указывающей в сторону подбородка мыши. Примечание: Не сжимайте грудную клетку мыши при опускании transducer; минимальное количество давления требуется.
- Наклоните датчик вверх на уровне лопаткой и повернуть немного по часовой стрелке до дуги аорты не попадает в поле зрения. Обратите внимание на поперечное аортальный участок сужения, который расположен между разветвлением подвздошной артерии (IA) и левой общей сонной артерии (LCCA) (рисунок 1).
Примечание: Ни один Сужение не обнаружен в ложнооперированными мыши.
- Нажмите кнопку "цвет Доплера" на рабочей станции, чтобы переключиться в режим цветного допплеровского для контроля направленности и скорости кровотока через сайт сужения. Приобретать и сохранять изображения, нажав на кнопку "киношный магазин".
- Нажмите на кнопку "PW Doppler", чтобы переключиться на импульсный режим волны Допплера, и объем места образца (пунктирная курсор окна) сразу дистальной к месту сужения для поиска стеноза струи с самой высокой скоростью, а затем нажмите кнопку "PW Доплера" для получения формы волны фл аортывл и измерения пиковой скорости (Рисунок 2).
- Расчет градиента давления на участке сужения , используя уравнение модифицированного Бернулли: градиент давления = 4 х V макс 2. Только включать мышей с градиентом давления в диапазоне от 40 до 80 мм рт.ст. для дальнейшего анализа.
3. В парастернальной длинной оси View, использование B-режим и M-режим визуализации для оценки Сердечные Размеры и сократимость
- С помощью мыши, лежа в положении лежа на спине на платформе, удерживая датчик в вертикальной моды с насечкой, указывающей на голову мыши. Опустить датчик на грудную клетку, параллельной левой парастернальной линии и повернуть на 30 ° против часовой стрелки.
- Использование изображений B-режиме, чтобы получить полный длинной оси "саггитальную" вид на сердце. Отрегулируйте угол датчика и фокус глубины для визуализации левого желудочка, внутрижелудочкового септальный стенку и небольшой участок стенки правого желудочка. Sпр изображения для последующего измерения толщины стенок сердца и размеров камеры. Используя "сердечный пакет", выберите параметры, такие как IVS или LVAW, LVID и LVPW, а затем нажмите на изображение, чтобы сделать соответствующие строки для каждого параметра для получения измерений.
- Соблюдайте сердечные модели движения стенки и проверить возможные нарушения движения, в том числе акинеза, гипокинезии и асинхронности.
Примечание: Акинезия и гипокинезии обозначают полную и частичную потерю движения сердечной стенки, соответственно. Асинхронность обозначает нерегулярное, несогласованное движение сердца стенки. - Переключение в M-режиме, место M-режим курсора перпендикулярно к стенкам ЛЖ на уровне папиллярных мышц, и получать изображения для последующего измерения сердечных размеров и фракционного укорочения (рисунок 3).
4. В парастернальной короткой оси View, использование B-режиме и M-режима визуализации для оценки сердечного морфологию и функцию
- FrО.М. парастернальная вид длинной оси, получим парастернальной вид сокращённый оси путем поворота датчика на 90 ° по часовой стрелке. Отрегулируйте датчик, чтобы дать горизонтальное поперечное сечение "поперечный" вид сердца в B-режиме, с обеих папиллярных мышц, хорошо видимых и расположенных справа (часовой позиции 2 и 4).
- Переключение в M-режиме и установите ось M-режим на среднем уровне левого желудочка. Приобретать и сохранять изображения для последующего измерения толщины стенки сердца, размер камеры и фракции укорочения (рисунок 4). Используя "сердечный пакет", выберите параметры в SAX (короткой оси), включая МСО или LVAW, LVID и LVPW, и нажмите на изображение, чтобы сделать соответствующие строки для каждого параметра для получения измерений.
Примечание: Измерения , полученные здесь , должны тесно коррелируют с результатами , полученными в парастернальной перспективе оси (рисунок 5).
5. В апикальной четырех камерные представления, используйтеДопплерографии для оценки систолической и диастолической функции
- Получаем апикальная четырехкамерного визуализировать как левого и правого желудочков с предсердием в нижней части экрана. В В-режиме, с короткой оси зрения, наклон верхний левый угол платформы под углом голову мыши вниз и ориентировать датчик по направлению к правому плечу мыши. Это, по сути, чтобы добиться «корональной» взгляд на сердце, глядя в сторону вершины.
- Визуализируйте митрального клапана в В-режиме, и переключиться в режим цветного допплеровского, помещая объем образца (пунктирная курсор боксов) на кончике митрального клапана.
- Переключение в режим PW Доплера для оценки структуры потока через митральный клапан. Совместите доплеровский зонд курсора параллельно направлению митрального кровотока. Используйте угол менее 20 ° зонда для определения пиковой скорости (рисунок 6).
- Сохранение изображений для последующих измерений. Используйте "сердечный пакет" и выберите "поток М.В.". Нажмите каждый параметр и сделать соответствующие линии для получения измерений Доступные измерения включают:. Пик E скорость (раннее заполнение с активной релаксации желудочков), пик скорости (в конце заполнения с мерцательной сжатием), митральный изоволюмического релаксации и времени сжатия (IVRT и IVCT соответственно), и времени выброса (ЕТ).
- Рассчитайте индекс производительности миокарда (MPI) с помощью MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
6. постабортных Лечение животных
- Дайте аналгезии и / или стерильного физиологического раствора внутрибрюшинно хирургических животных при необходимости.
- Дайте животному восстановиться на грелку в положении лежа. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое подвергшийся процедуру компании других животных, пока полностью не выздоровел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан B-режим изображения аорты зрения арки сердца мыши , подвергнутой мнимого (рис 1А) или TAC операции (Рисунок 1В). Дуга аорты, безымянной артерии, левой общей сонной артерии и левой подключичной артерии показаны. Обратите внимание, что сужение аорты отчетливо видна в ТБК, но не мнимое сердце. Цветного допплеровского изображения с точки зрения аорты показаны на рисунке 2А. Формы волны потока аорты через сайт сужения были захвачены PW допплерографии (рис 2В). Успешное TAC приведет к значительному увеличению скорости потока ниже по течению от сайта Сужение (обычно ~ 4 м / сек в TAC мышей). Градиент давления на сужении, рассчитывают на основе скорости пикового потока в соответствии с уравнением Бернулли модифицированную (фиг.2с).
Рисунок 3 (рис 3А) или TAC сердца (Рисунок 3B). На верхней панели показаны в В-режиме изображения левого желудочка, межжелудочковой перегородки, и часть правого желудочка от фиктивном или TAC мышей. Нижняя панель показывает M-режим начертания нескольких сердечных циклов с мнимым или TAC мышей. Измерения сердечных размеров показаны, в том числе левого желудочка толщины передней стенки (LVAW) левого желудочка внутренний диаметр (LVID), левого желудочка толщина задней стенки (LVPW) в диастолу и систолу. Примечание значительно увеличенную толщину стенки в сердце мыши, подвергнутой TAC по сравнению с фиктивной операции.
На рисунке 4 представлены изображения парастернальной короткой оси зрения мнимого (рис 4A) или TAC сердца (Рисунок 4В). Верхняя часть каждой панели показывает ось М-режиме (Dottред линия) помещается в центре левого желудочка. Нижняя часть каждой панели является М-режим трассировки с линиями, указывающими кардиальные размеры, как описано выше. В качестве маркера гипертрофии желудочков и толщина стенки межжелудочковой перегородки может быть точно определена. Мыши , подвергшиеся TAC показали увеличенную толщину стенки по оценке LVAWd и LVPWd, желудочковая дилатация по оценке LVISd и LVISs, снижение сократительной по оценке LVFS и ФВ, и увеличение массы левого желудочка (рисунок 5).
На рисунке 6 показан B-режим апикальной четырех камерные (рис 6A, B) и PW доплеровские изображения трансмитрального картины течения (рис 6C, D). Измерения пика Е и скорости, IVCT, ВИР и ET показаны. E / A отношение и MPI вычисляются (рис 6E - I). Здоровое сердце мыши имеет E / A соотношение ≥1 и значение ≤0.5 MPI. В патологических условиях с диамstolic или систолического сердечной дисфункции, такие как у мышей, подвергнутых TAC, уменьшенной E / A отношение и / или увеличенным значением MPI обычно наблюдаются.
Рисунок 1. B-режим Изображение дуги аорты Вид мыши Сердце подвергнутого Шам хирургии (А) или TAC (B). Основные ветви аорты , включая подвздошной артерии (IA), левой общей сонной артерии (LCCA) и левой подключичной артерии (LSA) показаны. Заметим , что поперечная сужением аорты (обозначено белой стрелкой) могут быть визуализированы в ТБК , но не Sham сердце. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Цвет / PW Doppler Визуализация TransveРГП Aorta крови Fow от дуги аорты View. Цвет (A) и PW (B) доплеровских изображений с имитацией и TAC сердца показаны. Пик аортальный скорость получается из изображений PW Доплера используется для расчета градиента давления в соответствии с модифицированным уравнением Бернулли (C). Эти данные подтверждают успешную операцию TAC с градиентом давления ~ 70 мм ртутного столба. * Р <0,05 по сравнению с . Шам. Данные выражены в виде среднего значения ± РЭМ п = 15 для Sham и п = 13 для TAC. Т-тест Стьюдента используется для определения статистической значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. парастернальной длинной оси (Plax) Вид мыши Сердце подвергнутого Шам хирургии (А) или TAC (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Рисунок 4. парастернальной короткой оси (PSAX) Вид мыши Сердце подвергнутого Шам хирургии (А) или TAC (B). M-режим изображения указывают на размещение объема образца (пунктирная желтая линия в верхней панели) и измерение сердечных размеры в диастолу и систолу (синие линии на нижней панели). Звездочки указывают на папиллярные мышцы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Эхокардиографическая Оценка кардиологического морфологических и функциональных изменений после TAC. M-режим визуализации в короткой оси зрения была выполнена , как на рисунке 4. (A) LVAWd, левого желудочка передней толщиной стенки в диастолу. (B) LVPWd, левого желудочка толщина задней стенки в диастолу. (С) LVIDd левого желудочка внутренний диаметр в диастоле. (D) LVIDs, левого желудочка внутренний диаметр в систоле. (E) LVFS левого желудочка фракционное укорочение. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd х100%. (F) ФВ, фракция выброса левого желудочка. ФВ (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV и LVESV обозначают левого желудочка конечного диастолического и конечного систолического объема, соответственно. объем ЛЖ и фракция выброса точно оценены Simpso Способ N. объем ЛЖ оценивается путем подгонки многочисленных дисков в желудочке: Симпсона объем = [площадь (1) + площадь (2) + ... + область (п)] х длина. Симпсона площадь и длина получаются путем отслеживания эндокарда границы ЛЖ в длинной оси и короткой оси зрения. (G) ЛЖ (левого желудочка) масса. LV масса (мг) = 1,05 х [(LVIDd + LVPWd + IVSd) 3 - (LVIDd) 3]. Коэффициент 1,05 представляет собой удельную плотность миокарда. (Н) HR, частота сердечных сокращений. * Р <0,05 по сравнению с . Шам. Число мышей анализом показано, в барах каждой панели. Данные выражены в виде среднего значения ± т-тест Стьюдента СЭМ был использован для определения статистической значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
p_upload / 54101 / 54101fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Оценка трансмитрального кровотока с помощью допплерографии. (А и В) В-режиме апикальной четыре камеры мнимого (А) или TAC (B) сердце. LV, левый желудочек; RV, правый желудочек; MV, митральный клапан; ТВ, трехстворчатый клапан; LA, левое предсердие; RA, правое предсердие. (С и D) , Импульсно - волновой доплеровский сигнал транс-митрального кровотока в Sham (C) или TAC (D) сердца. Соответствующие измерения показаны. (Е) Е / А, пик Е и отношение скоростей. (F) IVCT, изоволюмического время сжатия. (G) IVRT, изоволюмического время релаксации. (H) ET, время выброса. (I) MPI, индекс производительности миокарда. * Р <0,05 по сравнению с . Шам. Число мышей анализом показано, в барах каждой панели. Данные представлены как среднее77; Т-тест Стьюдента СЭМ был использован для определения статистической значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эхокардиографии широко используется для оценки функции сердца в моделях грызунов 2,6 болезни сердца. По сравнению с инвазивным или терминальных методик , таких как измерение петли давление-объем 11 и ех естественных условиях работает сердце 12, эхокардиография обеспечивает мощную, неинвазивный инструмент для оценки текущих сердечных структурных и функциональных изменений в живых животных. Чтобы получить достоверные данные, важно для поддержания температуры тела и частоты сердечных сокращений в пределах физиологических пределах 13 путем тщательной регулировки устройства дл нагрева и уровень анестезии. Все изображения должны быть захвачены и проанализированы последовательно в соответствии со стандартизированными процедурами обработки изображений, чтобы облегчить сравнение между мышей разного штамма или генотипа.
ТАС обычно используется для индукции гипертрофии сердца и сердечной недостаточности у мышей 1. Неинвазивного измерения градиента давления поперек участка сужения Допплервизуализация представляет собой надежную оценку степени перегрузки давления у мышей. Успешное TAC обычно производит градиент давления ≥40 мм рт. Только мышей, подвергнутых воздействию аналогичной степени перегрузки давления должны быть включены для дальнейшего анализа, в то время как мыши с градиентом давления слишком низкой или слишком высокой, должны быть исключены. После TAC мышей ожидается развитие гипертрофии сердца в течение 1-2 недель, и сердечной дилатации через 4 недели, в зависимости от степени перегрузки давления и генетического фона мышей тестировали. Динамический Ремоделирование сердца и функциональные изменения следующие ТАС могут быть надежно оценены эхокардиографической визуализации, как описано выше.
В отличие от его частого использования в организме человека 14, цвет / PW Doppler только был недавно доступен в грызуна ультразвуковых изображений 9. Здесь мы также описали применение визуализации Доплера при измерении градиента давления, а также систолического и диастолического производительности. Мерание митрального и трикуспидального направленности кровотока и скорости (то есть., E / A отношение, ВИР, IVCT, ET и MPI) дает важную информацию о сердечной функции. Таким образом, эхокардиографии визуализация представляет собой важный инструмент для изучения сердечной физиологии и патофизиологии у мелких животных.
Ограничение сердца ультразвуковых изображений связана с изменчивостью и воспроизводимости результатов измерений. Для уменьшения внутри- и внутри- ошибок оператора, важно, чтобы стандартизировать как изображения получены и проанализированы. Измерения должны быть выполнены из нескольких акустических окон и режимов (В-режиме, М-режим, и PW / цвет Доплера) и по меньшей мере 3 отдельных измерений должны быть усреднены для обеспечения точности и надежности. Кроме того, существуют ограниченные акустические окна и иногда низкого качества изображения получаются мелких грызунов, подвергнутых хирургических процедур, таких как TAC, из-за отека тканей, хирургических рубцов и отека легких, интерферирующих с ультразвукомбалки. Для визуализации Доплера, иногда сложно отделить волны А Е и и получить полную форму волны митрального потока, из-за относительно высокой частоты сердечных сокращений в мелких грызунов, особенно у мышей, подвергнутых TAC или MI хирургии. Снижение частоты сердечных сокращений может быть полезно, чтобы получить измерения, но это будет влиять на значения, полученные с помощью допплерографии и, следовательно, интерпретации данных.
С учетом последних технических достижений, недавно выпущенные ультразвуковые системы обеспечивают высокое разрешение изображения и частоту кадров / выборки для обеспечения точного количественного измерения у мелких животных. Новые технологии эхокардиографии также улучшит чувствительность эхокардиографической оценки сердечной функции и позволяют раннее выявление патологии сердца. Например, спекл отслеживания штамм формирования изображения 15 был использован для точного измерения региональной функции миокарда. Новые технологии датчиков в настоящее время в стадии разработки обеспечит потенциал в режиме реального времени, 3D или 4Dизображений. Контрастная эхокардиография, которая находится в продвинутой разработки позволит объемных измерений, оценки тканевой перфузии, молекулярной визуализации сердечно-сосудистых заболеваний, а также доставки терапевтических агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 589-600 (2006).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circ Res. 98 (6), 837-845 (2006).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N., Edwards, J. G., Leinwand, L. A. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-914 (1995).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H.
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), e2100 (2010).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-714 (2002).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 437 (6), 979-985 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Pearlman, A. S., Stevenson, J. G., Baker, D. W. Doppler echocardiography: applications, limitations and future directions. Am J Cardiol. 46 (7), 1256-1262 (1980).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
