Summary
O objetivo deste protocolo é avaliar de forma não invasiva alterações cardíacas estruturais e funcionais em um rato modelo da doença de coração criado por constrição aórtica transversal, usando B e M-mode ecocardiografia e cor / impulso de imagem onda Doppler.
Protocol
O protocolo segue as orientações do Comité de Conservação e Uso Institucional animal da Universidade de Washington.
1. Procedimento Cirúrgico e Preparação para criação de imagens
- Objecto ratinhos C57BL / 6 a TAC ou cirurgia simulada como previamente descrito 10.
- Uma semana após a cirurgia simulada ou TAC, anestesiar o rato na câmara de indução com 2% de isoflurano misturado com 1 L / min de O2. Confirmar anesthetization adequado por falta de resposta aos pés ou beliscar a cauda. Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Remova o cabelo no peito, aplicando creme de depilação. Desinfectar a pele do rato com etanol 70%.
- Fixe o mouse para uma plataforma de tratamento de animais em decúbito dorsal. Para manter um nível constante de anestesia, utilizar um cone de nariz para proporcionar 0,5-1% de isoflurano misturado com 1 L / min de O2.
- Aplique gel eletrodo para as patas do mouse e gravá-los para o bloco de eletrodo.
- Inserir uma sonda retal para monitorar a temperatura do corpo. Manter a temperatura do corpo a 37 ° C através de uma almofada de aquecimento ou lâmpada.
- Aplicar uma camada de gel de ultra-som pré-aquecido para o peito do rato, essencialmente a área que cobre o coração. Nota: remover o gel de ultra-som e secar o mouse com gaze estéril após o procedimento de imagem.
2. No Arco Aórtico View, Use B-mode e Doppler Imaging para avaliar transversal aórtica constrição
- Use a configuração do modo B para obter a aorta vista arco, a fim de visualizar a aorta, principais ramos arteriais, eo site constrição.
- Incline o lado esquerdo da plataforma para cima, tanto quanto possível para girar o mouse para a posição de decúbito esquerda. Segure o transdutor de ultra-som por stand em posição vertical e coloque-o no peito ao longo da linha paraesternal direita, com o apontador entalhe em direção ao queixo do mouse. Nota: Não comprimir o tórax do rato, quando baixar o transducer; é necessária uma quantidade mínima de pressão.
- Incline o transdutor até ao nível da escápula e gire ligeiramente no sentido horário até o arco aórtico vem na vista. Observar o local de constrição da aorta transversal, que está localizado entre a ramificação da artéria inominada (IA) e artéria carótida comum esquerda (LCCA) (Figura 1).
Nota: Não constrição é detectado em ratos sham-operados.
- Clique no botão "color Doppler" na estação de trabalho para mudar para o modo Doppler colorido para monitorar direcionalidade e velocidade do fluxo sanguíneo em todo o site constrição. Adquirir e armazenar imagens, clicando no botão "loja de cine".
- Clique no botão "PW Doppler" para mudar a pulsar modo de onda Doppler, e volume de amostra lugar (a caixa cursor tracejada) imediatamente distal ao local de constrição para procurar o jato estenótica com a maior velocidade, em seguida, clique no botão "PW Doppler" para se obter formas de onda de fl aórticapico de velocidade ow e medir (Figura 2).
- Calcule gradiente de pressão através do site de constrição usando o modificada de Bernoulli equação: gradiente de pressão = 4 x V max 2. incluir apenas ratos com um gradiente de pressão que varia de 40 a 80 mmHg para posterior análise.
3. Na paraesternal eixo longo vista, utilize B-mode e modo-M na avaliação do cardíacas dimensões e contratilidade
- Com o mouse deitado em decúbito dorsal na plataforma, segurar o transdutor de forma vertical com o entalhe apontando para a cabeça do rato. Diminuir o transdutor sobre o tórax paralela à linha-esternal esquerda e rodar 30 ° no sentido anti- horário.
- Use imagens em modo B para obter um eixo longo completo "sagital" do coração. Ajustar o ângulo do transdutor e concentrar para visualizar a profundidade do ventrículo esquerdo, a parede do septo interventricular, e uma pequena porção da parede ventricular direita. Save as imagens para medições posteriores da espessura da parede cardíaca e dimensão da câmara. Usando o "pacote cardíaca", selecione parâmetros como IVS ou LVAW, LVID e VEPP, em seguida, clique sobre a imagem para desenhar linhas correspondentes para cada parâmetro para obter as medições.
- Observar os padrões de movimento da parede cardíaca e verificar a existência de possíveis anormalidades de movimento, incluindo acinesia, hipocinesia, e assincronia.
Nota: A acinesia e hipocinesia denotam perda completa ou parcial de movimento da parede cardíaca, respectivamente. Assincronia denota irregular movimento da parede, descoordenada cardíaca. - Alternar para o modo-M, local cursor do modo M perpendicular às paredes do VE ao nível do músculo papilar, e adquirir imagens para posterior medição das dimensões cardíacas e fração de encurtamento (Figura 3).
4. No eixo paraesternal curtos, utilize B-mode e modo-M na avaliação do Cardiac morfologia e função
- from a vista eixo longo paraesternal, obter-esternal eixo curto girando o transdutor de 90 ° no sentido horário. Ajuste o transdutor para dar uma vista horizontal em corte transversal "transversal" do coração em modo-B, com ambos os músculos papilares claramente visíveis e localizado para a direita (na posição 2 e 4 horas).
- Alternar para o modo-M e coloque o eixo do modo M no nível médio do ventrículo esquerdo. Adquirir e armazenar imagens para medições posteriores de espessura cardíaca parede, dimensão câmara, e fração de encurtamento (Figura 4). Usando o "pacote cardíaca", selecione os parâmetros em SAX (eixo curto), incluindo IVS ou LVAW, LVID e VEPP, e clique na imagem para desenhar linhas correspondentes para cada parâmetro para obter as medições.
Nota: As medições obtidas aqui deve correlacionar estreitamente aos obtidos no paresternal vista eixo de comprimento (Figura 5).
5. Na Vista apical de quatro câmaras, UseDoppler Imaging para avaliar função sistólica e diastólica
- Obter a vista apical quatro câmaras para visualizar ventrículos esquerda e à direita com os átrios na parte inferior da tela. No modo B, a partir do eixo curto, incline o canto superior esquerdo da plataforma para o ângulo da cabeça do rato para baixo e orientar o transdutor em direção ao ombro direito do mouse. Esta é, essencialmente, para alcançar uma visão "coronal" do coração olhando para cima em direção ao ápice.
- Visualize a válvula mitral em modo-B, e mudar para o modo Doppler colorido, colocando o volume da amostra (a caixa cursor tracejada) na ponta da válvula mitral.
- Alternar para o modo PW Doppler para avaliar os padrões de fluxo através da válvula mitral. Alinhar a sonda Doppler cursor paralelo à direcção do fluxo sanguíneo mitral. Usar uma sonda ângulo inferior a 20 ° para determinar a velocidade de pico (Figura 6).
- Salve as imagens para medições posteriores. Use "pacote cardíaca" e selecione "fluxo MV. "Clique em cada parâmetro e desenhar linhas correspondente para obter as medições de medições disponíveis incluem:. Pico da velocidade E (enchimento precoce com relaxamento ventricular ativo), um pico de velocidade (final de enchimento com contração atrial), relaxamento isovolumétrico mitral e tempos de contração (IVRT e TCIV respectivamente), e o tempo de ejecção (ET).
- Calcular o índice de performance miocárdica (MPI) pelo MPI = (IVCT + TRIV) / ET.
Tratamento 6. pós-procedimento de animal
- Proporcionar analgesia e / ou soro fisiológico estéril por via intraperitoneal a animais cirúrgicos quando necessário.
- Permitir que o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento na posição prona. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido ao procedimento para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
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Representative Results
A Figura 1 mostra imagens em modo B da aorta vista arco do coração de rato submetido a sham (Figura 1A) ou cirurgia TAC (Figura 1B). O arco aórtico, artéria inominada, artéria carótida comum esquerda e artéria subclávia esquerda são mostrados. Note-se que a constrição aórtica é claramente visível no TAC, mas não sham coração. Imagens Doppler colorido de vista da aorta são mostrados na Figura 2A. As formas de onda de fluxo aórtico através do local de constrição foram capturados por PW Doppler (Figura 2B). Bem sucedido TAC vai levar a uma velocidade de fluxo aumentou significativamente a jusante do local de constrição (tipicamente ~ 4 m / s em ratos TAC). Gradiente de pressão através da constrição foi calculada com base na velocidade de fluxo de pico, de acordo com a equação de Bernoulli modificada (Figura 2C).
Figura 3 (Figura 3A) ou do coração TAC (Figura 3B). O painel superior mostra as imagens em modo B do ventrículo esquerdo, o septo interventricular, e uma porção do ventrículo direito de ratos sham ou TAC. O painel inferior mostra os traçados em modo M de vários ciclos cardíacos de ratos sham ou TAC. As medições das dimensões cardíacas são mostradas, incluindo a espessura do ventrículo esquerdo da parede anterior (LVAW), o diâmetro interno do ventrículo esquerdo (LVID), a espessura da parede ventricular posterior esquerda (PPVE) em diástole e a sístole. Nota significativamente maior espessura da parede de coração de rato submetido a TAC em comparação com a cirurgia sham.
A Figura 4 mostra imagens do corte paraesternal eixo curto de sham (Figura 4A) ou do coração TAC (Figura 4B). A porção superior de cada painel mostra o eixo do modo-M (o DottA linha ed) colocado no centro do ventrículo esquerdo. A porção inferior de cada painel, é a-H o modo de rastreio com linhas que indicam as dimensões cardíacas, tal como descrito acima. Como um marcador de hipertrofia ventricular e espessura da parede septal pode ser determinado com precisão. Os ratos submetidos a TAC mostraram aumento da espessura da parede tal como avaliado por LVAWd e EDPPVE, dilatação ventricular, como avaliado por LVISd e LVISs, diminuição da contractilidade como avaliado por LVFS e FEVE, e aumento da massa ventricular esquerda (Figura 5).
A Figura 6 mostra B-mode apical de quatro câmaras (Figura 6A, B) e PW Doppler imagens de padrões de fluxo transmitral (Figura 6C, D). Medidas de E de pico e uma velocidade, IVCT, IVRT e ET são mostrados. A relação E / A e MPI são calculadas (Figura 6E - I). Um coração saudável rato tem uma relação E / A ≥1 e um valor ≤0.5 MPI. Em condições patológicas com diâmetroStolic ou disfunção cardíaca sistólica, tal como em ratinhos submetidos a TAC, uma diminuição da razão E / A e / ou um aumento do valor de MPI são tipicamente observados.
Figura 1. B-Modo de imagem do Arco Aórtico Vista do rato Coração Submetido a Sham Cirurgia (A) ou TAC (B). Os principais ramos da aorta, incluindo artéria inominada (IA), artéria carótida comum esquerda (ACCE), e da artéria subclávia esquerda (LSA) são mostrados. Note-se que a constrição aórtica transversal (indicado pela seta branca) pode ser visualizado no TAC, mas não sham coração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Cor / PW Doppler Imaging do Transverse Aorta Fow Sangue do Arco Aórtico View. Color (A) e PW (B) imagens de Doppler de sham e TAC corações são mostrados. Velocidade da aorta de pico obtidas a partir de imagiologia Doppler PW é usado para calcular gradiente de pressão de acordo com a equação de Bernoulli modificada (C). Estes dados confirmam uma bem sucedida cirurgia TAC com o gradiente de pressão de ~ 70 mmHg. * P <0,05 vs. Sham. Os dados são expressos como média ± SEM n = 15 para Sham e n = 13 para TAC. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. paraesternal eixo longo (PLAX) Vista do rato Coração Submetido a Sham Cirurgia (A) ou TAC (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 4. paraesternal eixo menor (PSAX) Vista do rato Coração Submetido a Sham Cirurgia (A) ou TAC (B). Imagens M-mode indicar a colocação do volume da amostra (linha pontilhada amarela no painel superior) e medição da cardíaca dimensões em diástole e sístole (linhas azuis no painel inferior). Os asteriscos indicam músculos papilares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. ecocardiográfica Avaliação da Cardiac alterações morfofuncionais Seguindo TAC. M-mode de imagem em eixo curto foi realizada como na Figura 4. (A) LVAWd, espessura esquerda parede anterior do ventrículo na diástole. (B) EDPPVE, deixou espessura da parede posterior ventricular na diástole. (C) LVIDd, deixou diâmetro interno ventricular em diástole. (D) LVIDs, diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole. (E) LVFS, ventricular esquerda fração de encurtamento. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) FEVE, fração de ejeção ventricular esquerda. FEVE (%) = (VDFVE-LVESV) / VDFVE x100%. VDFVE e LVESV denotam volume diastólico final e sistólico final do ventrículo esquerdo, respectivamente. volume do VE e fração de ejeção são precisamente avaliada por Simpso o método de N. volume do VE é estimado por numerosos discos de montagem para o ventrículo: volume de Simpson = [zona (1) + área (2) + ... + área (N)] x comprimento. área de Simpson e duração são obtidos traçando a fronteira endocárdica do VE no eixo longo e eixo curto. (G) LV (ventrículo esquerdo) em massa. Massa do VE (mg) = 1,05 x [(LVIDd + EDPPVE + CIV) 3 - (LVIDd) 3]. O factor de 1,05 representa a densidade específica do miocárdio. (H) HR, a frequência cardíaca. * P <0,05 vs. Sham. O número de ratinhos analisados é mostrado nas barras de cada painel. Os dados são expressos como média ± o teste t de Student sem foi utilizado para determinar a significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. Avaliação do fluxo sanguíneo transmitral por Doppler Imaging. (A e B) de modo B de quatro câmaras apical de sham (A) ou TAC cardíaca (B). VE, do ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito; MV, válvula mitral; TV, valva tricúspide; LA, átrio esquerdo; RA, átrio direito. (C e D) Doppler DP forma de onda do fluxo de sangue no trans-mitral simulada (C), ou TAC coração (D). medidas relevantes são mostrados. (E) E / A, E pico e uma proporção de velocidade. (F) IVCT, tempo de contração isovolumétrica. (G) IVRT, tempo de relaxamento isovolumétrico. (H) Et, o tempo de ejecção. (I) MPI, índice de performance miocárdica. * P <0,05 vs. Sham. O número de ratinhos analisados é mostrado nas barras de cada painel. Os dados são expressos como média77; O teste t de Student sem foi utilizado para determinar a significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ecocardiografia tem sido amplamente utilizada para avaliar a função cardíaca em modelos de roedores de 2,6 a doença cardíaca. Em comparação com metodologias invasivas ou terminais, tais como pressão-volume ponto de medição 11 e ex vivo trabalhando coração 12, ecocardiografia fornece uma ferramenta poderosa e não invasiva para avaliar as alterações cardíacas estruturais e funcionais em curso em animais vivos. Para obter dados fiáveis, é importante para manter a temperatura corporal e freqüência cardíaca dentro da faixa fisiológica 13 por cuidado ajustar o aparelho de aquecimento e o nível de anestesia. Todas as imagens devem ser capturadas e analisadas de forma consistente de acordo com os procedimentos normalizados de imagem, a fim de facilitar a comparação entre murganhos de diferentes estirpe ou genótipo.
TAC é utilizada para induzir a hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca em ratos 1. medição não invasiva de gradiente de pressão através do local de constrição por Dopplerimagem representa uma avaliação fiável do grau de sobrecarga de pressão em camundongos. Bem sucedida TAC normalmente produz um gradiente de pressão ≥40 mmHg. Apenas os ratinhos submetidos a grau similar de sobrecarga de pressão devem ser incluídas para análise posterior, enquanto que os ratinhos com um gradiente de pressão muito baixa ou muito elevada deve ser excluída. Seguindo TAC, espera-se que os ratinhos para o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca no prazo de 1-2 semanas, e a dilatação cardíaca após 4 semanas, dependendo do grau de sobrecarga de pressão e o fundo genético de ratinhos testados. A remodelação cardíaca dinâmico e alterações funcionais seguintes TAC pode ser confiavelmente avaliada pela imagem ecocardiográfica como descrito acima.
Em contraste com a sua utilização frequente em humanos 14, cor / PW Doppler foi apenas recentemente disponível em roedores ultra-sonografia 9. Aqui também descreveu as aplicações do Doppler no gradiente de pressão de medição, bem como o desempenho sistólica e diastólica. A medidamento de mitral e direcionalidade do fluxo sanguíneo tricúspide e velocidade (ie., relação E / A, IVRT, IVCT, ET, e MPI) fornece informações importantes sobre a função cardíaca. Assim imagem ecocardiográfica representa uma importante ferramenta para estudar fisiologia cardíaca e fisiopatologia em pequenos animais.
A limitação da ultra-sonografia cardíaca é relacionada com a variabilidade de medição e reprodutibilidade. Para reduzir a variabilidade inter- e intra-operador, é importante para padronizar como as imagens são adquiridas e analisadas. As medições devem ser realizadas a partir de várias janelas acústicas e modos (modo B, M-mode, e PW / Doppler colorido) e pelo menos 3 medidas separadas deve ser calculada a média para garantir a precisão e confiabilidade. Além disso, existem janelas acústicas limitado e, por vezes, as imagens de baixa qualidade são obtidos em pequenos roedores submetidos a procedimentos cirúrgicos tais como TAC, devido ao inchaço do tecido, cicatrizes cirúrgicas, e edema pulmonar que interferem com a ultra-sonsfeixes. Para Doppler, às vezes é difícil de E separada e ondas A e obter uma forma de onda completa do fluxo mitral, devido a uma taxa relativamente alta cardíaca em pequenos roedores, especialmente em camundongos submetidos à cirurgia TAC ou MI. A redução da taxa cardíaca pode ser útil para obter medições, mas isso vai afetar os valores obtidos por Doppler e, portanto, a interpretação dos dados.
Com os recentes avanços técnicos, os sistemas de ultra-som recém-lançado fornecer alta resolução de imagem e taxas de frame / amostragem para assegurar a medição quantitativa exata em pequenos animais. As novas tecnologias de ecocardiografia também vai melhorar a sensibilidade da avaliação ecocardiográfica da função cardíaca e permitir a detecção precoce de patologia cardíaca. Por exemplo, strain-tracking salpico 15 tem sido usado para medir com precisão a função miocárdica regional. Novas tecnologias actualmente em desenvolvimento transdutor irá proporcionar o potencial para o tempo real, ou 3D 4Dimagiologia. Ecocardiograma de contraste que está em desenvolvimento avançado irá permitir medições volumétricas, as avaliações de perfusão de tecidos, imagiologia molecular de doença cardiovascular, e administração de agentes terapêuticos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
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