Abstract
Neste protocolo, demonstramos um método para a síntese de 2'-alcino modificado cadeias de ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntese em fase sólida automatizados usando a química fosforamidite padrão. Oligonucleotídeos são pós-sinteticamente marcado por dois novos corantes cianina fotoestáveis usando click-química catalisada por cobre. A síntese de ambos os corantes dador e aceitador é descrita e é realizado em três etapas consecutivas. Com o ADN como a arquitectura envolvente, estes dois corantes submetidos a uma transferência de energia quando eles são colocados em estreita proximidade por hibridação. Portanto, emparelhamento de duas cadeias de ADN de cadeia simples é visualizada por uma mudança de cor de fluorescência. Esta mudança de cor é caracterizado por espectroscopia de fluorescência, mas pode também ser directamente observada por utilização de uma lâmpada ultravioleta de mão (UV). O conceito de uma leitura de cor de fluorescência dupla faz com que essas sondas de oligonucleotídeos excelentes ferramentas para imagiologia molecular, especialmente quando o pho descritacorantes tostable são utilizados. Deste modo, as sondas fotodegradação de imagiologia é prevenida, e os processos biológicos pode ser observada em tempo real durante um período de tempo mais longo.
Introduction
A imagem molecular representa uma técnica fundamental para a compreensão dos processos biológicos dentro de células vivas. 1-3 O desenvolvimento de sondas fluorescentes de ácidos nucleicos com base para tais aplicações químico-biológica tornou-se um campo de pesquisa em expansão. Estas sondas fluorescentes precisam atender a alguns requisitos para se tornar as ferramentas apropriadas para imagens de células. Em primeiro lugar, os corantes aplicados devem apresentam uma fluorescência com elevados rendimentos quânticos, os desvios grandes Stokes "e, mais importante ainda, elevados photostabilities para permitir a longo prazo in vivo de imagens. E em segundo lugar, devem mostrar uma leitura de fluorescência fiável. Convencional cromóforo-quencher-sistemas são baseados na leitura de uma única cor de fluorescência por mudanças simples em intensidades de fluorescência. 4 Esta abordagem assume o risco de resultados falsos positivos ou falsos negativos devido a autofluorescência de componentes intracelulares ou baixos rácios de sinal-ruído devido à têmpera indesejada por outro cOMcomponentes. 4
Recentemente, relatou-se no conceito de "semáforos de ADN" que mostram leituras de cor de fluorescência dupla usando dois cromóforos diferentes. 5-6 O conceito baseia-se na transferência de energia (ET) a partir do corante dador do corante aceitador à qual muda a fluorescência cor (ver Figura 1). Isto permite uma leitura mais fiável e, assim, fornece uma ferramenta poderosa para sondas de imagem fluorescentes. Rotulagem dos oligonucleótidos com corantes fluorescentes pode ser conseguida por duas abordagens diferentes. Os corantes podem ser incorporados durante a síntese química de ADN sobre uma fase sólida, utilizando blocos de construção de fosforamidite correspondentemente modificados. 7 Este método é limitado aos corantes que sejam estáveis sob as condições de desprotecção e de fosforamidite padrão. Como alternativa, as metodologias de modificação pós-sintética foram estabelecidas na química de oligonucleótidos. Aqui, nós demonstramos a síntese de um dos nossos novos fotosenergia tabela de pares de transferência de 8,9 e a rotulagem de pós-sintética de DNA usando catalisada por cobre 1,3-cicloadição entre azidas e alcinos (CuAAC). 10
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Protocol
Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos usados nestas sínteses são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas que são normalmente exigidos em laboratórios de química orgânica, tais como vestindo uma bata de laboratório, óculos de segurança e luvas.
1. Sintese dos corantes
Nota: ambos os corantes podem ser sintetizados pelos mesmos tipos de reacção Figura 2 mostra uma visão geral destas reacções..
- Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io iodeto (corante 1)
- Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io (Figura 2A, o passo a)
- Dissolve-se 466 mg de 4-picolina e 5,91 g de 1,3-diiodopropane em 10 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
- Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas.
- Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
- Adicionar 20 ml de acetato de etilo ao óleo residual e tratar a mistura num banho de ultra-sons W 120 durante 3 min.
- Recolhe-se o precipitado formado por filtração e lava-se cinco vezes com acetato de etilo. Seca-se o produto sólido sob vácuo O / N.
- Síntese de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, passo b)
- Dissolve-se 900 mg de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io em 12 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace, adicionar 376 mg de azida de sódio, e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
- Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas.
- Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
- Adicionar 15 ml de diclorometano ao resíduo.
- Filtrar e descartar o precipitado resultante.
- Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando uma podridãoAry evaporador para se obter o produto como um óleo castanho.
- Síntese de 1-metil-1H-indol-3-carbaldeído (Figura 2A, passo c)
- Sob gás inerte (árgon), dissolve-se 1,45 g de indol-3-carbaldeído, carbonato de potássio 1,52 g e 2,70 g de carbonato de dimetilo em 10 ml de dimetilformamida absoluta em um frasco de 50 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo.
- Agita-se a mistura a 130 ° C durante 19 h.
- Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida verter a mistura em gelo.
- Extrair a camada aquosa três vezes com 150 ml de acetato de etilo.
- Combinar as camadas orgânicas, lavá-las com água, secam-se com sulfato de sódio e eliminar o solvente a 50 ° C sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
- Acoplamento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io iodeto (corante 1) (Figura 2A, Passo d)
- Trabalhar sob árgon e sob exclusão de humidade. Dissolve 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metil-piridin-1-io e 48 mg de 1-metil-1H-indol-3-carbaldeído em 4 ml de etanol em um balão de 20 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo.
- Adicionar 0,07 ml de piperidina e aquecer a 80 ° C durante 4 h.
- Deixa-se arrefecer para a TA.
- Recolhe-se o precipitado resultante por filtração e lava-se três vezes com éter dietílico.
- Adicionar éter dietílico para recolher o sobrenadante e o precipitado resultante por filtração. Lavar três vezes com éter dietílico.
- Combinar os precipitados.
- Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io (Figura 2A, o passo a)
- Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) iodeto quinolin-1-io (corante 2)
- Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo a)
- Dissolve-se 715 mg de 4-metilquinolina e 5,91 g de 1,3-diiodopropane em 10 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
- Calora 85 ° C durante 16 horas.
- Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
- Adicionar 20 ml de acetato de etilo ao óleo remanescente e tratar a mistura num banho de ultra-sons W 120 durante 3 min.
- Recolhe-se o precipitado formado por filtração e lava-se cinco vezes com acetato de etilo. Seca-se o produto sólido sob vácuo O / N.
- Síntese de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo b)
- Dissolve-se 900 mg de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io em 12 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace, adicionar 333 mg de azida de sódio, e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
- Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas.
- Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
- Adicionar 15 ml de diclorometano ao resíduo.
- Filtrar e descartar o precipitado resultante.
- Remover o solvente under pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter o produto na forma de óleo castanho.
- Síntese de 1-metil-2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído (Figura 2B, passo c)
- Sob gás inerte (árgon), dissolve-se 1,45 g de 2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído, carbonato de potássio 0,996 g e 1,77 g de carbonato de dimetilo em 10 ml de dimetilformamida absoluta em um frasco de 50 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo.
- Agita-se a mistura a 130 ° C durante 19 h.
- Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida verter a mistura em gelo.
- Extrair a camada aquosa três vezes com 150 ml de acetato de etilo.
- Combinar as camadas orgânicas, lavá-las com água, secam-se com sulfato de sódio e eliminar o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
- Acoplamento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-Phe nil-1H-indol-3-il) vinil) iodeto quinolin-1-io (Figura 2B, passo d)
- Obra sob argsobre e sob exclusão de humidade. Dissolve-se 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io e 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído em 4 ml de etanol em um balão de 20 ml de fundo redondo equipado com condensador de refluxo.
- Adicionar 0,06 ml de piperidina e aquecer a 80 ° C durante 4 h.
- Deixa-se arrefecer para a TA.
- Recolhe-se o precipitado resultante por filtração e lava-se com éter dietílico três vezes.
- Adicionar éter dietílico para recolher o sobrenadante e o precipitado resultante por filtração. Lavar três vezes com éter dietílico.
- Combinar os precipitados.
- Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo a)
2. Síntese de cadeias de ADN
Nota: A síntese das cadeias de ADN é realizada utilizando o método de fosforamidite em fase sólida, como descrito por M. Caruthers 11 em um sintetizador de ADN. O funcionamento do sintetizador é testado antes do processo de síntese, e os reagentes são renovados senecessário.
- Prearrangements
- Dissolve-se o disponível comercialmente 2'-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) em 1,2 ml de diluente amidite (acetonitrilo extra-seco). Mova solução no frasco para um frasco de sintetizador e parafuso no sintetizador.
- Executar um "teste de vazamento" (de acordo com as instruções do fabricante) para se certificar de que não existe nenhuma fuga de gás argônio. Se o "teste de vazamento" falhar, parafuso no frasco com mais força.
- Primeiro a solução de Cu através do enchimento do tubo que liga a câmara de síntese em fase sólida.
- Lave todas as linhas com acetonitrilo.
- Síntese de cadeias de ADN
- Usar o computador conectado para entrar no método sequência de ADN e de acoplamento, seguindo as instruções do protocolo do fabricante. O passo de acoplamento do bloco de construção Cu leva 168 segundos com 7 pulsos (cada impulso são 16 ul) em comparação com 40 segundos com 7 pulsos para um convencionalfosforamidite como blocos de construção.
- Montar a coluna contendo o CPG (vidro de poro controlado) como fase sólida que é modificado com um umol de a primeira base (síntese de ADN é realizada a partir de 3 'para 5') para o sintetizador.
- Iniciar a síntese no sintetizador de ADN 11.
- A manipulação de cadeias de ADN sintetizados
- Secam-se as colunas com as cadeias de ADN sintetizada sob vácuo O / N.
- Utilize uma pinça para abrir a coluna e solte o CPG para um frasco de reacção. Adicionar 700 ul de solução de amónia aquosa concentrada para desproteger o oligonucleótido e libertar a cadeia de ADN a partir do CPG.
- Fechar o recipiente e aplicar uma tampa de segurança para o recipiente de reacção para evitar a sua ruptura e de calor a 50 ° C durante 18 h.
- Remover a amónia por centrifugação sob pressão reduzida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min.
- Iniciar filtração a partir de CPG: navio Centrifugar a 11.000 xg foR 3 min. Aqui sobrenadante e transferi-la para um dispositivo de centrifugação com um tamanho de poro de 0,45 um. Centrifugar a 1.000 g durante 4 min.
- Enquanto isso, adicionar 300 uL de água duplamente destilada para a CPG, de vórtice durante 20 segundos e centrifugar a 11000 xg durante 3 min. Transferir o sobrenadante para o dispositivo de centrifugação e centrifugar a 1000 x g durante 4 min. Repita este procedimento de lavagem duas vezes.
- Remover a água das soluções aquosas combinadas por centrifugação a 0,1 mbar e 25 ° CO / N.
3. Procedimento "Clicando"
- Adicionar 50 uL de água duplamente destilada, 25 jil de uma solução de ascorbato de sódio (0,4 M em água), 34 ul de tris - [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 H em DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ul de azida (0,01 M em DMSO / tBuOH 3: 1) e 17 ul de uma tetraquis () cobre (I), solução de hexafluorofosfato de acetonitrilo (0,1 M em DMSO / tBuOH 3: 1) para a amostra de ADN modificado com alcino liofilizada. Incubar a amostra a 60 ° C durante 1,5 h.
- Arrefecer attemperatura ambiente.
- Adicionar 150 ul de Na2EDTA (0,05 M em água) e 450 ul de acetato de sódio (0,3 M em água) à amostra de ADN e transferência para um tubo de 10 ml.
- Adicionar 10 ml de etanol (100%) e manter a -32 ° C durante 16 horas.
- embarcação Centrifugar durante 15 min a 1000 x g e remover o sobrenadante.
- Lavar ADN-pelete com 2 ml de etanol frio (80%).
- sedimento seco sob pressão reduzida.
Purificação 4. HPLC
Nota: Antes de separar as fitas de DNA se certificar de que o HPLC está funcionando corretamente, solvente suficiente disponível ea coluna está limpo. Lavar a coluna com tampão de concentração a partir de / acetonitrilo.
- Dissolve-se o ADN-pelete em bruto em 250 uL de água duplamente destilada e transferir para um frasco de HPLC.
- Iniciar Executar HPLC de 45 min com um gradiente de 0% de acetonitrilo até 15% de acetonitrilo durante um corante e um gradi ent de 0% de acetonitrilo a 17% de acetonitrilo para a tintura 2. Monitorar o funcionamento, verificando 260 nm (absorção DNA) e 459 nm (corante 1) ou 542 nm (corante 2). Recolhe-se as fracções que mostram absorção em ambos os canais de comprimento de onda.
- Verificar as fracções recolhidas para a direita por massa assistida por matriz de ionização de dessorção por laser (MALDI) A espectrometria de massa utilizando uma matriz que consiste em 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) e diammoniumhydrogencitrate.
- Preparar a matriz através da mistura de 900 ul de uma solução saturada de 3-HPA em 1: 1-mistura de acetonitrilo e água com 100 ul de uma solução diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) em água.
- Pipetar 1-2 ul da sonda de DNA no alvo e deixe secar ao ar.
- Adicionar 0,2 mL da matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate à amostra e misturar até que cristaliza.
- Execute espectrometria de massa MALDI.
- Combinar as fracções de HPLC que exibem a massa direita.
Nota: A concentração é determinada através da medição da absorção a 260 nm usando um UV / Vis, com base nos coeficientes de extinção (ε 260) das bases de ADN e o corante.
- Dissolve-se o ADN em 100 - 200 ul de água duplamente destilada.
- Aplicar 1 ul da solução de ADN no UV / VIS.
- Medir a absorção a 260 nm. Repita três vezes.
- Tomar o valor médio para o cálculo da concentração da solução. Para o cálculo dos coeficientes de extinção, utilizar ε 260nm das quatro bases naturais 12 e a 260 nm ε do Cu bloco de construção comprado (considerado como uridina natural) 12 para se obter a 260 nm ε de toda a cadeia de ADN. Para corante 1, o uso ε 260 nm = 10.200 L * mol -1 * cm -1 e para a tintura 2, o uso ε 260 nm = 13.100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Calcula-se a concentração da solução seguinte lei de Lambert-Beers com base nos coeficientes de extinção e absorvências medidas. 13
6. Preparação de amostras e espectroscopia
- Preparação de amostras de cadeia simples
- Preparar separadamente um ml de soluções 2,5 mM de cada um dos DNA1 modificado e DNA2 em NaCl 200 mM, NaP 50 mM de i, pH = 7.
- Preparação de amostras de cadeia dupla
- Prepare 1 ml de uma solução contendo 2,5 | iM de DNA1 e 2,5 uM de DNA2 em NaCl 200 mM, NaP 50 mM de i, pH = 7 num vaso de reacção.
- Fixar a tampa com uma tampa de segurança e de calor a 90 ° C durante 10 min. Em seguida, desligue aquecimento e deixar arrefecer até à RT O / N.
- espectroscopia de absorção
Nota: Para determinar o comprimento de onda de excitação para a especificação de fluorescênciaOs espectros de absorção troscopy são registados.- Medições de fita simples
- Grave uma medição em branco contendo apenas 200 mM de NaCl, NaP 50 mM i tampão, pH = 7.
- Transferir a solução preparada de DNA1 numa cuvete de 1 cm de vidro de quartzo e registar a absorção. Corrigir a medida contra os dados em branco. Determinar o valor máximo da absorção do corante.
- Repita o procedimento para DNA2.
- Medições de fita simples
- espectroscopia de fluorescência
- Medições de fita simples
- Grave uma medição em branco contendo NaCl a 200 mM, NaP 50 mM i tampão, pH = 7; usando o comprimento de onda de excitação do corante 1.
- Transferir a solução DNA1 numa cuvete de 1 cm de vidro de quartzo.
- Grave o espectro de fluorescência.
- Medição de fita dupla
- Transferir a solução de cadeia dupla numa cuvete de vidro de quartzo. Grave o espectro de fluorescência usando o comprimento de onda de excitação do corante 1.
- Medições de fita simples
- experiências de visualização
Cuidado: protecção ocular adequada deve ser usado para evitar danos UV para os olhos!- Para obter uma melhor compreensão do que os espectros registados estão mostrando, irradiam-se as tinas com lâmpadas UV portátil (Figura 5). Observe a mudança de cor de fluorescência a partir do individual para o DNA de cadeia dupla.
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Representative Results
Absorção e espectros de fluorescência do ADN de cadeia dupla e são registados como mostrado na Figura 4.
O espectro de absorção gravado (Figura 4 à direita) mostra a absorção maxima λ max a 465 nm para DNA1 de cadeia simples (dye 1) e 546 nm para DNA2 de cadeia simples (corante 2). O DNA1_2 recozido (corante corante 1 & 2) apresenta máximos a 469 nm e ambos 567 nm. Ambos máximos de absorção mostram um deslocamento batocrómico, 4 nm para o corante de 1 e 21 nm para o corante de 2. Estas pequenas alterações espectroscópicas são o resultado de interacções entre as excitônicas corantes dentro da arquitectura de dupla hélice de ADN.
Os espectros de fluorescência correspondente (Figura 4 esquerda) maxima exposição λ max, a 537 nm para DNA1 de cadeia simples (dye 1, excitação a 435 nm), a 607 nm para singleDNA2 -cordas (corante 2, excitação a 535 nm) e em 615 nm para DNA1_2 recozido (dye 1 & tingir 2, excitação a 435 nm). DNA1_2 mostra apenas o máximo de emissão de corante 2 embora corante 1 é selectivamente animado que evidencia que a transferência de energia ocorre de forma eficiente a partir de corante 1 para tingir 2. Isto dá uma taxa de contraste de emissão de 01:57.
A diferença entre a cadeia simples e dupla é evidente através da comparação da emissão de cor na cuvete durante a excitação com uma lâmpada UV padrão como mostrado na Figura 5.
Figura 1. conceito básico de uma transferência de energia no DNA. A cadeia de DNA doador modificado (verde) mostra a fluorescência a 535 nm após irradiação a 435 nm. Se ele é hibridado com o contador de cadeia modificada-aceitador (vermelho) do que resulta de cadeia dupla shows somente a fluorescência vermelha do corante aceitador a 610 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Síntese visão geral de corante um corante e 2. A síntese dos dois corantes cianina 1 (A) e 2 (B) é levada a cabo em três etapas consecutivas. 9 (a) a) 1,3-diiodopropane, CH3 NC, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) de K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropane, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 93%; c) K 2 CO 3, carbonato de dimetilo, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 h, 44%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Estrutura do bloco de construção de Cu 9, corantes 1 e 2 e as sequências de DNA1 e DNA2. Os corantes 1 e 2 estão ligados a posição 2 'da ribose por um ligante triazol dentro das sequências apresentadas e DNA2 de DNA1. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Fluorescência de cadeias de ADN cadeia simples e dupla (esquerda) e absorção de cadeias de ADN cadeia simples e dupla (à direita). espectros de emissão de DNA1 (preto) animado em 464 nm, DNA2 (vermelho), animado a 535 nm e 435 nm (rosa ), e híbridos DNA1_DNA2 (azul), excitado a 435 nm são mostradas. O espectro de absorção do DNA1 de cadeia simples (preto), DNA2 (vermelho), eo hibridizada DNA1_DNA2 fita dupla (azul) são mostrados no show do lado direito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. cor Emissão do DNA de cadeia simples com corante doador (esquerda) e DNA de cadeia dupla com doadores e corante aceitador (à direita) durante a excitação por uma lâmpada UV. A imagem do cadinho contendo o único DNA1 encalhado (LEFt lado) mostra fluorescência verde brilhante, ea imagem do DNA1_DNA2 cadeia dupla (lado direito) mostra fluorescência vermelha durante a excitação por uma lâmpada UV handheld a 366 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo mostra o procedimento completo para rotular DNA pós-sinteticamente através CuAAC por corantes fluorescentes modificados-azida. Isto inclui a síntese dos corantes e o ADN modificado com alcino, bem como o procedimento de marcação.
A síntese dos corantes seguintes quatro passos. Todos os produtos podem ser obtidos por uma precipitação em vez simples, devido à sua carga positiva e sem cromatografia em coluna demorado é necessária. A introdução das funcionalidades azida antes dos passos de acoplamento centrais encurta a síntese dos corantes de quatro em vez de cinco passos de reacção consecutivos. A aplicação de 1,3-diiodopropane em vez de 3-iodopropanol para o passo de alquilação, a reacção Appel e as seguintes reacções Finkelstein para converter a função hidroxilo nas funcionalidades iodo foram evitados. Estas alterações em comparação com os procedimentos publicados nos permitem sintetizar os corantes em escalas maiores e períodos de tempo mais curtos.
DNA1 é marcado por um corante, o corante dador e DNA2 por corante 2, o corante aceitador. Quando DNA1 e DNA2 são recozidos ambos os corantes entrar em estreita proximidade. Uma transferência eficiente de energia é observada quando corante 1 está animado. Em princípio, a interação excitônicas entre ambos os corantes podem interferir com uma transferência eficiente de energia uma vez que este processo requer a desacoplado e excitard corante 1 e desacoplado corante 2. Excitação dos corantes juntamente iniciaria diferentes vias fotofísicas. 14 Nossos estudos anteriores 9,15 revelou que o arranjo 3'-5'-diagonal aplicada de corantes fornece a base estrutural por apenas pequenas interações entre excitônicas os corantes e transferência de energia eficiente.
A elevada eficiência da transferência de energia de fluorescência demonstrou permite leitura precisa in vitro e in vivo. Isto oferece uma vasta gama de aplicações, incluindo a visualização de hibridação de ADN em beacons moleculares, a ligação de moléculas alvo em aptâmeros de ácidos nucleicos com base, bem como a visualização da integridade do pequeno ARN interferente (siRNA) no interior das células. A principal limitação é a exigência para rotular as duas cadeias de ADN. No futuro pretendemos focar o nosso trabalho no desenvolvimento de sondas de oligonucleotídeos duplamente marcada rolamento ambos os corantes em um fio.
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Acknowledgments
apoio financeiro por parte da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), o Research Training Grupo GRK 2039 (financiado pela DFG) e KIT é reconhecido agradecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
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