Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Syntese af bølgelængden-shifting DNA hybridiseringsprober ved hjælp fotostabile cyaninfarvestoffer

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54121
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology
* These authors contributed equally

Abstract

I denne protokol, viser vi en fremgangsmåde til syntese af 2'-alkyn modificeret deoxyribonukleinsyre (DNA) strenge ved automatiseret fastfasesyntese under anvendelse af standard phosphoramiditkemi. Oligonucleotider post-syntetisk mærket med to nye fotostabile cyaninfarvestoffer anvendelse af kobber-katalyseret click-kemi. Syntesen af ​​både donoren og acceptoren farvestof er beskrevet og udføres i tre på hinanden følgende trin. Med DNA som den omgivende arkitektur, disse to farvestoffer gennemgå en energioverførsel, når de bringes i tæt nærhed ved hybridisering. Derfor er annealing af to enkeltstrengede DNA-strenge visualiseret ved en ændring af fluorescens farve. Denne farveændring er kendetegnet ved fluorescensspektroskopi men kan også observeres direkte ved hjælp af en håndholdt ultraviolet (UV) lampe. Begrebet en dobbelt fluorescens farve udlæsning gør disse oligonukleotidprober fremragende værktøjer til molekylær billeddannelse, især når den beskrevne photostable farvestoffer anvendes. Derved fotoblegning af de billeddannende prober forhindres, og biologiske processer kan observeres i realtid i en længere tidsperiode.

Introduction

Molekylær billeddannelse er en grundlæggende teknik til at forstå biologiske processer i levende celler. 1-3 Udviklingen af fluorescerende nukleinsyre baserede prober til sådanne kemiske-biologiske applikationer er blevet en ekspanderende forskningsområde. Disse fluorescerende prober skal opfylde nogle krav for at blive egnede værktøjer til cell imaging. For det første bør de anvendte farvestoffer udviser fluorescens med høj kvante udbytter, stor Stokes 'skift og, vigtigst af alt, høje photostabilities at tillade langsigtet in vivo imaging. Og for det andet skal de vise en pålidelig fluorescens udlæsning. Konventionel kromofor-quencher-systemer er baseret på udlæsningen af en enkelt fluorescens farve ved simple ændringer i fluorescensintensiteter. 4 Denne model en risiko for falske positive eller falske negative resultater på grund af autofluorescens af intracellulære komponenter eller lave signal-til-støj-forhold på grund af uønsket quenching af andre comnenter. 4

Vi har for nylig rapporteret om begrebet "DNA trafiklys", der viser dobbelt fluorescens farve udlæsninger ved hjælp af to forskellige kromoforer. 5-6 Konceptet er baseret på energioverførsel (ET) fra donor farvestof til acceptor farvestof, som ændrer fluorescens farve (se figur 1). Dette giver en mere pålidelig udlæsning og dermed giver et kraftfuldt værktøj til fluorescerende billeddannelse sonder. Mærkning af oligonukleotider med fluorescerende farvestoffer kan opnås ved to forskellige fremgangsmåder. Farvestoffer kan inkorporeres under den kemiske DNA-syntese på en fast fase ved anvendelse af tilsvarende modificerede phosphoramidit byggesten. 7 Denne fremgangsmåde er begrænset til farvestoffer, der er stabilt under standard phosphoramidit og afbeskyttelsesbetingelser. Som et alternativ, blev post-syntetiske modifikation metodikker etableret i oligonukleotidkemi. Her demonstrerer vi syntesen af ​​en af ​​vores nye billedertabel energioverførsel par 8,9 og post-syntetisk mærkning af DNA ved hjælp af kobber-katalyseret 1,3-cycloaddition mellem azider og alkyner (CuAAC). 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i disse synteser er giftige og kræftfremkaldende. Brug venligst alle passende sikkerhedsforanstaltninger, der typisk kræves i organisk kemi laboratorier, såsom iført en kittel, beskyttelsesbriller og handsker.

1. Syntese af farvestofferne

Bemærk: Begge farvestoffer kan syntetiseres ved de samme typer af reaktion Figur 2 viser en oversigt over disse reaktioner..

  1. Syntese af 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium-iodid (farvestof 1)
    1. Syntese af 1- (3-iodpropyl) -4-methylpyridin-1-iumiodid (figur 2A, trin a)
      1. Opløs 466 mg 4-picolin og 5,91 g 1,3-diiodopropane i 10 ml acetonitril i en 20 ml headspace hætteglas og slutter tæt ved en skillevæg hætte.
      2. Opvarm til 85 ° C i 16 timer.
      3. Afkøles til stuetemperatur, derefter fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper.
      4. Der tilsættes 20 ml ethylacetat til den tilbageværende olie og behandle blandingen i et 120 W ultralydsbad i 3 min.
      5. Opsaml det dannede bundfald ved filtrering og vaskes fem gange med ethylacetat. Tør faste produkt under vakuum O / N.
    2. Syntese af 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium (figur 2A, trin b)
      1. Opløs 900 mg 1- (3-iodpropyl) -4-methylpyridin-1-iumiodid i 12 ml acetonitril i en 20 ml headspace hætteglas, tilsættes 376 mg natriumazid, og slutter tæt ved en septumhætte.
      2. Opvarm til 85 ° C i 16 timer.
      3. Afkøles til stuetemperatur, derefter fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper.
      4. Der tilsættes 15 ml dichlormethan til remanensen.
      5. Filter off og kassér det resulterende bundfald.
      6. Fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk ved anvendelse af en rotAry fordamper til opnåelse af produktet som en brun olie.
    3. Syntese af 1-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (figur 2A, trin c)
      1. Under inert gas (argon), opløses 1,45 g indol-3-carbaldehyd, 1,52 g kaliumcarbonat og 2,70 g dimethylcarbonat i 10 ml absolut dimethylformamid i en 50 ml rundbundet kolbe udstyret med en tilbagesvaler.
      2. Omrør blandingen ved 130 ° C i 19 timer.
      3. Lad afkøle til RT, så hæld blandingen på is.
      4. Det vandige lag ekstraheres tre gange med 150 ml ethylacetat.
      5. Kombiner de organiske lag, vask dem med vand, tør dem over natriumsulfat og opløsningsmidlet fjernes ved 50 ° C under reduceret tryk på en rotationsfordamper.
    4. Kobling til 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium-iodid (farvestof 1) (figur 2A, trin d)
      1. Arbejde under argon og under udelukkelse af fugtighed. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium og 48 mg 1-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd i 4 ml ethanol i en 20 ml rundbundet kolbe udstyret med en tilbagesvaler.
      2. Tilføj 0,07 ml piperidin og opvarmes til 80 ° C i 4 timer.
      3. Lad afkøle til stuetemperatur.
      4. Opsaml det fremkomne bundfald ved filtrering og vaskes tre gange med diethylether.
      5. Tilføj diethylether til supernatanten og indsamle det resulterende bundfald ved filtrering. Vaskes tre gange med diethylether.
      6. Kombiner præcipitaterne.
  2. Syntese af 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) quinolin-1-iumiodid (farvestof 2)
    1. Syntese af 1- (3-iodpropyl) -4-methylquinolin-1-iumiodid (figur 2B, trin a)
      1. Opløs 715 mg 4-methylquinolin og 5,91 g 1,3-diiodopropane i 10 ml acetonitril i en 20 ml headspace hætteglas og slutter tæt ved en skillevæg hætte.
      2. Varmetil 85 ° C i 16 timer.
      3. Afkøles til stuetemperatur, derefter fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper.
      4. Der tilsættes 20 ml ethylacetat til den tilbageværende olie og behandle blandingen i et 120 W ultralydsbad i 3 min.
      5. Opsaml det dannede bundfald ved filtrering og vaskes fem gange med ethylacetat. Tør faste produkt under vakuum O / N.
    2. Syntese af 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-ium (figur 2B, trin b)
      1. Opløs 900 mg 1- (3-iodpropyl) -4-methylquinolin-1-iumiodid i 12 ml acetonitril i en 20 ml headspace hætteglas, tilsættes 333 mg natriumazid, og slutter tæt ved en septumhætte.
      2. Opvarm til 85 ° C i 16 timer.
      3. Afkøles til stuetemperatur, derefter fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper.
      4. Der tilsættes 15 ml dichlormethan til remanensen.
      5. Filter off og kassér det resulterende bundfald.
      6. Fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk på en rotationsfordamper til opnåelse af produktet som en brun olie.
    3. Syntese af 1-methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd (figur 2B, trin c)
      1. Under inert gas (argon), opløses 1,45 g 2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd, 0,996 g kaliumcarbonat og 1,77 g dimethylcarbonat i 10 ml absolut dimethylformamid i en 50 ml rundbundet kolbe udstyret med en tilbagesvaler.
      2. Omrør blandingen ved 130 ° C i 19 timer.
      3. Lad afkøle til RT, så hæld blandingen på is.
      4. Det vandige lag ekstraheres tre gange med 150 ml ethylacetat.
      5. Kombiner de organiske lag, vask dem med vand, tør dem over natriumsulfat og opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk under anvendelse af rotationsfordamper.
    4. Kobling til 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phe carbonyl-1H-indol-3-yl) vinyl) quinolin-1-iumiodid (figur 2B, trin d)
      1. Arbejde under argpå og under udelukkelse af fugtighed. Opløs 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-ium og 59,7 mg 1-methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd i 4 ml ethanol i en 20 ml rundbundet kolbe udstyret med tilbagesvaler.
      2. Tilføj 0,06 ml piperidin og opvarmes til 80 ° C i 4 timer.
      3. Lad afkøle til stuetemperatur.
      4. Opsaml det fremkomne bundfald ved filtrering og vaskes med diethylether tre gange.
      5. Tilføj diethylether til supernatanten og indsamle det resulterende bundfald ved filtrering. Vaskes tre gange med diethylether.
      6. Kombiner præcipitaterne.

2. Syntese af DNA Strands

Bemærk: Syntesen af DNA-strengene udføres under anvendelse af phosphoramidit-metoden på en fast fase, som beskrevet af M. Caruthers 11 på en DNA synthesizer. Driften af ​​synthesizer testes før den syntetiske procedure, og reagenser forlænges, hvisnødvendig.

  1. Prearrangements
    1. Opløs den kommercielt tilgængelige 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) i 1,2 ml amidit fortyndingsmiddel (ekstra tør acetonitril). Flyt opløsning i hætteglasset til en synthesizer hætteglas og skrue ind synthesizer.
    2. Udfør en "lækage test" (i henhold til producentens anvisninger) for at sikre, at ingen argon gaslækage eksisterer. Hvis "lækage test" mislykkes, skrue i hætteglasset mere stramt.
    3. Prime Cu opløsning ved fyldning af røret, der forbinder til fastfasesyntese kammer.
    4. Vask alle linjer med acetonitril.
  2. Syntese af DNA-strenge
    1. Brug den tilsluttede computer til at indtaste DNA-sekvensen og koblingsmetode, følge anvisningerne fra producentens protokol. Koblingstrinnet CU byggesten tager 168 sekunder med 7 pulser (hver impuls er 16 pi) sammenlignet med 40 sek med 7 pulser for en konventionelphosphoramidit som byggesten.
    2. Monter kolonne indeholdende CPG (kontrolleret poreglas) som fast fase, som er modificeret med 1 pmol af den første base (DNA-syntese udføres ud fra 3 'til 5') ind i synthesizeren.
    3. Start syntese på DNA synthesizer 11.
  3. Oparbejdning af syntetiserede DNA-strenge
    1. Tør kolonner med de syntetiserede DNA-strenge under vakuum O / N.
    2. Brug en tang til at åbne kolonnen og frigive CPG i en reaktion hætteglas. Tilføj 700 pi koncentreret vandig ammoniakopløsning at afbeskytte oligonukleotidet og frigøre DNA-strengen fra CPG.
    3. Luk hætteglasset og anvende en sikkerhed låg på reaktionsbeholderen for at forhindre at den brister, og opvarm til 50 ° C i 18 timer.
    4. Fjern ammoniak ved centrifugering under reduceret tryk (100 mbar) ved 30 ° C i 30 minutter.
    5. Start filtrering fra CPG: Centrifuge fartøj på 11.000 xg foR 3 min. Tag supernatant og overføre den til en centrifugal anordning med en porestørrelse på 0,45 um. Centrifuger ved 1.000 xg i 4 min.
    6. I mellemtiden tilsættes 300 pi dobbelt destilleret vand til CPG, vortex i 20 sekunder og centrifugeres ved 11.000 xg i 3 min. Supernatanten overføres til Centrifugeindretning og centrifugeres ved 1.000 xg i 4 min. Gentag denne vaskes yderligere to gange.
    7. Fjern vandet fra de kombinerede vandige opløsninger ved centrifugering ved 0,1 mbar og 25 ° CO / N.

3. "klikker" Procedure

  1. Tilsæt 50 pi dobbeltdestilleret vand, 25 pi af en natriumascorbatopløsning (0,4 M i vand), 34 pi tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (0,1 M i DMSO / tBuOH 3: 1), 114 pi af azidet (0,01 M i DMSO / tBuOH 3: 1) og 17 pi af en tetrakis (acetonitril) kobber (i) hexafluorphosphat opløsning (0,1 M i DMSO / tBuOH 3: 1) til lyofiliserede alkyn-modificeret DNA-prøve. Prøven inkuberes ved 60 ° C i 1,5 timer.
  2. Der afkøles til stuetemperatur.
  3. Tilsæt 150 pi Na2EDTA (0,05 M i vand) og 450 pi natriumacetat (0,3 M i vand) til DNA prøve og overføres til en 10 ml rør.
  4. Tilsæt 10 ml ethanol (100%), og holde ved -32 ° C i 16 timer.
  5. Centrifuge fartøj i 15 minutter ved 1.000 xg og fjern supernatanten.
  6. Vask DNA-pellet med 2 ml kold ethanol (80%).
  7. Tør pellet under reduceret tryk.

4. HPLC Oprensning

Bemærk: Før adskille DNA-strengene sørge for, at HPLC fungerer korrekt, nok opløsningsmiddel er til rådighed, og kolonnen er ren. Skyl kolonnen med startkoncentrationen af ​​puffer / acetonitril.

  1. Opløs det rå DNA-pellet i 250 pi dobbeltdestilleret vand og overføres til et HPLC hætteglas.
  2. Start HPLC køre af 45 min med en gradient af 0% acetonitril til 15% acetonitril for farvestof 1 og en gradi ent på 0% acetonitril til 17% acetonitril for farvestof 2. Overvåg løb ved at kontrollere 260 nm (DNA absorption) og 459 nm (farvestof 1) eller 542 nm (farvestof 2). Opsaml de fraktioner, der viser absorption i begge bølgelængdekanaler.
  3. Tjek de opsamlede fraktioner til højre masse ved maldi (MALDI) massespektrometri under anvendelse af en matrix bestående af 3-hydroxypicolinsyre (3HPA) og diammoniumhydrogencitrate.
    1. Forbered matrixen ved at blande 900 pi af en mættet 3-HPA opløsning i 1: 1-blanding af acetonitril og vand med 100 pi af en diammoniumhydrogencitrate opløsning (100 g / l) i vand.
    2. Pipette 1-2 pi af DNA-proben på målet og lad det tørre på luft.
    3. Tilsæt 0,2 pi af 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matrix til prøven og bland indtil det krystalliserer.
    4. Udføre MALDI-massespektrometri.
    5. Kombinere disse HPLC-fraktioner, der udviser den rigtige masse.
_title "> 5. Bestemmelse af koncentration

Bemærk: Koncentrationen bestemmes ved at måle absorptionen ved 260 nm ved anvendelse af et UV / Vis-spektrofotometer, baseret på ekstinktionskoefficienter (ε 260) af DNA-baser og farvestoffet.

  1. Opløs DNA i 100 - 200 pi dobbeltdestilleret vand.
  2. Påfør 1 pi af DNA-opløsningen på UV / Vis spektrofotometer.
  3. Mål absorptionen ved 260 nm. Gentag tre gange.
  4. Tag den gennemsnitlige værdi at beregne koncentrationen af ​​opløsningen. Ved beregning af de ekstinktionskoefficienter, bruge ε 260 nm af de fire naturlige baser 12 og ε 260 nm af den købte byggeklods Cu (betragtes som naturlige uridin) 12 for at opnå den ε 260 nm af hele DNA-streng. For farvestof 1, brug ε 260 nm = 10.200 L * mol -1 * cm-1 og farvestof 2, brug ε 260 nm = 13.100 L * mol <sup> -1 * cm-1. Beregn koncentrationen af opløsningen efter Lambert-Beers 'lov baseret på ekstinktionskoefficienter og målte absorbanser. 13

6. Prøveforberedelse og spektroskopi

  1. Udarbejdelse af enkelte streng prøver
    1. Forbered separat 1 ml 2,5 uM opløsninger af hver af de modificerede DNA1 og DNA2 i 200 mM NaCl, 50 mM NaPi, pH = 7.
  2. Fremstilling af dobbeltstrengede prøver
    1. Forbered 1 ml af en opløsning indeholdende 2,5 uM DNA1 og 2,5 uM af DNA2 i 200 mM NaCl, 50 mM NaPi, pH = 7 i en reaktionsbeholder.
    2. Fastgør låget med en sikkerhedshætte og varme til 90 ° C i 10 min. Sluk derefter varme og lad det køle ned til RT O / N.
  3. absorptionsspektroskopi
    Bemærk: For at bestemme excitation bølgelængde for fluorescens spectroscopy absorptionsspektre registreres.
    1. Enkelt streng målinger
      1. Optage en blank måling, der kun indeholder 200 mM NaCl, 50 mM NaPi, pH = 7.
      2. Overfør den fremstillede opløsning af DNA1 i en 1 cm kvarts glas kuvette og registrere absorptionen. Ret målingen mod de tomme data. Bestem den maksimale værdi af farvestof absorptionen.
      3. Gentag for DNA2.
  4. fluorescensspektroskopi
    1. Enkelt streng målinger
      1. Optage en blank måling, der kun indeholder 200 mM NaCl, 50 mM NaPi, pH = 7; hjælp excitationsbølgelængden af ​​farvestof 1.
      2. Overfør DNA1 opløsning i en 1 cm kvarts glas kuvette.
      3. Optag fluorescensspektret.
    2. Dobbeltstreng måling
      1. Overfør dobbeltstrengen opløsning i en kvartsglas kuvette. Optag fluorescensspektret hjælp excitationsbølgelængden af ​​farvestof 1.
  5. Visualisering eksperimenter
    Forsigtig: Passende øjenbeskyttelse skal bæres for at undgå UV-skader på øjnene!
    1. For at få en bedre forståelse af, hvad de optagne spektre viser, bestråle kuvetterne med håndholdt UV-lamper (figur 5). Overhold ændringen i fluorescens farve fra single til dobbeltstrenget DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Absorption og fluorescens spektre af enkelt- og dobbeltstrenget DNA, registreres som vist i figur 4.

Den indspillede absorptionsspektre (figur 4 til højre) viser absorptionsmaksima λ max ved 465 nm for enkeltstrenget DNA1 (farvestof 1) og 546 nm for enkeltstrenget DNA2 (farvestof 2). Det annealede DNA1_2 (farvestof 1 & farvestof 2) viser maksima ved både 469 nm og 567 nm. Både absorptionsmaksima viser en bathochromic skift, 4 nm for farvestof 1 og 21 nm for farvestof 2. Disse små spektroskopiske ændringer er resultatet af excitonic interaktioner mellem farvestofferne i dobbelt-helix DNA-arkitektur.

Den tilsvarende fluorescens spektre (figur 4 til venstre) udviser maksima λ max på 537 nm for enkeltstrenget DNA1 (farvestof 1, excitation ved 435 nm), ved 607 nm for enkelt-stranded DNA2 (farvestof 2, excitation ved 535 nm) og ved 615 nm for udglødet DNA1_2 (farvestof 1 & farvestof 2, excitation ved 435 nm). DNA1_2 viser udelukkende maksimum udledningen af ​​farvestof 2 selvom farvestof 1 er selektivt begejstret hvoraf det klart fremgår, at den energi overdragelsen finder sted effektivt fra farvestof 1 til farvning 2. Dette giver en emission kontrast på 01:57.

Forskellen mellem enkelt og dobbelt streng er indlysende ved at sammenligne emissionen farve i kuvetten under excitation med en standard UV-lampe, som vist i figur 5.

figur 1
Figur 1. Grundlæggende begrebet energioverførsel i DNA. Donoren modificerede DNA-streng (grøn) viser fluorescens ved 535 nm ved bestråling ved 435 nm. Hvis den er hybridiseret med acceptor-modificerede counter streng (rød) den resulterende dobbeltstreng shows kun den røde fluorescens af acceptor farvestof ved 610 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Syntese oversigt over farvestof 1 og farvestof 2. Syntesen af to cyaninfarvestoffer 1 (A) og 2 (B) udføres i tre på hinanden følgende trin. 9 (A) a) 1,3-diiodopropane, CH3 CN, 85 ° C, 16 timer, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 timer, 87%; c) K 2 CO 3, dimethylcarbonat, DMF, 130 ° C, 19 timer, 89%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 timer, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropane, CH3CN, 85 ° C, 16 timer, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 timer, 93%; c) K 2 CO 3, dimethylcarbonat, DMF, 130 ° C, 19 timer, 98%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 timer, 44%. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Struktur af CU-byggesten, farvestoffer 1 og 2 og sekvenser af DNA1 og DNA2. Farvestofferne 1 og 2 er knyttet til 2-stillingen af ribosen med en triazol linker inden for de givne sekvenser af DNA1 og DNA2. 9 klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Fluorescence af enkelt og dobbelt strandede DNA-strenge (til venstre) og absorption af enkelt og dobbelt strandede DNA-strenge (til højre). Emission spektre af DNA1 (sort) ophidset ved 464 nm, DNA2 (rød), ophidset ved 535 nm og 435 nm (lyserød ), og DNA1_DNA2 hybrid (blå), anslået ved 435 nm er vist. Absorptionen spektre af det enkeltstrengede DNA1 (sort), DNA2 (rød), og den hybridiserede dobbelt streng DNA1_DNA2 (blå) er vist på højre side show. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Emission farve den enkeltstrengede DNA med donorfarvestof (venstre) og dobbeltstrenget DNA med donor og acceptor-farvestof (til højre) under excitation af en UV-lampe. Billedet af kuvetten indeholdende det enkeltstrengede DNA1 (left side) viser lyse grøn fluorescens, og billedet af dobbeltstrenget DNA1_DNA2 (højre side) viser rød fluorescens under excitation af en håndholdt UV-lampe ved 366 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol viser den fuldstændige procedure til at mærke DNA post-syntetisk via CuAAC af azid-modificerede fluorescerende farvestoffer. Dette omfatter syntesen af ​​farvestofferne og alkyn-modificeret DNA samt proceduren mærkning.

Syntesen af ​​farvestofferne følger fire trin. Alle produkter kan opnås ved en ret simpel udfældning på grund af deres positive ladning og der kræves ikke tidskrævende søjlekromatografi. Indførelsen af ​​azidet funktionaliteter ved den centrale koblingstrin forkorter synteserne af farvestofferne til fire i stedet for fem på hinanden følgende reaktionstrin. Anvendelsen af ​​1,3-diiodopropane stedet for 3-iodopropanol til alkylering trin er Appel reaktion og de følgende Finkelstein reaktioner til omdannelse hydroxylfunktionen ind iod funktionaliteter blev undgået. Disse ændringer i sammenligning med de publicerede procedurer tillader os at syntetisere farvestofferne i større skalaer og kortere tidsrum.

(f.eks afbeskyttelse med kaliumcarbonat). Dette udgør en væsentligt dyrere alternativ og kræver syntesen af ​​de tilsvarende dye-modificerede phosphoramiditer som DNA byggesten eller mærkning på den faste bærer (on-bead).

DNA1 er mærket med farvestof 1, donorfarvestoffet, og DNA2 ved farvestof 2, den acceptor-farvestof. Når DNA1 og DNA2 anneales begge farvestoffer komme i tæt nærhed. observeres En effektiv energioverførsel, når farvestof 1 er begejstret. I princippet kan excitonic samspil mellem begge farvestoffer forstyrre en effektiv energioverførsel, da sidstnævnte proces kræver frakoblet og begejstred farvestof 1 og ukoblet farvestof 2. excitation af de koblede farvestoffer ville initiere forskellige fotofysiske pathways. 14 Vores tidligere undersøgelser 9,15 afsløret, at den anvendte 3'-5'-diagonal arrangement af farvestoffer tilvejebringer den strukturelle basis for kun lidt excitonic interaktioner mellem farvestofferne og effektiv energioverførsel.

Den høje effektivitet af den påviste energioverførsel muliggør nøjagtig fluorescens udlæsning i in vitro- og in vivo forsøg. Dette giver en lang række applikationer, herunder visualisering af DNA-hybridisering i molekylære beacons, binding af målmolekylerne i nukleinsyrebaserede aptamerer samt visualisering af integriteten af ​​små interfererende RNA (siRNA) i celler. Den største begrænsning er kravet til at mærke begge DNA-strenge. I fremtiden vil vi fokusere vores arbejde på udvikling af dobbelt mærkede oligonukleotidprober bærer begge farvestoffer i en streng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Økonomisk støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), Research Training Group GRK 2039 (finansieret af DFG) og KIT er taknemmeligt anerkendt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
synthesis
4-Picoline Sigma Aldrich 239615
1,3-Diiodopropane Sigma Aldrich 238414
Acetonitrile Fisher Scientific 10660131 HPLC grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10456870 technical grade
Sodium azide Sigma Aldrich 71290 p.a. grade
Dichloromethane Fisher Scientific 10626642 technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98% ABCR AB112969
Potassium carbonate, 99+% Acros 424081000
dimethylcarbonate Sigma Aldrich 517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve Acros 348435000
Sodium sulfate Bernd Kraft 12623.46
Ethanol, 99.5% Acros 397690010
Piperidine, 99% Acros 147181000
Diethylether Fisher Scientific 10407830 technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% ABCR AB125050
4-Methylquinoline ABCR AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer Applied Biosystems  -
DMT-dA(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich A111081
DMT-dT Phosphoramidite Sigma Aldrich T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite Sigma Aldrich G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma Aldrich L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis Sigma Aldrich L010400
Cap A Sigma Aldrich L840000
Cap B Sigma Aldrich L850000
CPG dT Column 1.0 µmole Proligo Reagents T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole Proligo Reagents G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents C461010
ammonia (aqueous solution)  Fluka Analytical 318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm Pall ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) Sigma Aldrich 75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite Chem Genes ANP-7754
workup
vacuum concentrator Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate Sigma Aldrich 346276
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich A7631
EDTA disodium salt Sigma Aldrich E5134
TBTA-ligand  -  - synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer Bruker Daltonics
LC-318 C18 column Supelcosil via Sigma Aldrich 58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio Varian
Fluoromax-3 fluorimeter Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

Tags

Molekylærbiologi oligonukleotider energioverførsel fluorescens klik-kemi farvestoffer fotostabilt
Syntese af bølgelængden-shifting DNA hybridiseringsprober ved hjælp fotostabile cyaninfarvestoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arndt, S., Walter, H. K.,… More

Arndt, S., Walter, H. K., Wagenknecht, H. A. Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes. J. Vis. Exp. (113), e54121, doi:10.3791/54121 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter