Abstract
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتركيب 2'-آلكاين تعديل النووي الريبي منقوص الأكسجين حامض (DNA) خيوط من قبل الآلي توليف المرحلة الصلبة باستخدام الكيمياء phosphoramidite القياسية. وصفت [أليغنوكليوتيد ما بعد صناعي من قبل اثنين من cyanine الأصباغ صامد جديدة باستخدام المحفز النحاس النقر الكيمياء. ووصف تركيب كل من الجهات المانحة ومتقبل صبغ ويتم تنفيذ في ثلاث خطوات متتالية. مع الحمض النووي كما أن الهيكل المحيطة بها، وهذه الأصباغ اثنين من الخضوع لنقل الطاقة عندما يتم تقديمهم الى مقربة من التهجين. لذلك، هو تصور الصلب اثنين واحد جدائل الحمض النووي تقطعت بهم السبل بسبب تغيير اللون مضان. يتميز هذا التغيير اللون عن طريق التحليل الطيفي مضان ولكن يمكن أيضا أن نلاحظ مباشرة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة (الأشعة فوق البنفسجية). مفهوم مزدوج قراءات اللون مضان يجعل هذه التحقيقات النوكليوتيد أدوات ممتازة للتصوير الجزيئي خصوصا عندما هواتف وصفهوتستخدم الأصباغ tostable. وبالتالي، يتم منع photobleaching من لتحقيقات التصوير، والعمليات البيولوجية يمكن ملاحظتها في الوقت الحقيقي لفترة زمنية أطول.
Introduction
يمثل التصوير الجزيئي تقنية أساسية لفهم العمليات البيولوجية داخل الخلايا الحية. 1-3 تطوير تحقيقات الفلورسنت الحمض النووي على أساس لمثل هذه التطبيقات الكيميائية البيولوجية أصبح حقل البحوث التوسع. وتحتاج هذه تحقيقات الفلورسنت لتلبية بعض المتطلبات لتصبح أدوات مناسبة لتصوير الخلايا. أولا، يجب أن الأصباغ تطبيقها تظهر مضان ذات العوائد العالية الكم، والتحولات الكبيرة ستوكس، والأهم من ذلك، photostabilities مرتفعة للسماح طويلة الأجل في مجال التصوير الجسم الحي. وثانيا، ينبغي أن تظهر قراءات مضان يمكن الاعتماد عليها. وتعتمد أنظمة حامل اللون-فاكهه تقضي التقليدية على قراءات من لون مضان واحد عن طريق تغييرات بسيطة في كثافة مضان. 4 هذا النهج يحمل خطر من النتائج السلبية الإيجابية أو كاذبة كاذبة بسبب تألق ذاتي من مكونات داخل الخلايا أو انخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التبريد غير مرغوب فيه من قبل شركات أخرى لponents 4
بلغنا مؤخرا على مفهوم "إشارات المرور الحمض النووي" التي تظهر مزدوجة قراءات اللون مضان باستخدام اثنين من حاملات مختلفة. 5-6 ويستند مفهوم على نقل الطاقة (ET) من الصبغة المانحة إلى صبغ متقبل الذي يتغير مضان اللون (انظر الشكل 1). هذا يسمح للقراءات أكثر موثوقية، وبالتالي يوفر أداة قوية لتحقيقات التصوير الفلورسنت. وضع البطاقات التعريفية على أليغنوكليوتيد مع الأصباغ الفلورية يمكن أن يتحقق من خلال نهجين مختلفين. ويمكن إدراج الأصباغ خلال توليف الحمض النووي الكيميائي في مرحلة الصلبة باستخدام كتل بناء phosphoramidite تعديل تبعا لذلك. 7 يقتصر هذا الأسلوب إلى الأصباغ التي هي مستقرة في ظل phosphoramidite وdeprotection الظروف القياسية. وكبديل لذلك، تم إنشاء منهجيات تعديل آخر الاصطناعية في الكيمياء النوكليوتيد. هنا، علينا أن نظهر تركيب واحدة من الصور الجديدةالطاقة الجدول نقل أزواج 8،9 ووضع العلامات آخر الاصطناعية من الحمض النووي باستخدام المحفز النحاس 1،3-cycloaddition بين أزيدات والألكاينات (CuAAC). 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبيه: يرجى التشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه التوليفات سامة ومسرطنة. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة التي تكون مطلوبة عادة في مختبرات الكيمياء العضوية، مثل ارتداء معطف المختبر، والنظارات الواقية والقفازات.
1. توليف للأصباغ
ملاحظة: كل من الأصباغ يمكن توليفها من قبل نفس أنواع من ردود الفعل ويبين الشكل 2 لمحة عامة عن هذه التفاعلات.
- توليف 1- (3 azidopropyl) -4- (2- (1-ميثيل-1H إندول-3-YL) الفينيل) pyridin-1-البوتاسيوم يوديد (صبغ 1)
- توليف 1- (3 iodopropyl) -4-methylpyridin-1-البوتاسيوم يوديد (الشكل 2A، خطوة أ)
- حل 466 ملغ 4 بيكولين و5.91 ز 1،3-diiodopropane في 10 مل من الأسيتونتريل في 20 مل فراغ الرأس قارورة وختم بإحكام بغطاء الحاجز.
- الحرارة إلى 85 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- السماح لتبرد لRT، ثم إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر استداري.
- إضافة 20 مل من خلات الإيثيل إلى النفط المتبقي وعلاج الخليط في 120 حمام بالموجات فوق الصوتية W لمدة 3 دقائق.
- جمع يعجل شكلت عن طريق الترشيح وغسل خمس مرات مع خلات الإيثيل. تجفيف المنتجات الصلبة في ظل فراغ O / N.
- توليف 1- (3 azidopropyl) -4-methylpyridin-1-البوتاسيوم (الشكل 2A، خطوة ب)
- حل 900 ملغ 1- (3 iodopropyl) يوديد -4-methylpyridin-1-البوتاسيوم في 12 مل من الأسيتونتريل في 20 مل فراغ الرأس القارورة، إضافة 376 ملغ من أزيد الصوديوم، وختم بإحكام بغطاء الحاجز.
- الحرارة إلى 85 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- السماح لتبرد لRT، ثم إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار.
- إضافة 15 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى بقايا.
- تصفية الخروج والتخلص من الرواسب الناتجة عن ذلك.
- إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام تعفنالمبخر آرى للحصول على المنتج والنفط البني.
- توليف 1-ميثيل-1H-الإندول-3-carbaldehyde (الشكل 2A، خطوة ج)
- تحت غاز خامل (الأرجون)، ويحل 1.45 ز الإندول-3-carbaldehyde، 1.52 جم كربونات البوتاسيوم و2.70 غرام ثنائي ميثيل الكربونات في 10 مل ثنائي ميثيل الفورماميد المطلق في 50 مل قارورة مجهزة المكثف الراجع جولة القاع.
- يحرك الخليط في 130 درجة مئوية لمدة 19 ساعة.
- السماح لتبرد لRT، ثم يصب الخليط على الجليد.
- استخراج طبقة المائية ثلاث مرات مع خلات الإيثيل 150 مل.
- الجمع بين الطبقات العضوية، وغسلها بالماء، وتجفيفها على كبريتات الصوديوم وإزالة المذيب عند 50 درجة مئوية تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار.
- اقتران 1- (3 azidopropyl) -4- (2- (1-ميثيل-1H إندول-3-YL) الفينيل) pyridin-1-البوتاسيوم يوديد (صبغ 1) (الشكل 2A، خطوة د)
- العمل تحت الأرجون وتحت استبعاد الرطوبة. Dissolلقد 90 ملغ 1- (3 azidopropyl) -4-methylpyridin-1-البوتاسيوم و 48 ملغ 1-ميثيل-1H-الإندول-3-carbaldehyde في 4 مل ايثانول في 20 مل قارورة مجهزة المكثف الراجع جولة القاع.
- إضافة 0.07 مل تأكسد والحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- السماح لتبرد لRT.
- جمع راسب الناتج عن طريق الترشيح ويغسل ثلاث مرات مع ثنائي إيثيل الإيثر.
- إضافة إلى ثنائي إيثيل الإيثر طاف وجمع راسب الناتج عن طريق الترشيح. يغسل ثلاث مرات مع ثنائي إيثيل الإيثر.
- الجمع بين رواسب.
- توليف 1- (3 iodopropyl) -4-methylpyridin-1-البوتاسيوم يوديد (الشكل 2A، خطوة أ)
- توليف 1- (3 azidopropyl) -4- (2- (1-ميثيل-2-فينيل-1H إندول-3-YL) الفينيل) quinolin-1-البوتاسيوم يوديد (صبغ 2)
- توليف 1- (3 iodopropyl) -4-methylquinolin-1-البوتاسيوم يوديد (الشكل 2B، خطوة أ)
- حل 715 ملغ 4-ميثيل كينولين و5.91 ز 1،3-diiodopropane في 10 مل من الأسيتونتريل في 20 مل فراغ الرأس قارورة وختم بإحكام بغطاء الحاجز.
- حرارةإلى 85 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- السماح لتبرد لRT، ثم إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار.
- إضافة 20 مل من خلات الإيثيل إلى الزيت المتبقي وعلاج الخليط في 120 حمام بالموجات فوق الصوتية W لمدة 3 دقائق.
- جمع يعجل شكلت عن طريق الترشيح وغسل خمس مرات مع خلات الإيثيل. تجفيف المنتجات الصلبة في ظل فراغ O / N.
- توليف 1- (3 azidopropyl) -4-methylquinolin-1-البوتاسيوم (الشكل 2B، خطوة ب)
- حل 900 ملغ 1- (3 iodopropyl) يوديد -4-methylquinolin-1-البوتاسيوم في 12 مل من الأسيتونتريل في 20 مل فراغ الرأس القارورة، إضافة 333 ملغ من أزيد الصوديوم، وختم بإحكام بغطاء الحاجز.
- الحرارة إلى 85 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- السماح لتبرد لRT، ثم إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار.
- إضافة 15 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى بقايا.
- تصفية الخروج والتخلص من الرواسب الناتجة عن ذلك.
- إزالة ش المذيباتالتانجو خفض الضغط باستخدام المبخر الدوار للحصول على المنتج من النفط البني.
- توليف 1-ميثيل-2-فينيل-1H-الإندول-3-carbaldehyde (الشكل 2B، خطوة ج)
- تحت غاز خامل (الأرجون)، ويحل 1.45 ز 2-فينيل-1H-الإندول-3-carbaldehyde، 0،996 جم كربونات البوتاسيوم و1.77 غرام ثنائي ميثيل الكربونات في 10 مل ثنائي ميثيل الفورماميد المطلق في 50 مل قارورة مجهزة المكثف الراجع جولة القاع.
- يحرك الخليط في 130 درجة مئوية لمدة 19 ساعة.
- السماح لتبرد لRT، ثم يصب الخليط على الجليد.
- استخراج طبقة المائية ثلاث مرات مع خلات الإيثيل 150 مل.
- الجمع بين الطبقات العضوية، وغسلها بالماء، وتجفيفها على كبريتات الصوديوم وإزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار.
- اقتران 1- (3 azidopropyl) -4- (2- (1-ميثيل-2-PHE NYL-1H إندول-3-YL) الفينيل) يوديد quinolin-1-البوتاسيوم (الشكل 2B، خطوة د)
- العمل تحت ARGعلى وتحت استبعاد الرطوبة. حل 90 ملغ 1- (3 azidopropyl) -4-methylquinolin-1-البوتاسيوم و 59.7 ملغ 1-ميثيل-2-فينيل-1H-الإندول-3-carbaldehyde في 4 مل ايثانول في 20 مل قارورة جولة القاع-مجهزة المكثف الراجع.
- إضافة 0.06 مل تأكسد والحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- السماح لتبرد لRT.
- جمع راسب الناتج عن طريق الترشيح ويغسل مع ثنائي إيثيل الإيثر ثلاث مرات.
- إضافة إلى ثنائي إيثيل الإيثر طاف وجمع راسب الناتج عن طريق الترشيح. يغسل ثلاث مرات مع ثنائي إيثيل الإيثر.
- الجمع بين رواسب.
- توليف 1- (3 iodopropyl) -4-methylquinolin-1-البوتاسيوم يوديد (الشكل 2B، خطوة أ)
2. توليف الحمض النووي السواحل
ملاحظة: تجميع للحمض النووي ونفذت باستخدام طريقة phosphoramidite على المرحلة الصلبة، كما وصفها محمد Caruthers 11 على المزج الحمض النووي. يتم اختبار أداء المزج قبل إجراء الاصطناعية، ويتم تجديد الكواشف إذاضروري.
- Prearrangements
- حل متاح تجاريا 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (CU) في 1.2 مل من مخفف amidite (الأسيتونتريل خارج الجاف). نقل الحل في قارورة إلى قارورة المزج والمسمار في المزج.
- إجراء "اختبار تسرب" (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) للتأكد من عدم وجود تسرب للغاز الأرجون موجودا. إذا فشل "اختبار تسرب"، المسمار في القارورة أكثر إحكاما.
- رئيس الحل مكعب عن طريق ملء الأنبوب الذي يصل إلى غرفة تخليق المرحلة الصلبة.
- غسل جميع الخطوط مع الأسيتونتريل.
- تخليق حمض النووي
- استخدام جهاز كمبيوتر متصل لدخول تسلسل الحمض النووي واقتران الطريقة، وبعد مطالبات من بروتوكول الشركة المصنعة. الخطوة اقتران لبنة النحاس يأخذ 168 ثانية مع 7 البقول (كل نبضة و16 ميكرولتر) مقابل 40 ثانية مع 7 البقول لالتقليديةphosphoramidite لبنات البناء.
- تركيب العمود الذي يحتوي على الدليل السياسي الشامل (التي يسيطر الزجاج المسام)، والمرحلة الصلبة التي يتم تعديلها مع 1 مكرومول القاعدة الأولى (يتم تنفيذ توليف الحمض النووي من 3 'إلى 5') في المزج.
- بدء تركيب على المزج الحمض النووي (11).
- Workup من خيوط الحمض النووي توليفها
- تجفيف الأعمدة مع حمض النووي توليفها في ظل فراغ O / N.
- استخدام كماشة لفتح العمود والافراج عن الحكومة الشعبية المركزية في قارورة التفاعل. إضافة 700 ميكرولتر من محلول الأمونيا المركز المائي لdeprotect قليل النوكليوتيد والافراج عن الحمض النووي حبلا من الحكومة الشعبية المركزية.
- إغلاق القارورة وتطبيق غطاء الأمن على وعاء التفاعل لمنعها من الانفجار، والحرارة إلى 50 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- إزالة الأمونيا عن طريق الطرد المركزي تحت ضغط منخفض (100 مليبار) عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بدء الترشيح من CPG: سفينة الطرد المركزي في 11000 x ج فوص 3 دقائق. اتخاذ طاف وتحويلها إلى جهاز الطرد المركزي مع حجم المسام 0.45 ميكرون. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 4 دقائق.
- وفي الوقت نفسه إضافة 300 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى الحكومة الشعبية المركزية، دوامة لمدة 20 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 3 دقائق. نقل طاف في جهاز الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 4 دقائق. كرر هذا الإجراء الغسيل مرتين.
- إزالة المياه من المحاليل المائية المشتركة بواسطة الطرد المركزي عند 0.1 مللي بار و 25 درجة CO / N.
3. "النقر" الإجراءات
- إضافة 50 ميكرولتر الماء المقطر على نحو مضاعف، 25 ميكرولتر من حل أسكوربات الصوديوم (0.4 M في الماء)، 34 ميكرولتر تريس - [(1-البنزيل-1H-1،2،3-triazol-4-YL) الميثيل] أمين (0.1 M في DMSO / tBuOH 3: 1)، 114 ميكرولتر من أزيد (0.01 M في DMSO / tBuOH 3: 1)، و 17 ميكرولتر من tetrakis (الأسيتونتريل) النحاس (I) حل hexafluorophosphate (0.1 M في DMSO / tBuOH 3: 1) إلى مجفف بالتجميد المعدلة آلكاين عينة من الحمض النووي. احتضان العينة على 60 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
- بارد لRT.
- إضافة 150 ميكرولتر نا 2 EDTA (0.05 M في الماء) و 450 خلات الصوديوم ميكرولتر (0.3 M في الماء) لعينة من الحمض النووي ونقل إلى أنبوب 10 مل.
- إضافة 10 مل ايثانول (100٪) والحفاظ على -32 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- سفينة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1000 x ج وإزالة طاف.
- غسل الحمض النووي بيليه مع 2 مل ايثانول البارد (80٪).
- بيليه الجافة تحت ضغط منخفض.
4. HPLC تنقية
ملاحظة: قبل فصل حمض النووي تأكد من أن HPLC يعمل بشكل صحيح، ما يكفي من المذيبات متاحة والعمود نظيفة. شطف العمود مع تركيز بدءا من العازلة / الأسيتونتريل.
- حل الخام الحمض النووي بيليه في 250 ميكرولتر من الماء المقطر مضاعفة، ونقل إلى قارورة HPLC.
- بدء تشغيل HPLC من 45 دقيقة مع التدرج من 0٪ الأسيتونتريل إلى 15٪ من الأسيتونتريل لصبغ 1 وغرادي والأنف والحنجرة من 0٪ الأسيتونتريل إلى 17٪ من الأسيتونتريل لصبغ 2. رصد المدى عن طريق فحص 260 نانومتر (امتصاص الحمض النووي) و 459 نانومتر (صبغ 1) أو 542 نانومتر (صبغ 2). جمع تلك الكسور التي تظهر امتصاص في كل قنوات الطول الموجي.
- تحقق الكسور التي جمعت لكتلة اليمين التي كتبها matrix بمساعدة الليزر الامتزاز التأين (MALDI) مطياف الكتلة باستخدام مصفوفة تتكون من 3 hydroxypicolinic حمض (3HPA) وdiammoniumhydrogencitrate.
- إعداد مصفوفة عن طريق خلط 900 ميكرولتر من محلول 3-HPA المشبعة في 1: 1 خليط من الأسيتونتريل والمياه مع 100 ميكرولتر من حل diammoniumhydrogencitrate (100 غرام / لتر) في الماء.
- ماصة 1-2 ميكرولتر من التحقيق الحمض النووي على الهدف واتركها لتجف في الهواء.
- إضافة 0.2 ميكرولتر من المصفوفة 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate لعينة وتخلط حتى يبلور.
- أداء مطياف الكتلة MALDI.
- الجمع بين تلك الكسور HPLC الذي يحمل كتلة اليمين.
ملاحظة: يتم تحديد تركيز من خلال قياس امتصاص عند 260 نانومتر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية / فيس طيفي، استنادا إلى معاملات الانقراض (ε 260) من قواعد الحمض النووي وصبغ.
- حل الحمض النووي في 100-200 ميكرولتر المقطر مضاعف المياه.
- تطبيق 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي على الأشعة فوق البنفسجية / فيس معمل.
- قياس امتصاص عند 260 نانومتر. كرر ثلاث مرات.
- أخذ متوسط قيمة لحساب تركيز المحلول. لحساب معاملات الانقراض، استخدم ε 260nm القواعد الطبيعية الأربعة 12 و260nm ε من النحاس بناء كتلة المشتراة (تعتبر يوريدين الطبيعي) 12 للحصول على 260nm ε من الحمض النووي حبلا كله. لصبغ 1، استخدام ε 260nm = 10200 L * مول -1 * سم -1 ولصبغ 2، استخدام ε 260nm = 13100 L * مول <سوب> -1 * سم -1. حساب تركيز المحلول التالية قانون لامبرت-بيرز على أساس معامل الانقراض والامتصاصية قياس 13
6. تحضير العينة والتحليل الطيفي
- إعداد عينات حبلا واحدة
- إعداد منفصل 1 مل من 2.5 ميكرومتر الحلول من كل من DNA1 المعدلة وDNA2 في 200 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي قيلولة ط العازلة، ودرجة الحموضة = 7.
- إعداد عينات حبلا مزدوجة
- إعداد 1 مل من محلول يحتوي على 2.5 ميكرومتر من DNA1 و 2.5 ميكرومتر من DNA2 في 200 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي قيلولة ط العازلة، ودرجة الحموضة = 7 في وعاء التفاعل.
- تأمين غطاء مع غطاء سلامة والحرارة إلى 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم إيقاف التدفئة والسماح لتبرد لRT O / N.
- طيف الامتصاص
ملاحظة: لتحديد الطول الموجي الإثارة لالمواصفات مضانوتسجل أطياف امتصاص troscopy.- قياسات حبلا واحدة
- تسجيل قياس فارغ لا يحتوي إلا على 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي قيلولة ط العازلة، ودرجة الحموضة = 7.
- نقل الحل استعداد للDNA1 إلى 1 سم كوفيت زجاج الكوارتز وتسجيل الاستيعاب. تصحيح القياس على بيانات فارغة. تحديد الحد الأقصى لقيمة امتصاص الصبغة.
- كرر DNA2.
- قياسات حبلا واحدة
- مضان الطيفي
- قياسات حبلا واحدة
- تسجيل قياس فارغ لا يحتوي إلا على 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي قيلولة ط العازلة، ودرجة الحموضة = 7؛ باستخدام الطول الموجي الإثارة من صبغ 1.
- نقل الحل DNA1 إلى 1 سم كوفيت زجاج الكوارتز.
- تسجيل الطيف مضان.
- قياس حبلا مزدوج
- نقل الحل حبلا مزدوج في كوفيت زجاج الكوارتز. تسجيل الطيف مضان باستخدام الطول الموجي الإثارة من صبغ 1.
- قياسات حبلا واحدة
- تجارب التصور
تحذير: يجب ارتداء حماية العين المناسبة لتجنب أضرار الأشعة فوق البنفسجية إلى العينين!- للحصول على فهم أفضل لما أطياف سجلت تظهر، أشرق cuvettes مع المحمولة للأشعة فوق البنفسجية مصابيح (الشكل 5). لاحظ التغير في اللون مضان من واحد إلى الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتسجل امتصاص ومضان أطياف من الحمض النووي مفردة ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل كما هو مبين في الشكل (4).
أطياف الامتصاص سجلت (الشكل 4 يمين) تظهر امتصاص ماكسيما λ كحد أقصى في 465 نانومتر لDNA1 احد الذين تقطعت بهم السبل (صبغ 1) و 546 نانومتر للDNA2 احد الذين تقطعت بهم السبل (صبغ 2). وDNA1_2 صلب (صبغ 1 & صبغ 2) يدل على ماكسيما في كل 469 نانومتر و 567 نانومتر. كلا امتصاص ماكسيما تظهر تحولا bathochromic، 4 نانومتر لصبغ 1 و 21 نانومتر لصبغ 2. هذه التغيرات الطيفية صغيرة هي نتيجة تفاعلات excitonic بين الأصباغ داخل بنية الحمض النووي المزدوج حلزونية.
أطياف مضان المقابلة (الشكل 4 اليسار) معرض ماكسيما λ كحد أقصى، في 537 نانومتر لDNA1 احد الذين تقطعت بهم السبل (صبغ 1، الإثارة في 435 نانومتر)، في 607 نانومتر لاحدDNA2 -stranded (صبغ 2، الإثارة في 535 نانومتر) وفي 615 نانومتر لDNA1_2 صلب (صبغ 1 & 2 صبغ، الإثارة في 435 نانومتر). يظهر DNA1_2 فقط الحد الأقصى للانبعاثات من صبغ 2 على الرغم من الصبغة 1 هو انتقائي متحمس الذي يثبت أن نقل الطاقة يحدث بكفاءة من صبغ 1 إلى صبغ 2. وهذا يعطي نسبة تباين انبعاث 01:57.
الفرق بين ضفيرة واحدة ومزدوجة واضح من خلال مقارنة لون الانبعاثات في كفيت خلال الإثارة مع معيار الأشعة فوق البنفسجية مصباح كما هو مبين في الشكل (5).
الشكل 1. المفاهيم الأساسية لنقل الطاقة في الحمض النووي. المتبرع تعديل حبلا الحمض النووي (الأخضر) يظهر مضان في 535 نانومتر على التشعيع في 435 نانومتر. إذا تم تهجين مع حبلا مكافحة تعديل متقبل (الحمراء) الناتج المزدوج حبلا الصورةهاوس فقط مضان أحمر الصبغة متقبل في 610 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ويتم تجميع محة عامة عن صبغ 1 و صبغ 2. تركيب اثنين cyanine الأصباغ 1 (أ) و 2 (ب) في ثلاث خطوات متتالية. 9 (أ) أ) 1،3-diiodopropane، CH 3 CN، 85 ° C، 16 ساعة، 94٪، ب) نان 3، CH 3 CN، 85 ° C، 16 ساعة، 87٪، ج) K 2 CO 3، كربونات ثنائي ميثيل، DMF، 130 ° C، 19 ساعة، 89٪، د) تأكسد، ETOH، 80 ° C، 4 ساعات، 80٪. (ب) أ) 1،3-diiodopropane، CH 3 CN، 85 ° C، 16 ساعة، 49٪، ب) نان 3، CH 3 CN، 85 ° C، 16 ساعة، 93٪، ج) K 2 CO 3، كربونات ثنائي ميثيل، DMF، 130 ° C، 19 ساعة، 98٪، د) تأكسد، ETOH، 80 ° C، 4 ساعات، 44٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. هيكل بنة النحاس، الأصباغ 1 و 2 و تسلسل DNA1 وDNA2. الأصباغ 1 و 2 ترتبط موقف 2 'من الريبوز من قبل رابط التريازول ضمن تسلسل معين من DNA1 وDNA2 9 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. فلووrescence من خيوط الدنا المفردة والمزدوجة (يسار) وامتصاص حمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مفردة ومزدوجة (يمين). الانبعاث أطياف DNA1 (أسود) متحمس في 464 نانومتر، DNA2 (الحمراء)، متحمس في 535 نانومتر و 435 نانومتر (الوردي )، وترد DNA1_DNA2 الهجين (الأزرق)، متحمس في 435 نانومتر. وتظهر أطياف امتصاص DNA1 احد الذين تقطعت بهم السبل (أسود)، DNA2 (الحمراء)، وتهجين DNA1_DNA2 حبلا مزدوجة (الأزرق) على العرض الجانب الأيمن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. اللون الانبعاثات من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مع الصبغة المانحة (يسار) والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل مع الجهات المانحة وصبغ متقبل (يمين) خلال الإثارة عن طريق الأشعة فوق البنفسجية مصباح. صورة كفيت يحتوي على DNA1 الذين تقطعت بهم السبل واحد (LEFر الجانب) يظهر مخضر مشرق، وصورة DNA1_DNA2 المزدوج تقطعت بهم السبل (الجانب الأيمن) تبين مضان أحمر أثناء الإثارة من قبل المحمولة الأشعة فوق البنفسجية مصباح في 366 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويظهر هذا البروتوكول الإجراء الكامل لتسمية الحمض النووي بعد صناعي عبر CuAAC بواسطة الأصباغ الفلورية المعدلة أزيد. وهذا يشمل تركيب الأصباغ والحمض النووي المعدلة آلكاين فضلا عن إجراءات وضع العلامات.
تركيب الأصباغ يتبع أربع خطوات. جميع المنتجات التي يمكن الحصول عليها من قبل هطول الأمطار بسيطة إلى حد ما بسبب شحنة موجبة، وليس هناك حاجة إلى تستغرق وقتا طويلا العمود اللوني. إدخال وظائف أزيد قبل الخطوات اقتران المركزية يقصر توليفات من الأصباغ إلى أربعة بدلا من خمس خطوات رد فعل على التوالي. وتجنب تطبيق 1،3-diiodopropane بدلا من 3 iodopropanol للخطوة الألكلة، رد فعل ابيل وردود الفعل فنكلستين التالية لتحويل وظيفة الهيدروكسيل إلى وظائف يودو. هذه التغييرات بالمقارنة مع الإجراءات المنشورة تسمح لنا لتجميع الأصباغ في نطاقات أوسع وفترات زمنية أقصر.
الطبقة = "jove_content"> والأصباغ تطبيق المعرض على صمود ممتاز ولكن ليس الاستقرار اللازم خلال المرحلة الصلبة توليف الحمض النووي وworkup. وبالتالي، تم اختيار استراتيجية العلامات بعد الاصطناعية. بدلا من ذلك، وضع العلامات مع هذه الأصباغ الثمينة خلال توليف الحمض النووي يمثل فائقة خفيفة اقتران وdeprotection الشروط (على سبيل المثال، deprotection مع كربونات البوتاسيوم). ويمثل هذا البديل بشكل ملحوظ أكثر تكلفة ويتطلب تركيب المقابلة phosphoramidites المعدلة صبغ لبنات بناء DNA أو وضع العلامات على دعم قوي (على حبة).
وصفت DNA1 صباغة 1، وصبغ المانحة، وDNA2 صباغة 2، وصبغ متقبل. عندما يتم مطوع DNA1 وDNA2 كل من الأصباغ ندخل مقربة. ويلاحظ على نقل كفاءة في استخدام الطاقة عند متحمس صبغ 1. من حيث المبدأ، والتفاعل excitonic بين كل من الأصباغ قد تتداخل مع نقل الطاقة بكفاءة منذ العملية الأخيرة تتطلب. فصل وتثيرأن د صبغ (1) وفكت صبغ 2. الإثارة من الأصباغ إلى جانب بدء مسارات بالفوتونات مختلفة. 14 دراساتنا السابقة 9،15 كشفت أن يطبق ترتيب 3'-5'-قطري الأصباغ يوفر الأساس الهيكلي للتفاعل excitonic قليلا فقط بين الأصباغ ونقل كفاءة في استخدام الطاقة.
كفاءة عالية في نقل الطاقة أثبتت تمكن قراءات مضان الدقيق في في التجارب المختبرية والتجارب المجراة. هذا يقدم مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك التصور من تهجين الحمض النووي في منارات الجزيئية وملزمة من الجزيئات المستهدفة في الأبتامرات النووية حمض أساس فضلا عن التصور للسلامة الصغيرة RNA التدخل (سيرنا) داخل الخلايا. الحد الرئيسي هو شرط لتسمية كل من جدائل الحمض النووي. في المستقبل ونحن نهدف إلى التركيز عملنا على تطوير تحقيقات قليل النوكليوتيد المسمى مضاعف تحمل كل من الأصباغ في حبلا واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الدعم المالي من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG، وا 1386 / 17-1)، والتدريب البحثي المجموعة GRK 2039 (التي تمولها DFG) وKIT ما قدمه من مساعدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I.
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
