Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54121
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology
* These authors contributed equally

Abstract

Bu protokol, 2'-alkin sentezi için bir yöntem olup, standart fosforamidit kimyası kullanılarak otomatik katı faz sentezi ile deoksiribonükleik asit (DNA) ipliklerini modifiye göstermektedir. Oligonükleotidler sonrası sentetik bakır katalize tıklama kimyası kullanılarak iki yeni ışığa siyanin boyalar ile etiketlenir. Her iki verici ve alıcı boya sentezi tarif edilir ve art arda üç aşamada gerçekleştirilir. Onlar melezleme yoluyla yakın getirildiğinde çevreleyen mimari DNA ile, bu iki boyalar bir enerji transferi uğrar. Bu nedenle, iki tek zincirli DNA şeritlerin tavlama flüoresan renk değişikliği ile görüntülenir. Bu renk değişimi, flüoresan spektroskopisi ile karakterize değil, aynı zamanda, doğrudan bir el ultraviyole (UV) lambası kullanılarak gözlemlenebilir. Çift floresan renk okuma kavramı bu oligonükleotid probları moleküler görüntüleme, özellikle açıklanan pho için mükemmel araçlar yapartostable boyalar kullanılır. Böylece, görüntüleme sondaları ışıkla ağartma önlenir ve biyolojik işlemler daha uzun bir zaman süresi için, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Introduction

Moleküler görüntüleme canlı hücrelerin içinde biyolojik süreçleri anlamak için temel bir tekniktir. 1-3 gibi kimyasal-biyolojik uygulamalar için floresan nükleik asit bazlı prob geliştirilmesi genişleyen bir araştırma alanı haline gelmiştir. Bu floresan sondalar hücre görüntüleme için uygun araçlar haline birkaç gereksinimlerini karşılamak gerekir. İlk olarak, uygulanan boya yüksek kuantum verimleri ile floresan sergilemelidir büyük Stokes kaymalar ve en önemlisi, yüksek photostabilities in vivo görüntüleme uzun süreli izin vermek. Ve ikincisi, onlar güvenilir bir floresan okuma göstermelidir. Konvansiyonel kromofor-söndürücü sistemler floresan yoğunlukları basit değişikliklerle tek bir floresan renk okuma dayanmaktadır. 4 Bu yaklaşım nedeniyle hücre içi bileşenleri veya düşük sinyal-gürültü oranları otofloresansı yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçların riskini taşımaktadır nedeniyle diğer com tarafından istenmeyen soğutulması içinTüm unsurların. 4

Biz son zamanlarda iki farklı kromoforlar kullanarak ikili floresan renk okumalarını gösteriyor "DNA trafik ışıkları" kavramına bildirildi. 5-6 kavramı floresan değiştirir alıcı boyasına donör boya enerji transferi (ET) dayanmaktadır renk (Şekil 1). Bu daha güvenli bir okuma sağlar ve bu şekilde flüoresan görüntüleme sondaları için güçlü bir araç sunar. floresan boyalar ile oligonükleotid Etiketleme iki farklı yaklaşım ile elde edilebilir. Boyalar mukabil değiştirilmiş fosforamidit yapı taşları kullanılarak bir katı faz üzerinde, kimyasal DNA sentezi sırasında dahil edilebilir. 7, bu yöntem, standart fosforamidit ve koruma kaldırma koşulları altında stabil olan boyalar ile sınırlıdır. Bir alternatif olarak, sentez sonrasında modifikasyon yöntemleri oligonükleotid kimyasında kurulmuştur. Burada, bizim yeni Fotoğrafların birinde sentezini göstermekmasa enerji transferi çiftleri 8,9 ve azidler ve alkinlere (CuAAC) arasındaki bakır katalize 1,3-sikloadisyon kullanılarak DNA'nın sonrası sentetik etiketleme. 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli zehirli ve kanserojendir. tipik olarak, bir laboratuvar önlüğü giyen emniyet gözlükleri ve eldiven gibi organik kimya laboratuvarlarında, gerekli olan tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın.

Boyaların 1. Sentezi

. Her iki boya da reaksiyonun aynı türleri tarafından sentezlenebilir 2 Bu reaksiyonların genel bir görünüşünü göstermektedir, Şekil Not:.

  1. 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1)
    1. 1- (3-iyodopropil) -4-metilpiridin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2A, aşama a)
      1. Eritin 466 mg kadar 4-pikolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın.
      2. 16 saat boyunca 85 ° C'ye ısıtın.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Geriye kalan yağa etil asetat ve 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi.
      5. süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun.
    2. 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum sentezi (Şekil 2A, Aşama B)
      1. 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metilpiridin-1-yum iyodür eritin sodyum azid 376 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın.
      2. 16 saat boyunca 85 ° C'ye ısıtın.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin.
      5. süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın.
      6. Bir çürümeyi kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarınli evaporatör kahverengi bir yağ olarak ürün elde edildi.
    3. 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2A, Aşama c) '
      1. atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g indol-3-karbaldehid, 1.52 g potasyum karbonat ve 2.70 g dimetil karbonat çözülür.
      2. 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir.
      4. Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin.
      5. Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında 50 ° C'de çözücüyü çıkarın.
    4. Kavrama 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1) (Şekil 2A, Aşama D)
      1. argon altında ve nem dahil edilmeden çalışır. DissolBir geri akış yoğunlaştırıcısı ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 20 ml 4 mi etanol içinde 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum ve 48 mg 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid ve.
      2. 4 saat 80 ° C'de 0.07 ml piperidin ve ısıtılır.
      3. Oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      4. süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın.
      5. Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın.
      6. çökeltiler birleştirin.
  2. 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (boya 2)
    1. 1- (3-iyodopropil) -4-metilkuinolin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2B, aşama a)
      1. Eritin 715 mg kadar 4-metilkinolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın.
      2. Sıcaklık16 saat boyunca 85 ° C arasındadır.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Geri kalan yağ, etil asetat ile 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi.
      5. süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun.
    2. 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum sentezi (Şekil 2B, adım b)
      1. 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metılkuınolın-1-yum iyodür eritin sodyum azid 333 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın.
      2. 16 saat boyunca 85 ° C'ye ısıtın.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin.
      5. süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın.
      6. Solvent u kaldırnder kahverengi bir yağ olarak ürünü elde etmek üzere bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç.
    3. 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2B, Aşama C)
      1. atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g 2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid, 0.996 g potasyum karbonat ve 1.77 g dimetil karbonat çözülür.
      2. 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir.
      4. Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin.
      5. Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın.
    4. 1- (3-azidopropil) bağlanmak -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (Şekil 2B, adım d) '
      1. arg altında çalışmave nem dahil edilmeden. yuvarlak dipli şişe ile donatılmış bir 20 ml, 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum ve 59.7 mg 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid 4 mi etanol içinde çözülür geri akış kondansatörü.
      2. 4 saat 80 ° C'de 0.06 ml piperidin ve ısıtılır.
      3. Oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      4. süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın.
      5. Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın.
      6. çökeltiler birleştirin.

DNA Strands 2. Sentezi

Not: bir DNA sentezleyicisi üzerinde M. Caruthers 11 tarafından tarif edildiği gibi, DNA şerit sentezi, bir katı faz üzerinde fosforamidit yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. synthesizer işleyişi sentetik işlem öncesi test edilir ve reaktif ise yenilenengerekli.

  1. Prearrangements
    1. amidite seyreltici (ekstra kuru asetonitril) 1.2 ml ticari olarak temin 2'-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) içinde çözülür. Bir sentezleyici flakon şişe içinde çözüm getirin ve synthesizer içine vida.
    2. Hiçbir argon gazı sızıntısı var olduğundan emin olmak için (üreticinin talimatlarına göre) bir "sızıntı testi" gerçekleştirin. "Sızıntı testi" başarısız olursa, daha sıkı şişede sıkın.
    3. Katı Faz Sentez odasına bağlayan tüp doldurarak Başbakan Cu çözüm.
    4. asetonitril ile tüm satırları yıkayın.
  2. DNA iplikçikleri sentezi
    1. Üreticinin protokolden istemleri takip DNA dizisi ve bağlantı yöntemi girmek bağlı bilgisayar kullanın. cu yapı bloğunun birleştirme aşaması geleneksel 7 darbeleri ile 40 sn ile karşılaştırıldığında (her darbe 16 ul olan) 7 darbeleri ile 168 saniye süreryapı taşları olarak fosforamidit.
    2. İlk taban 1 umol değiştirilmiş katı faz olarak CPG (kontrollü gözenekli cam) ihtiva eden bir sütun monte synthesizer (DNA sentezi 5 '' 3 ila gerçekleştirilir).
    3. DNA sentezleyici 11 sentezi başlar.
  3. Sentezlenen DNA iplikçiklerinin Çalıştırma
    1. Vakum O / N altında sentezlenen DNA ipliklerini içeren sütunlar kurutun.
    2. sütun açıp bir reaksiyon şişenin içine CPG serbest bırakmak için bir pense kullanın. oligonükleotid korumasını kaldırmak ve CpG DNA teli serbest bırakmak için konsantre edilmiş sulu amonyak çözeltisi 700 ul ekle.
    3. 18 saat 50 ° C'ye kadar şişeyi kapatın ve patlama önlemek için, reaksiyon kabı üzerinde bir güvenlik kapağı uygulanır ve ısı.
    4. 30 dakika boyunca 30 ° C'de indirgenmiş basınç altında (100 mbar) altında santrifüjleme ile amonyağın ayrılması.
    5. CPG gelen filtrasyon başlatın: Santrifüj gemi 11.000 xg fo atR3 Min. üstteki sıvı kısmı alınır ve 0.45 um'lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir santrifüj cihazının içine aktarın. 4 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
    6. Bu sırada 3 dakika boyunca 11.000 x g'de 20 saniye ve santrifüj CpG, girdaba iki kez damıtılmış suyun 300 ul ekle. 4 dakika boyunca 1.000 xg'de santrifüj cihazı ve santrifüj içine süpernatant aktarın. iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın.
    7. 0,1 mbar ve 25 ° CO / H santrifüj Birleştirilen sulu çözeltilerden su çıkarın.

3. "tıklamak" Prosedür

  1. (0.1 [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin - 50 ul iki kez damıtılmış su, sodyum askorbat çözeltisi 25 ul (su içinde 0.4 M), 34 | il Tris ekleme DMSO içinde M / tBuOH 3: azid 1), 114 ul (0.01 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) ve bir tetrakis 17 ul (asetonitril) bakır (I) heksaflorofosfat çözeltisi (0.1 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) liyofilize alkin ile modifiye edilmiş DNA örneğine. 1.5 saat boyunca 60 ° C 'de örnek inkübe edin.
  2. Oda sıcaklığına soğutun.
  3. 150 ul Na2EDTA (su içinde 0.05 M) ve 10 ml'lik bir tüp DNA numunesi ve transfer 450 ul sodyum asetat (su içinde 0.3 M) eklenir.
  4. 10 mi etanol (% 100) ilave edin ve 16 saat boyunca -32 ° C'de saklayın.
  5. 15 1000 xg'de dk ve süpernatant kaldırmak için santrifüj gemi.
  6. 2 ml soğuk etanol (% 80) ile DNA pelletini yıkayın.
  7. indirgenmiş basınç altında kuru pelet.

4. HPLC saflaştırma

Not: ayrılmadan önce DNA ipliklerini HPLC düzgün çalıştığından emin olun, yeterli çözücü mevcuttur ve sütun temiz. tampon / asetonitril başlangıç ​​konsantrasyonu ile sütun durulayın.

  1. HPLC şişeye iki defa damıtılmış su ve transfer 250 ul Ham DNA pelet çözülür.
  2. boya 1 ve Gradi asetonitril% 15% 0 asetonitril gradyanı ile 45 dakika HPLC çalıştırmak Başlangıç boya 2. asetonitril 17% 0 ile% asetonitril ent 260 nm (DNA emme) ve 459 nm (boya 1) veya 542 nm (boya 2) kontrol ederek koşmak izleyin. Her iki dalga boyu kanalları emilmesini gösteren fraksiyonların toplayın.
  3. 3-Hidroksipikolinik asit (3HPA) ve diammoniumhydrogencitrate oluşan bir matris kullanılarak matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi ile şu kütlesi toplanan fraksiyonları edin.
    1. su içinde diammoniumhydrogencitrate çözeltisi (100 g / L), 100 ul asetonitril ve su 1: 1 kanşımı olarak doymuş 3-HPA solüsyonu 900 ul karıştırılarak matrisi hazırlayın.
    2. hedef DNA prob 1-2 ul pipet ve hava kurumaya bırakın.
    3. örnek 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matris 0.2 ul ekleyin ve kristalleşir kadar karıştırın.
    4. MALDI kütle spektrometresi gerçekleştirin.
    5. Doğru kitle sergileyen HPLC kesirler birleştirin.
Konsantrasyon _title "> 5. Belirlenmesi

Not: konsantrasyonu DNA bazları ve boya yok olma katsayıları (260 ε) göre, bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de emilimin ölçülmesiyle belirlenir.

  1. çift ​​damıtılmış su, 200 ul - 100 DNA çözülür.
  2. UV / Vis spektrofotometre DNA solüsyonu 1 ul uygulayın.
  3. 260 nm'de emme ölçün. üç kez tekrarlayın.
  4. çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak için, ortalama değer alır. Yok olma katsayılarının hesaplanmasında, bütün DNA ipliğinin ε 260nm elde etmek için dört doğal bazlar 12 ε 260nm ve (doğal üridin olarak kabul edilir) satın alınan yapı bloğu CU ε 260nm 12 kullanın. Boya 1, kullanım ε 260nm = 10200 L * mol -1 * cm-1 ve boya 2, kullanım ε 260nm = 13100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Yok olma katsayıları ve ölçülen absorbans dayalı Lambert-Beers 'hukuk aşağıdaki çözeltisinin konsantrasyonu hesaplayın. 13

6. Numune Hazırlama ve Spektroskopi

  1. Tek iplikli örneklerinin hazırlanması
    1. 200 mM NaCl, 50 mM NADP tampon içinde tadil edilmiş DNA1 ve DNA2 her 2.5 uM çözeltilerinin ayrı ayrı 1 mi, pH = 7 hazırlayın.
  2. Çift iplikli örneklerinin hazırlanması
    1. Bir reaksiyon kabı içinde, 200 mM NaCI, 50 mM NADP i tampon maddesi, pH = 7 DNA2 2,5 DNA1 uM ve 2.5 uM ihtiva eden bir çözelti, 1 ml hazırlayın.
    2. 10 dakika boyunca 90 ° C'ye kadar güvenli bir kap ve ısı ile kapağı elde edin. Sonra ısıtma kapatın ve RT O / N soğumaya bırakın.
  3. absorpsiyon spektroskopisi
    Not: floresan spec için dalgaboyu belirlemek içinSpektroskopisi absorpsiyon spektrumları kaydedilir.
    1. Tek iplikli ölçümleri
      1. 200 mM NaCI, 50 mM NADP i tampon maddesi, pH = 7 ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedilir.
      2. 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 hazırlanmış çözeltisini ve emilimi kaydedin. Boş veri karşı ölçümü düzeltin. boya emilimi maksimum değerini belirler.
      3. DNA2 için tekrarlayın.
  4. floresans spektroskopisi
    1. Tek iplikli ölçümleri
      1. 200 mM NaCI, I tampon, 50 mM NADP ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedin, pH = 7; boya 1 eksitasyon dalga boyu kullanılarak.
      2. 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 çözeltisini.
      3. floresan spektrumu kaydedin.
    2. Çift iplikli ölçümü
      1. Bir kuvars cam küvet içinde çift iplikli çözüm aktarın. boya 1 dalgaboyu kullanılarak floresan spektrumu kaydedin.
  5. görselleştirme deneyleri
    Dikkat: Uygun göz koruması Gözleri UV hasarını önlemek için giyilmelidir!
    1. Kaydedilen spektrumları gösteriyor ne daha iyi bir anlayışa el UV lambaları (Şekil 5) ile küvetler ışın tedavisi için. çift ​​sarmallı DNA'ya tek floresan renk değişikliği dikkat edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 4'te gösterildiği gibi, tek ve çift sarmallı DNA emme ve floresan spektrumu kaydedilir.

Kaydedilen absorpsiyon spektrumları (Şekil 4, sağ) tek şeritli DNA1 (boya 1) ve tek şeritli DNA2 (boya 2) için 546 nm 465 nm dalga boyunda göster emme maksimumları λ maks. Tavlanmış DNA1_2 (boya 1 ve boya 2) 469 nm ve 567 nm hem de maksimumu gösterir. Her iki absorpsiyon bir batokromik vardiya, boya 1 4 nm ve bu küçük spektroskopik değişiklikleri, çift sarmal DNA mimarisi içinde boyalar arasındaki Eksitonik etkileşimlerin sonucu boya 2 için 21 nm göstermektedir.

Tek 607 nm'de gelen floresans spektrumları tek şeritli DNA1 (boya 1, 435 nm'de uyarma) için 537 nm'de (sol Şekil 4) sergiler maksimumları λ max,-stranded DNA2 (boya 2, 535 nm'de uyanm) ve tavlanmış DNA1_2 615 nm'de (boya 1 ve 435 nm 'de 2, uyarma boya). boya 1 enerji transferi Bu 1:57 bir emisyon kontrast oranı veren 2. boya boya 1'den verimli oluştuğunu kanıtlar olan seçici heyecanlı olmasına rağmen DNA1_2 sadece boya 2 emisyon maksimum gösterir.

Şekil 5'de gösterildiği gibi, tek ve çift sarmallı arasındaki fark standart bir UV-lambası ile uyarılması sırasında küvet içinde emisyon rengi karşılaştırarak açıktır.

Şekil 1
DNA'da bir enerji transferi Şekil 1. Temel kavram. Donör değiştirilmiş DNA zincir (yeşil) 435 nm'de ışınlama üzerine 535 nm'de floresan gösterir. o alıcı modifiye sayaç strand (kırmızı) ortaya çıkan çift iplikli s ile hibridize edilirse610 nm'de alıcı boya sadece kırmızı floresan hows. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Sentez boya 1, boya 2. İki siyanin boyaları 1 (A) 'nın sentezi ve 2 (B)' nin genel arka arkaya üç adımda gerçekleştirilir. 9 (A) a) 1,3-diiyodoprodan, CH3 CN, 85 ° C, 16 saat,% 94; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 saat,% 87; c) K 2 CO 3, dimetil karbonat, DMF, 130 ° C, 19 saat,% 89; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 saat,% 80. (B) a) 1,3-Diiyodopropan, CH3CN, 85 ° C, 16 saat,% 49; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 saat,% 93; c) K 2 CO 3, dimetil karbonat, DMF, 130 ° C, 19 saat,% 98; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 saat,% 44. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Cu-yapı bloğunun Şekil 3. Yapı, boyalar 1 ve 2 ve DNA1 ve DNA2 dizileri. 1 ve 2 DNA1 ve DNA2 verilen sekansları içinde bir triazol bağlayıcı ile riboz, 2 'pozisyonunda bağlı boyalar. 9 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Flutek ve çift sarmallı DNA ipliklerini (solda) ve tek ve çift sarmallı DNA ipliklerini (sağda). DNA1 Emisyon spektrumları 535 nm ve 435 nm 464 nm, DNA2 (kırmızı) de heyecanlı (siyah), heyecanlı (pembe emilim rescence ) ve 435 nm'de uyarıldığında DNA1_DNA2 hibrid (mavi), gösterilmiştir. Tek sarmallı DNA1 (siyah), DNA2 (kırmızı) ve melezleştirilmiş çift iplikli DNA1_DNA2 (mavi) absorpsiyon spektrumları sağ tarafında gösteri gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
UV-lambası ile uyarılması sırasında verici boya (sol) ve verici ve alıcı boya (sağ) ile çift sarmallı DNA, tek kordonlu DNA Şekil 5. emisyon rengi. Tek şeritli DNA1 ihtiva eden küvete resmi (LEFt tarafı), parlak yeşil floresan gösterir ve çift sarmallı DNA1_DNA2 (sağ taraf) görüntü 366 nm'de bir el UV lamba ile uyarma sırasında kırmızı floresan gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol azid modifiye floresan boyalar ile CuAAC aracılığıyla DNA sonrası sentetik etiketlemek için tam bir işlemi göstermektedir. Bu boyalar ve alkin ile modifiye edilmiş DNA sentezini ve etiketleme işlemi içermektedir.

Boyaların sentezi dört adımları izler. Tüm ürünler nedeniyle pozitif yük için oldukça basit bir çökeltme ile elde edilebilir ve zaman alıcı kolon kromatografisi gereklidir. merkezi bağlantı adımlar önce azid işlevleri tanıtımı dört yerine beş ardışık reaksiyon adımları boyaların sentezleri kısaltır. 1,3-diiyodopropan yerine alkilasyon aşaması, Appel reaksiyon ve iyodo işlevleri halinde, hidroksi fonksiyonunu dönüştürmek için aşağıdaki Finkelstein reaksiyonları için 3-iodopropanol uygulama kaçınıldı. yayınlanan prosedürlere göre Bu değişiklikler, daha büyük bir ölçekte ve daha kısa zaman dönemleri içinde boyaları sentezlenmesi için izin verir.

(örneğin, potasyum karbonat ile korumanın kaldırılması). Bu önemli ölçüde daha pahalı bir alternatif temsil eder ve katı destek (on tane) DNA yapı blokları veya etiketleme gibi uygun bir boya ile modifiye edilmiş fosforamiditin sentezi gerektirir.

DNA1 boya 2, alıcı boyanın boya 1, verici boya ve DNA2 ile etiketlenmiştir. DNA1 ve DNA2 tavlanır her iki boyalar yakın girmektedirler. boya 1 heyecanlı olduğunda etkin bir enerji transferi görülmektedir. Prensip olarak, her iki boyalar arasındaki Eksitonik etkileşim ikinci süreç Kuplajsız gerektirdiğinden verimli bir enerji transferi ile müdahale ve heyecanlandırmak olabilirbirleştiğinde boyaların d boya 1 ve bağlantısız boya 2. Uyarma farklı Fotofiziksel yollar başlatmak istiyorum. 14 Daha önceki çalışmalarda 9,15 boyaların uygulanan 3'-5'-diyagonal düzenleme arasındaki tek küçük Eksitonik etkileşimleri için yapısal temelini oluşturur ortaya boyalar ve verimli enerji transferi.

Gösterilen enerji transferinin yüksek verimlilik, in vitro ve in vivo deneylerde hassas floresans okuma sağlar. Bu hücrelerin içinde nükleik asit bazlı aptamers yanı sıra küçük müdahale edici RNA (siRNA) bütünlüğünün görsel hedef moleküllerin bağlanması, moleküler işaretleri DNA hibridizasyonu görselleştirilmesi de dahil olmak üzere, geniş bir uygulama yelpazesi sunar. önemli bir sınırlama hem DNA ipliklerini etiketlemek için bir gerekliliktir. Gelecekte bir iplikçik iki boyalar taşıyan çift etiketli oligonükleotid prob geliştirme çalışmalarımızı odaklanmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, 1386 / 17-1 Wa) tarafından finansal destek Araştırma Eğitim Grubu (DFG tarafından finanse edilen) GRK 2039 ve KIT minnetle kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
synthesis
4-Picoline Sigma Aldrich 239615
1,3-Diiodopropane Sigma Aldrich 238414
Acetonitrile Fisher Scientific 10660131 HPLC grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10456870 technical grade
Sodium azide Sigma Aldrich 71290 p.a. grade
Dichloromethane Fisher Scientific 10626642 technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98% ABCR AB112969
Potassium carbonate, 99+% Acros 424081000
dimethylcarbonate Sigma Aldrich 517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve Acros 348435000
Sodium sulfate Bernd Kraft 12623.46
Ethanol, 99.5% Acros 397690010
Piperidine, 99% Acros 147181000
Diethylether Fisher Scientific 10407830 technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% ABCR AB125050
4-Methylquinoline ABCR AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer Applied Biosystems  -
DMT-dA(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich A111081
DMT-dT Phosphoramidite Sigma Aldrich T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite Sigma Aldrich G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma Aldrich L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis Sigma Aldrich L010400
Cap A Sigma Aldrich L840000
Cap B Sigma Aldrich L850000
CPG dT Column 1.0 µmole Proligo Reagents T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole Proligo Reagents G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents C461010
ammonia (aqueous solution)  Fluka Analytical 318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm Pall ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) Sigma Aldrich 75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite Chem Genes ANP-7754
workup
vacuum concentrator Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate Sigma Aldrich 346276
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich A7631
EDTA disodium salt Sigma Aldrich E5134
TBTA-ligand  -  - synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer Bruker Daltonics
LC-318 C18 column Supelcosil via Sigma Aldrich 58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio Varian
Fluoromax-3 fluorimeter Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 113 oligonükleotidler enerji transferi floresan tıklama kimya boya ışığa
Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arndt, S., Walter, H. K.,… More

Arndt, S., Walter, H. K., Wagenknecht, H. A. Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes. J. Vis. Exp. (113), e54121, doi:10.3791/54121 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter