Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/54196
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Introduction

وقد قدرت الخلايا التائية مستقبلات (TCR) ذخيرة من البشر والفئران في 1 × 10 8 و 2 × 10 6 TCRs فريدة من نوعها على التوالي 1،2. هذا التنوع الكبير يسمح خلايا T إلى التعرف على مجموعة واسعة من الحواتم المستضد المستمدة من الببتيدات الذاتي وكذلك من مسببات الأمراض التي قدمها معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) على خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). الاختلافات الطفيفة في تفاعلات TCRs مع المجمعات الببتيد MHC فريدة من نوعها تملي ما إذا كانت الخلايا التائية سيخضع لموت الخلايا المبرمج، استعطال، التنشيط، والتمايز، وإنتاج السيتوكينات أو السمية الخلوية. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى مرجع TCR كبير، وتحليل كيف يمكن لTCR معينا سوف تستجيب لمستضد معين يتطلب استخدام أنظمة TCR واحدة.

وقد ولدت مختلف الفئران المعدلة وراثيا TCR من أجل دراسة وظيفة من TCR واحد في نموذج في الجسم الحي 3-9. ومع ذلك، هناك محاذير لTCR الفئران المعدلة وراثيا بما في ذلكالتكلفة، وطول الفترة الزمنية لتوليد الفئران المحورة جينيا واحد ويسمى تأثير مؤسس الإدراج التحوير عشوائي في الحمض النووي سلالة الجرثومية 10. لذلك، تم إنشاء عدد قليل نسبيا من الفئران المعدلة وراثيا TCR عن أي مستضد معين والآثار الفنية من ارتفاع وانخفاض تقارب TCR لنفس حاتمة نادرا ما يتم التصدي لها. لمعالجة الحاجة إلى نهج السريع إلى الشاشة ودراسة TCRs متعددة منفردة أو مجتمعة، وقد استخدمت الفئران retrogenic ( 'الرجعية' من الفيروس الارتجاعي و "جينك" من المعدلة وراثيا) كبديل لTCR الفئران المعدلة وراثيا 11-13.

و2A الببتيد إجماع عزر وجدت في غضون عدة الفيروسات تتكون من 2A-ASP-فال / إيل تخمة-X-الأسباراجين برو-الغليسين-2B-برو، الذي يحدث انشقاق بين الجلايسين من 2A والبرولين من 2B من رابطة الدول المستقلة -acting النشاط هيدرولاز، مما أدى إلى تخطي الريبوسومي خلال الترجمة 10،14-16. رسم تخطيطي مفصل تصور جleavage من مختلف الببتيدات 2A (F2A، E2A، T2A وP2A) يرجى الرجوع إلى المراجع 10 - 12. وبهذه الطريقة، 2 cistrons (TCR ألفا وبيتا TCR) يمكن أن تكون مرتبطة مما أدى إلى ترجمة متكافئة في ناقل واحد. باستخدام هذا النهج، ونحن قادرون على التعبير عن ومقارنة مباشرة متعددة TCRs محددة مستضد في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: تم بذل كل جهد ممكن للحفاظ على الانزعاج الحيوان أو الإجهاد إلى أدنى حد ممكن خلال التشعيع والوريد ذيل الحقن. وتستخدم الفئران كمصدر للخلايا في هذه التجارب. على هذا النحو ليست هناك إجراءات أو التلاعب بصرف النظر عن القتل الرحيم. سوف يتم التخلص الفئران عن طريق CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة. هذا الإجراء يتسق مع توصيات الفريق بشأن القتل الرحيم للجمعية الأميركية للطب البيطري.

1. إعداد فيروسات الرجعية بانشاء

  1. استنساخ الفرعي مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ألفا وبيتا سلاسل، مفصولة رابط 2A، إلى القائم MSCV فيروسات 11 ناقلات (على سبيل المثال، pMIAII أو pMIGII) 11.
    ملاحظة: رابط 2A يسمح للتعبير عن القياس المتكافئ ومتناسق من ألفا وبيتا TCR سلاسل من إطار واحد القراءة المفتوح. يتضمن ناقلات لIRES الفلورسنت كاسيت البروتين (أميترين أو GFP) الذي يستخدم لتعقب الخلايا transduced وكفاءة ترنسدوكأيشن. لبروتوكول مفصلة يرجى الاطلاع على هولست وآخرون. 11
  2. عزل البلازميد باستخدام الحمض النووي التي تم الحصول عليها تجاريا عدة الإعدادية البلازما أو منتج مماثل. استخدام تركيز العمل من 1-2 ميكروغرام ميكرولتر -1.

2. جيل من فيروسات الرجعية خطوط خلية منتج

  1. الاستفادة من عملية من خطوتين لإنتاج خطوط الخلايا المنتجة فيروسات.
    ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصلة، ​​يرجى الاطلاع هولست وآخرون 11.
    1. توليد الارتجاعي بواسطة ترنسفكأيشن عابرة للخلايا 293T مع ثلاثة البلازميدات (pVSVG، PEQ-Pam3 (-E) ومتجه الفائدة 11) واتخاذ طاف فيروسات من الخلايا 293T لتنبيغ من ecotropic خط الخلية منتج فيروسات GP + E86.
    2. عزل أعلى 40٪ من الفلورسنت معربا عن الخلايا المنتجة GP + E86 من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية ونشر الخلايا المنتجة + E86-GP transdcuced كمصدر للفيروس.
      ملاحظة: الجيلمن المنتجين عالية عيار هو أمر حاسم لالتنبيغ كفاءة خلايا نخاع العظام. لبروتوكول كامل يرجى عرض هولست وآخرون. 11

3. بوساطة الارتجاعي-نقل الجينات الخلايا الجذعية (يوم -5)

  1. ذوبان الجليد من وثقافة 0.5 -1.0 × 10 6 من كل خط الخلية منتج GP + E86 في DMEM الكامل 10٪ (المجلد / المجلد) FBS للسماح للنمو يكفي لمدة متكدسة لوحات 150 ملم من يوم 0 من هذا البروتوكول.
    ملاحظة: ذوبان 0.5 - سوف 1.0 × 10 6 من كل خط الخلية منتج GP + E86 في لوحة 10 سم تسمح لمدة 30 - 50٪ confluency في يوم 5. وهذا يسمح أيضا لمدة 5 أيام الثقافة من أجل توسيع سباق الجائزة الكبرى + E86 خطوط الخلايا المنتجة لاثنين من لوحات متكدسة 150 ملم من يوم 0.
    1. ثقافة خط الخلية منتج فيروسات في وسائل الإعلام كاملة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5٪ العجل فيتا مصل، وسيبروفلوكساسين (10 ميكروغرام / مل) لتجنب التلوث الميكوبلازما.
      ملاحظة: التوقف عن استخدام السيبروفلوكساسين عندما generatinز طاف الفيروسي لالتنبيغ نخاع العظام. تجنب الإفراط في نمو الخلية خط منتج، لأن هذا سوف يؤثر سلبا على نخاع العظم كفاءة ترنسدوكأيشن.

4. الفئران المانحة حقن مع 5 يوراسيل (5-FU) (يوم -3)

  1. وزن الفئران المانحة (5-12 أسابيع من العمر) لتحديد مبلغ 5-FU المطلوبة. باستخدام الفئران الذين تقل أعمارهم عن 5 أسابيع من النتائج السن في البلدان المنخفضة العائد نخاع العظام. لضمان التعبير عن TCR واحد، واستخدام الخلايا التائية سلالة الماوس ناقصة مثل SCID، الفريق الاستشاري أو TCR ألفا الفئران التي تعاني من نقص الجهات المانحة نخاع العظام.
  2. العمل في نسيج الثقافة هود، يخفف من الأوراق المالية 5-FU مع برنامج تلفزيوني العقيمة من أجل جعل كمية كافية من 10 ملغ مل -1 الحل العمل من 5 FU لتقديم 0.15 ملغ 5-FU لكل غرام من وزن الجسم.
  3. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 37 G، داخل الصفاق حقن 0.15 ملغ 5-FU لكل غرام من وزن الجسم في الماوس المانحة.
    ملاحظة: استخدام الماوس 1 المانحة في مستلم واحد لبدء وضبطعدد من الفئران المانحة وفقا للعائد الخلية. طريقة بديلة لعلاج 5-FU لتخصيب اليورانيوم وعزل الأسلاف نخاع العظام هو اختيار السلبية للخلايا إيجابية النسب كما هو موضح في Viret وآخرون.

5. نخاع العظم استخراج الداخلي (يوم 0)

  1. الحصول على مقص تشريح وملقط لعزل العظام. إعداد وسائل الاعلام (تستكمل HBSS مع 5٪ FCS (المجلد / المجلد)) لجمع العظام في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تبقي 50 المخروطية مل تحتوي على وسائل الاعلام على الجليد. الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة. قرصة مخلب لضمان الكشف عن أي ردة فعل.
  2. تعقيم موقع الجراحة والأدوات الجراحية مع الإيثانول أو الميثانول. إزالة عظم الفخذ، الساق، العضد، والزنار الحوضي بعناية عن طريق خفض للمرة الاولى وتحت الزنار الحوضي. قطع أسفل الظهر على طول عظم الفخذ في الساق. إزالة جميع الأنسجة المحيطة بها باستخدام مقص وملقط للحصول على عظام نظيفة. احتفظعظام رطب في HBSS + 5٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  3. فصل العظام عن طريق قطع عند المفاصل، مع التأكد من قطع كلا الطرفين من كل العظام. اضافة الى وجود إبرة عيار 25 تعلق على حقنة 10 مل تحتوي على HBSS + 5٪ (المجلد / المجلد) FBS. ممارسة الضغط وطرد جميع نخاع العظام من خلال يستريح مصفاة 70 ميكرومتر في مخروطي 50 مل.
  4. دوري، ودفع نخاع العظام من خلال تصفية 70 ميكرون باستخدام المكبس من حقنة 1 مل أو 3 مل. شطف مصفاة مع HBSS + 5٪ (المجلد / المجلد) FBS. وهذا يضمن تعليق خلية واحدة خالية من شظايا العظام والأنسجة. حفاظ على الخلايا العقيمة التي كتبها تنفيذ الإجراء في غطاء العقيمة.
  5. الطرد المركزي خلايا نخاع العظام في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.

6. نخاع العظم الثقافة (يوم 0)

  1. صب أو نضح وسائل الإعلام وبيليه الخلية resuspend في 1 مل الأمونيوم كلوريد أساس العازلة تحلل الدم الحمراء (RBC أو العازلة تحلل ما يعادلها) لكل 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. بعد 1 دقيقة حضانة في الغرفة درجة الحرارة، وإرواء المخزن المؤقت خلية تحلل الأحمر بإضافة 10 مل من DMEM الكامل 20٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  2. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. صب أو نضح طاف و resuspend نخاع العظام في 5 مل الكامل DMEM 20٪ (المجلد / المجلد) FBS. عد الخلايا مع عد غرفة نويباور.
    ملاحظة: يجب أن يكون العائد العام حوالي 5-10 × 10 6 خلايا في الماوس. ومع ذلك، يمكن أن العائد تختلف بين سلالات مختلفة من الفئران.
  4. خلايا نخاع العظم لوحة في كثافة 4 × 10 7 خلايا لكل لوحة 150 ملم في 30 مل من DMEM الكامل 20٪ (المجلد / المجلد) FBS تستكمل مع IL-3 (20 ز مل -1)، IL-6 (50 ز مل -1) وSCF (50 ز مل -1).
    ملاحظة: استخدام السيتوكينات الطازجة إذابة aliquoted. لا تستخدم السيتوكينات التي جمدت وإذابة أكثر من مرة أو الاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 2 أسابيع.
  5. احتضان نخاع العظم بين عشية وضحاها (حوالي 24 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

الصورة = "jove_title"> 7. الثقافة فيروسات منتج الخليوي (يوم 0)

  1. لوحة 3 × 10 خلايا منتجة 6 فيروسات في لوحة 150 ملم في 18 مل الكامل DMEM 20٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  2. احتضان خلايا منتج فيروسات عند 37 درجة مئوية خلال الليل. توقع واحد لوحة 150 ملم مقابل 15 مليون خلايا نخاع العظم (حوالي 2-3 الفئران المانحة).

8. فيروسات الرجعية طاف (يوم 1)

  1. في اليوم التالي (بعد ما يقرب من 24 ساعة)، حصاد طاف فيروسات من لوحات المنتج (بإعدادها في الخطوة 7) عن طريق وضع طاف فيروسات مباشرة من لوحة 150 ملم مع حقنة 10 مل وتصفية باستخدام 0.45 -μm مرشح حقنة.
  2. استبدال بعناية طاف فيروسات إزالتها مع 18 مل من DMEM جديدة كاملة 20٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  3. تكملة طاف فيروسات تصفيتها مع IL-3 (20 ز مل -1)، IL-6 (50 ز مل -1)، MSCF (50 ز مل -1) وبروميد Hexadimethrine (Polybrene) (6 &# 956؛ ز مل -1).
    وينبغي بذل بروميد Hexadimethrine جديدة كل 2 أشهر لتجنب انخفاض في كفاءة تنبيغ فيروسات: ملاحظة.

9. نخاع العظام حصاد (يوم 1)

  1. بعد إكمال الخطوة 8.3، حصاد خلايا نخاع العظام من الخطوة 6.4 ونقل وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة في أنابيب معقمة 50 مل.
  2. تغسل الصحون بقوة مع 10 مل برنامج تلفزيوني وجمع في مخروطي 50 مل من الخطوة 9.1. إذا لزم الأمر، كرر الخطوة غسل.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، صب وطاف، وخلايا resuspend في حجم صغير (1-3 مل) DMEM الكامل 20٪ (المجلد / المجلد) FBS، والعد. توقع 50 - استعادة 75٪ من اليوم 0. و resuspend نخاع العظام في 1 × 10 6 خلايا لكل 1 مل من طاف فيروسات التي تحتوي على السيتوكينات وبروميد Hexadimethrine.

10. نخاع العظم تنبيغ (يوم 1)

  1. لوحة طاف فيروسات / أماه العظامخليط RROW في حجم 3 مل لكل بئر في ستة جيدا وحة زراعة الأنسجة. التفاف على لوحات في غلاف بلاستيكي للحد من تبادل الغازات أثناء الطرد المركزي في خطوة 10.2.
  2. تدور ملفوفة وحات ستة جيدا في 1000 x ج لمدة 60 دقيقة 37 درجة مئوية.
  3. بعد زيادة ونقصان كاملة، وإزالة غلاف بلاستيكي ووضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية CO 2 لمدة 24 ساعة.

11. فيروسات الرجعية طاف وتنبيغ (يوم 2)

  1. بعد 24 ساعة، وجمع طاف الفيروسية جديدة من خط الخلية منتج الفيروسي. تصفية طاف فيروسات باستخدام حقنة 10 مل ومرشح حقنة 0.45 ميكرون. تكملة طاف تصفيتها فيروسات مع IL-3 (20 ز مل -1)، IL-6 (50 ز مل -1) وSCF (50 ز مل -1) وبروميد Hexadimethrine (6 ز مل -1).
  2. بعد ذلك، إزالة بعناية مع ماصة أو نضح أعلى 2 مل من وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة ستة جيدا تحتوي على خلايا نخاع العظام.
    ملاحظة: العمل بعناية على عدم نضح نخاع العظام، والتي عادة ما تتركز في منتصف البئر. بدلا من ذلك، طاف إزالة يمكن نسج صولا الى استرداد أي خلايا نخاع العظم المفقود.
  3. إلى كل بئر في نخاع العظام لوحة 6 جيدا إضافة 3 مل من طاف تحتوي على السيتوكينات الفيروسية الطازجة وبروميد Hexadimethrine. التفاف على لوحات من البلاستيك، وكرر تنبيغ تدور في 1000 x ج لمدة 60 دقيقة 37 درجة مئوية. بسط لوحات، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها (حوالي 24 ساعة).

12. إضافة جديدة تستكمل DMEM (يوم 3)

  1. بعد 24 ساعة، وإزالة أعلى 2 مل من وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة ستة جيدا تحتوي على خلايا نخاع العظام، كما هو الحال في خطوة 11.2. استبدال وسائل الإعلام مع إزالة DMEM جديدة 20٪ (المجلد / المجلد) FBS تستكمل مع تركيزات النهائي من IL-3 (20 ز مل -1)، IL-6 (50 ز مل -1) وSCF (50 ز -1 مل) .
  2. احتضان نخاع العظاملوحات في 37 حاضنة درجة مئوية CO 2 لمدة 24 ساعة أخرى.

13. الحصاد Transduced نخاع العظم (يوم 4)

  1. بعد 24 ساعة، وجمع خلايا نخاع العظام من لوحات ستة جيدا. تغسل الصحون بقوة مع برنامج تلفزيوني لإزالة جميع الخلايا غير ملتصقة.
    1. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وصب طاف.
    2. Resuspend ونخاع العظام في حجم صغير (1 مل) من برنامج تلفزيوني + 0.5٪ (المجلد / المجلد) الحرارة المعطل FBS. تبقي الخلايا على الجليد.
  2. أخذ عينة 10 ميكرولتر من كل شرط نخاع العظام وعدد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. على افتراض 1-2 المانحة في المتلقي، فإن العائد سيكون كافيا لنقل على الأقل 4 × 10 6 خلايا في الماوس المتلقي. Resuspend ونخاع العظام في حجم كاف من برنامج تلفزيوني + 0.5٪ (المجلد / المجلد) الحرارة المعطل FBS لحقن 200-300 ميكرولتر في الماوس.
    1. حقن لا يقل عن 2 × 10 6 الخلايا مع كفاءة ترنسدوكأيشن25٪ (يمكن ضخ ما يصل إلى 8 X10 6 خلايا) في الماوس عن طريق الوريد.
      ملاحظة: نحن حقن روتيني خمسة الفئران المتلقي في صفيحتين 6 جيدا من خلايا نخاع العظام. إذا كان العائد إلى حد كبير أقل من ذلك، ينبغي استخدام المزيد من الفئران المانحة حتى يمكن الحصول على ما يكفي من عدد نخاع العظام. من أجل تحقيق إعادة المثلى، لا يقل عن 5 × 10 5 transduced (الفلورية إيجابية) يجب أن يتم حقنه في كل المتلقي.
  3. مع pipettor الصغير، أخذ عينة 10 ميكرولتر من كل شرط نخاع العظام وتحليل كفاءة ترنسدوكأيشن عن طريق التدفق الخلوي على أساس التعبير عن علامة فلوري (الشكل 1A) 11.
    ملاحظة: عموما، النسبة المئوية للخلايا إيجابية الفلورسنت ما بين 25٪ و 70٪، وهذا يتوقف على بناء وعيار فيروسات. عدد خلايا نخاع العظام transduced اللازمة لإعادة تكوين الماوس أشرق شبه قاتلة يمكن أن تختلف تبعا لكفاءة ترنسدوكأيشن. وانخفاض ترانكفاءة sduction، خلايا نخاع العظام اكثر المطلوبة وعلى العكس، كلما نخاع العظام كفاءة تنبيغ، وعدد أقل من خلايا مطلوبة لإعادة. كفاءة تنبيغ أقل من 25٪ هي دون المستوى الأمثل ويمكن أن يؤدي إلى عدم كفاية إعادة والبقاء على قيد الحياة. من أجل ضمان استرداد نخاع العظام الأمثل والكفاءة تنبيغ، استخدام وسائل الإعلام زراعة الأنسجة الطازجة والسيتوكينات. عندما تعبر عن TCR الجديد الاستفادة من نظام retrogenic، واختيار من أن TCR في الجسم الحي غير معروفة. اعتمادا على كل تقارب TCR الفردي، واختيار TCR في الغدة الصعترية والمحيطي التعبير الخلايا التائية تختلف 17.

14. الفأر تشعيع، نخاع العظم حقن والعناية

  1. أشرق الفئران في اليوم قبل حقن نخاع العظام (نفس اليوم الذي الخطوة 13). استخدام الجرعات التالية: C57BL / 6 الفئران (وغيرها من سلالات النوع البري)، 900 راد، Rag1 - / - الفئران، 500 راد، الفئران SCID، 300 راد).
    1. الفئران مكان المتلقي على أموكسيسيلين (50 ملغ / كغ / يوم) أو معالجة المياه مضاد حيوي آخر قبل التشعيع، والحفاظ على المضادات الحيوية لأول أسبوعين بعد حقن نخاع العظام.
      ملاحظة: جرعة التشعيع الأمثل قد يكون من الضروري تحديد تجريبيا.
  2. للحقن، تحميل الخلايا من الخطوة 13.1 في حقنة 1 مل باستخدام الإبر حادة على الفور قبل الحقن، ثم تغيير الإبرة إلى 27 عيار للحقن، وطرد أي الهواء لتجنب انسداد الهواء. الفئران الحرارة تحت مصباح التدفئة وحقن 0.2 مل من نخاع العظام في الماوس عن طريق الوريد.
    ملاحظة: لا تدع خلايا الجلوس في حقنة ولأي مدة من الزمن أو الخلايا سوف يستقر.
  3. مراقبة الفئران أسبوعيا لضمان أن تظل بصحة جيدة.
  4. بعد 5-6 أسابيع، تنزف الفئران للتحقق من إعادة على أساس GFP + / + أميترين وTCR شاركت في التعبير (الشكل 1B) 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم فحص العظام كفاءة نخاع التنبيغ في خطوة 13.3 من البروتوكول قبل يتم حقن نخاع العظام في الرابع الوريد الذيل في نخاع العظام التمثيلي التنبيغ الرقم (الشكل 1A)، تم إضافة حوالي 10 ميكرولتر من نخاع العظم المقطوع إلى 100 ​​ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتحليلها من أجل التعبير أميترين. عموما النسبة المئوية للخلايا إيجابية الفلورسنت ما بين 25٪ و 70٪، وهذا يتوقف على بناء وعيار فيروسات. بعد 6 أسابيع حقن نخاع العظام، ونزف الفئران لتحديد إعادة نخاع العظام (الشكل 1B). ما يقرب من 25 ميكرولتر من الدم المحيطي والخلايا الحمراء هي lysed وملطخة مكافحة TCRβ. في الشكل 2B جميع الخلايا إيجابية TCR تعبير متناسق البروتين أميترين الفلورسنت.

شكل 1
فيقوإعادة 1. مثال من نخاع العظم تنبيغ والمحيطية TCR Retrogenic الخلايا التائية. أ) تنبيغ كفاءة خلايا نخاع العظام وتحليلها على أساس علامة فلوري (أميترين) في اليوم لنقل نخاع العظم. تمت إضافة حوالي 10 ميكرولتر من نخاع العظم المقطوع إلى 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتحليلها للتعبير أميترين. وهناك نجاح تنبيغ نخاع العظام تسفر عن النسبة المئوية للخلايا إيجابية الفلورسنت بين 25٪ و 70٪. ب) مثال من TCR خلايا retrogenic تي في الدم المحيطي 6 أسابيع بعد نخاع العظام إعادة. تم الحصول على الدم المحيطي وكانت هي lysed خلايا الدم الحمراء مع العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. كانت ملطخة الخلايا المتبقية لTCRβ. تحليل تمثيلي للتعبير أميترين ومكافحة TCRβ تلطيخ 6 أسابيع بعد نخاع العظام إعادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من رشخصية له.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في البروتوكول، ونحن بالتفصيل عدة خطوات حاسمة لضمان الأمثل الصحة نخاع العظم، وكفاءة ترنسدوكأيشن وإعادة. الخطوة الأولى الحاسمة هي جيل والصيانة الصحيحة للخلايا المنتجة الفيروسي GP + E86. استخدام ممر خطوط الخلايا المنتجة المبكرة والاحتفاظ بنسبة 80٪ confluency أو أقل قبل استخدامها. عند اتخاذ GP + E86 الخلايا المنتجة الفيروسي جديدة، وضمان خلايا 293T هي مرور وقت مبكر وتزايد في ثقافة 24-48 ساعة. وتصفيح خلايا كثيرة GP + E86 خلال الخطوة التنبيغ خفض عيار الفيروسية. تحديد عيار الفيروسية كما هو موضح في هولست وآخرون. 11 لضمان GP + E86 على المنتجين الفيروسي قوية. بالإضافة إلى ذلك، وإزالة خلايا الدم الحمراء من نخاع العظم المقطوع يحسن كفاءة ترنسدوكأيشن. ضمان صحة الأسلاف نخاع العظام أمر بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. تحقيقا لهذه الغاية، ودائما استخدام وسائل الإعلام الجديدة (أقل من 4 أسابيع عند 4 درجة مئوية بعد أن تستكمل مع FCS) والسيتوكينات الطازجة (أقلمن 2 أسابيع عندما يحتفظ بها في 4 درجات مئوية). بروميد Hexadimethrine هو أيضا حساسة لالتحلل، وينبغي أن تكون طازجة، مرة واحدة هو في حل، كل 2 أشهر. وتشمل التفاصيل الأخرى التي من شأنها ضمان أفضل صحة نخاع العظام والتنبيغ ما قبل ارتفاع درجة حرارة الطرد المركزي قبل تنبيغ زيادة ونقصان. تدور تنبيغ عند 37 درجة مئوية والتفاف لوحات مع غلاف بلاستيكي لتقليل تبادل الغازات قدر الإمكان. أيضا، لا تدع نخاع العظام الجلوس خارج الحاضنة 37 درجة مئوية أو على الجليد لفترات طويلة من الوقت حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة موت الخلايا وتقليل نخاع العظام التنبيغ وإعادة. بعد أن تم حصاد خلايا نخاع العظم في يوم 4 (الخطوة 13)، تحميل فقط الحقن فورا قبل حقن الفئران. وأخيرا، تأكد من أن يتم وضع الفئران على المضادات الحيوية قبل يوم أو يوم إشعاع.

الاستفادة من هذا فيروسات بوساطة بروتوكول التنبيغ يسمح لتنبيغ من الخلايا الاصلية نخاع العظام مما يؤدي إلىجيل تي مستقبلات الخلية الفئران retrogenic. الفئران Retrogenic هي أسرع لتوليد من TCR الفئران المعدلة وراثيا وتكلفة أقل بكثير من توليد المعدلة وراثيا TCR واحدة. ومع ذلك، الفئران retrogenic لا يمكن أن تكون ولدت ويجب إنشاء من جديد مع كل تجربة 10. عدد الخلايا T الطرفية هي أقل في الفئران retrogenic مما ظهر في TCR الفئران المعدلة وراثيا ولكن تنظيم TCR غير قابلة للمقارنة بين TCR retrogenic وTCR المعدلة وراثيا 10. ويسمح هذا النظام retrogenic TCR للتعبير عن TCRs متعددة داخل نفس مستعمرة وحتى داخل نفس التجربة. الاستفادة من بروتوكول TCR retrogenic الموصوفة هنا يسمح للمحقق لاختبار وفحص تطوير وظائف عديدة تم تشخيصها حديثا معقد التوافق النسيجي الكبير الأول أو الثاني TCRs مقيدة. مع تطور "الماوس أنسنة" نموذج 18،19، يمكن للretrogenic TCR مزيد من توسيع الاستفادة TCRs بشرية مستنسخة. بالإضافة إلى ذلك، ربط 2A يبني جكذلك يمكن أن تستخدم لدراسة البروتينات متعددة أخرى بما في ذلك سلاسل CD3، المحفزة ومستقبلات المستضد خيالية 20-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلنت أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5K22A1119151-01 و1R56DK104903-01) لملب، البرنامج التجريبي / الجدوى من مركز أبحاث مرض السكري (P30-DK079638) في BCM، JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF، ADA وظائف المعهد العربي الأميركي في علم المناعة زمالة لMB، ووروبرت ومؤسسة جانيس ماكنير 1-15-JF-07.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose + glutamine Corning Cellgro 10-013-CV Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS Atlanta Biological S11550
Trypsin-Versene Lonza 17-161F
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific 194-2545
polybrene Sigma H9268-10G Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin  VWR AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU) VWR AAA13456-06
Sodium Pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-CI
HEPES 1 M solution Corning Cellgro 25-060-CI
2-Mercaptoethanol Gibco by Life Technologies 21985-023
Pen/Strept Corning Cellgro 30-002-CI
L-glutamine Corning Cellgro 25-005-CI
150 mm tissue culture dishes Greiner Bio-one 639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate Greiner Bio-one 657160
70 µm nylon cell strainers Falcon 352350
Mouse IL-3 Invitrogen PMC0033
Human IL-6 Invitrogen  PHC0063
Mouse Stem Cell Factor Invitrogen PMC2113L
10x PBS Corning Cellgro 46-D13-CM
HANKS Buffer Corning Cellgro 21020147
BD 10 ml Syringe BD 300912
BD 1 ml Syringe BD 309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
  2. Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
  3. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  4. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  5. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
  6. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  7. Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
  8. Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
  9. Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
  10. Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
  11. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
  12. Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
  13. Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
  14. Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
  15. Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
  16. Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
  17. Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
  18. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
  19. Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
  20. Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
  21. Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
  22. Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
  23. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
  24. VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 113، الخلايا التائية مستقبلات (TCR)، والرائد التوافق النسيجي مجمع (MHC)، الارتجاعي، نخاع العظم، تنبيغ، Retrogenic
فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. … More

Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J. Vis. Exp. (113), e54196, doi:10.3791/54196 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter