Introduction
İnsanlarda ve farelerde T hücresi reseptörü (TCR) repertuarı 1 x 10 8 ve 2 x 10 6 benzersiz TCRler, sırasıyla 1,2 olarak tahmin edilmiştir. Bu büyük çeşitlilik T hücreleri kendi peptidlerinin yanı sıra antijen sunan hücreler (APC'ler) üzerindeki majör histokompatibilite kompleksiyle (MHC) tarafından sunulan patojenlerden türetilmiş antijen epitop geniş bir dizi tanımasını sağlar. Benzersiz peptid-MHC komplekslerine sahip TCRlerin etkileşimleri ince farklar T hücre apoptosis, anerji, aktivasyon, farklılaşma, sitokin üretiminin veya sitotoksisite tabi olup olmadığını belirler. Bununla birlikte, büyük bir TCR repertuarına, belirli bir TCR belirli bir antijene yanıt nasıl analizi, tek TCR sistemlerinin kullanılmasını gerektirir.
Çeşitli TCR transjenik farenin bir in vivo modeli 3-9 tek TCR'nin fonksiyonu çalışma amacıyla oluşturulmuştur. Bununla birlikte, aşağıdakileri içeren transgenik fareler TCR'ye uyarılar vardırmaliyet, tek bir transgenik fare ve germ DNA 10 rastgele transgen yerleştirme sözde kurucu efekti oluşturmak için zamanın uzunluğu. Bu nedenle, çok az sayıda TCR transjenik farenin herhangi bir antijen için oluşturulan ve aynı epitop için yüksek ve düşük TCR afinite fonksiyonel etkileri nadir ele alınmaktadır. Ekrana hızlı bir yaklaşım gereksinimi işaret etmektedir ve tek tek ya da kombinasyon halinde birden fazla TCRlerin incelemek için, (retrovirüs ile ilgili "geriye" ve transjenik 'gen') retrogenic farenin transgenik fareler 11-13 TCR'ye bir alternatif olarak kullanılmaktadır.
Birkaç virüs içinde bulunan 2A peptid ortak motif parçalanma 2A glisin ve 2B, prolin ile meydana geldiği, bir 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gli-2B-Pro oluşmaktadır cis -Oyunculuk hidrolaz aktivitesi ile ilgili, çeviri 10,14-16 boyunca ribozomal atlama sonuçlanır. c gösteren detaylı bir diyagram içinBu şekilde, tek bir vektörde stoikiometrik tercüme sonucu bağlanabilir 2 cistrons (TCR alfa ve TCR beta) 12. - çeşitli 2A peptidler (F2A, E2A, T2a, P2A) arasında leavage referans 10 bakınız. Bu anlayışla, biz ifade ve doğrudan in vivo çoklu antijen spesifik TCRler karşılaştırmak mümkün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Her türlü çabayı ışınlama ve kuyruk ven enjeksiyonlar sırasında minimuma hayvan rahatsızlık veya stres tutmak için yapılır. Fareler Bu deneylerde hücre kaynağı olarak kullanılmaktadır; gibi herhangi bir usul veya manipülasyonlar ötanazi dışında bulunmaktadır. Fareler ölümü onaylamak için servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi yapılacaktır. Bu prosedür Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli önerileri ile tutarlıdır.
1. retroviral Construct hazırlayın
- Alt klon T-hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri, bir MSCV bazlı retroviral 11 vektörü (örneğin, pMIAII ya pMIGII) 11 içine, bir 2A bağlayıcı ile birbirlerinden ayrılmışlardır.
Not: Şekil 2A bağlayıcı tek bir açık okuma çerçevesinden alfa ve beta TCR zincirlerinin stoikiometrik ve uygun ekspresyon için izin verir. Vektör için kullanılan bir IRES flöresanlı protein kaseti (Ametrine veya GFP) içerirtransduced hücreleri ve transdüksiyon etkinliğini izlemek. Ayrıntılı bir protokol için Holst ve ark bakın. 11 - ticari olarak elde plazma hazırlık kiti veya benzer bir ürün kullanarak plazmid DNA izole. 1. Bir çalışma konsantrasyonunu kullanarak - 2 ug ul 1.
Retroviral Yapımcı Hücre Hatları 2. Nesil
- retroviral üretici hücre çizgileri oluşturmak için iki aşamalı bir işlem kullanmaktadır.
NOT:. Detaylı bir protokolü için, Holst ve ark 11 görüntülemek için lütfen.- Plasmidlerden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) ve ilgili 11 vektörü) ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon ile retrovirüs üretmek ve GP + E86 ekotropik retroviral üretici hücre çizgisi uyum sağlamak 293T hücrelerinden retroviral süpernatan alır.
- FACS floresan ifade GP + E86 üretici hücrelerin üst% 40 izole edin ve virüs kaynağı olarak transdcuced-GP + E86 üretici hücreleri yaymak.
NOT: nesilyüksek titre üretici kemik iliği hücrelerinin etkili transdüksiyonuyla için kritik öneme sahiptir. Tam bir protokol için Holst ve ark görüntülemek için lütfen. 11
3. Retrovirüs aracılı Kök Hücre Gen Transferi (Gün -5)
- % 10 (hacim / hacim) FBS, bu protokolün Gün 0, iki birleşik 150 mm tabak için yeterli bir büyüme sağlamak için dışarı çözülme ve bitmiş DMEM her da GP + E86 üretici hücre hattı kültürü 0.5 -1.0 x 10 6.
Not: Çözülme 0.5 - da GP + E86 genişletmek için kültür 5 gün sağlayan bu 5. günde% 50 konfluansa - 10 cm plaka, her da GP + E86 üretici hücre hattı 1.0 x 10 6 30 sağlayacaktır Gün 0 iki konfluent 150 mm plakalara üretici hücre hatları.- % 5 beyaz dana serumu ve mikoplazma kontaminasyonu önlemek için siprofloksasin (10 ug / ml) ihtiva eden, tam doku kültürü ortamında kültür retroviral üretici hücre hattı.
NOT: generatin zaman siprofloksasin kullanımı durdurung, kemik iliği nakli için viral süpernatan. Bu olumsuz kemik iliği transdüksiyon etkinliğini etkileyecek şekilde, üretici hücre hattının aşırı büyüme kaçının.
- % 5 beyaz dana serumu ve mikoplazma kontaminasyonu önlemek için siprofloksasin (10 ug / ml) ihtiva eden, tam doku kültürü ortamında kültür retroviral üretici hücre hattı.
5-florourasil (5-FU) (gün-3) 4. enjekte donör farelerden
- Gerekli 5-FU miktarını belirlemek için - (12 haftalık 5) donör fareler tartılır. Düşük kemik iliği verim yaş sonuçlarının 5 hafta daha genç fareler kullanma. Tek TCR'nin ekspresyonunu sağlamak için, örneğin, SCID, bez ya da TCR alfa kemik iliği vericisi olarak eksikliği olan farelerde bir T hücresi eksik fare suşu kullanın.
- Doku kültürü kaputu çalışan 10 mg ml yeterli miktarda -1 vücut ağırlığının her bir gramı başına 0.15 mg 5-FU sunmak için 5-FU çalışma çözeltisi yapmak için steril PBS ile 5-FU stok seyreltin.
- 37 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak, intraperitonal, verici bir fare başına vücut ağırlığının gramı başına 0.15 mg 5-FU enjekte edilir.
NOT: Bir alıcı başına kullanın 1 donör fare başlatmak ve ayarlamak içinhücre verimi uygun donör fare sayısı. Kemik iliği progenitörlerin zenginleştirme ve izolasyonu için 5-FU tedavisi için alternatif bir yöntem, Viret ve diğerleri de tarif edildiği gibi soy pozitif hücrelerinin negatif seçim.
5. Kemik İliği Ekstraksiyon Prosedürü (Gün 0)
- Kemik izolasyonu için diseksiyon makas ve forseps edinin. 50 ml konik bir tüp içinde kemiklerin toplamak için ortamı (HBSS,% 5 FCS (hacim / hacim ile desteklenmiş)) hazırlayın. Buz üzerinde medya içeren 50 ml konik tutun. CO ölümü teyit etmek için servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon fareler Euthanize. Hiçbir refleksleri algılanmasını sağlamak üzere pençe sıkıştırın.
- Cerrahi site ve etanol veya metanol ile cerrahi aletler sterilize. İlk keserek ve pelvis altında dikkatlice femur, tibia, humerus ve pelvik kuşak çıkarın. geri aşağı tibia femur boyunca kesin. temiz kemikleri elde etmek için makas ve forseps kullanarak tüm çevreleyen doku çıkarın. tutmakHBSS +% 5 (hacim / hacim) FBS içinde hidre kemikleri.
- her ikisi de kemik uçları kesmeye emin, eklemlerde keserek kemikleri ayırın. HBSS +% 5 (hacim / hacim) ihtiva eden bir 10-ml şırınga FBS bağlanmış bir 25 gauge iğne takın. basınç uygulayın ve 50 ml'lik bir konik bir 70 mikron süzgeç istirahat aracılığıyla tüm kemik iliği yıkayın.
- Düzenli olarak, bir 1 ml veya 3 ml şırınga pistonu kullanarak 70 mikron filtre ile kemik iliği itin. HBSS +% 5 (hacim / hacim) FBS ile süzgeç durulayın. Bu kemik parçaları ve doku serbest olan tek bir hücre süspansiyonu sağlayacaktır. steril bir kaput prosedürü uygulayarak steril hücreleri tutun.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin kemik iliği hücreleri.
6. Kemik İliği Kültürü (Gün 0)
- Durusu veya aspirat medya ve 50 ml konik tüp başına 1 ml amonyum klorür bazlı kırmızı kan lizis tamponu (veya RBC parçalama tamponu eşdeğeri) tekrar süspansiyon hücre pelet. oda sıcaklığında 1 dakika inkübasyondan sonra,Sıcaklık, bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 10 ml ilave edilerek kırmızı hücre lisis tampon söndürme.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri.
- Boşaltacaktır ya da 5 ml bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS aspire supernatant ve tekrar süspansiyon kemik iliği. Bir Neubauer sayım odası ile hücreleri saymak.
Not: Genel verim olmalıdır yaklaşık 5 - fare başına x 10 6 hücre 10; Bununla birlikte, verim farelerin farklı türleri arasında değişebilir. - IL-3 ile desteklenmiş tam DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 30 ml, 150 mm plaka başına 4 x 10 7 hücre yoğunluğunda Plaka kemik iliği hücreleri (20 g mi-1), IL-6 (50 g mi -1) ve SCF (50 g mi -1).
NOT: taze çözülmüş-aliquoted sitokinler kullanın. 2 haftadan daha uzun süreyle 4 ° C'de donduruldu ve daha sonra daha fazla çözülmüş veya tutulmuştur sitokinleri kullanmayın. - % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca, kemik iliği (yaklaşık 24 saat) inkübe edin.
- Levha 18 ml bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS 150 mm plaka başına 3 x 10 6 retroviral üretici hücreleri.
- gece boyunca 37 ° C 'de retroviral üretici hücreleri inkübe edin. (- 3 donör fareler yaklaşık 2) 15 milyon kemik iliği hücreleri için bir 150 mm'lik plaka tahmin ediyoruz.
8. retroviral süpernatan (Gün 1)
- Ertesi gün (yaklaşık 24 saat sonra), 10 ml'lik şırınga ve filtre 0.45 kullanarak 150 mm plaka kapalı doğrudan retroviral süpernatant kadar çizerek (7. adımda kurmak) Üretici plakalarından retroviral süpernatant hasat -μm şırınga filtresi.
- Itinalı bir şekilde tatlı bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 18 ml ile temizlenebilir retroviral süpernatan değiştirin.
- (G mi -1 20), IL-6 (50 g mi-1), mSCF (50 g mi-1) ve heksadimetrin bromit (Polybrene) (6 ve IL-3 ile süzüldü retroviral süpernatan Ek# 956; g mi -1).
Not: heksadimetrin bromit Retroviral transdüksiyonun etkinliğinin bir düşüş önlemek için her 2 ayda taze yapılmalıdır.
9. Kemik İliği Hasat (Gün 1)
- adım 8.3 tamamlandıktan sonra, Aşama 6.4 kemik iliği hücreleri hasat ve steril 50 ml tüp içine yapışmayan hücreleri ihtiva eden ortam aktarın.
- 10 ml PBS ile kuvvetlice plakaları yıkayın ve adım 9.1 50 ml konik toplamak. Gerekirse, yıkama adımı tekrarlayın.
- Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri, süpernatant süzün, küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri (1-3 mi) tam bir DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS ve sayısı. Sitokinler ve heksadimetrin bromit ihtiva eden retroviral süpernatan 1 ml başına 1 x 10 6 hücre 0. günde yeniden süspanse kemik iliğinden% 75 iyileşme - 50 önceden tahmin.
10. Kemik İliği İletimi (Gün 1)
- retroviral süpernatan / kemik ma Platealtı oyuklu doku kültür plakasına oyuk başına 3 ml'lik bir hacimde rrow karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Adım 10.2 santrifüj sırasında gaz alışverişini en aza indirmek için plastik wrap plakaları sarın.
- 60 dakika 37 ° C sıcaklıkta 1000 x g'de sarılmış altı oyuklu plakalar dönerler.
- Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, plastik parçası çıkarın ve 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe plakaları yerleştirin.
11. retroviral süpernatan ve transdüksiyon (Gün 2)
- 24 saat sonra, virüs üretici hücre hattı taze viral supernatant toplamak. 10 ml'lik bir şırınga ve 0.45 um'lik bir şırınga filtresi kullanılarak retroviral süpernatan filtre. IL-3 ile süzüldü retroviral süpernatan (20 g mi-1), IL-6 (50 g mi-1) ve SCF Ek (50 g mi-1) ve heksadimetrin bromit (6 g mi-1).
- Daha sonra, dikkatli bir şekilde bir pipet ile kaldırmak veya kemik iliği hücreleri ihtiva eden altı oyuklu plakanın her bir ortamın ilk 2 ml aspire.
NOT: İş dikkatle genellikle iyi ortasında yoğunlaşmıştır kemik iliğini, aspire değil. Seçenek olarak ise, üst tarafta yüzer kısım herhangi bir kayıp kemik iliği hücrelerinin geri aşağı eğrilebilir. - de kemik iliği 6-çukurlu plaka içindeki her bir taze viral süpernatan ihtiva eden sitokinler ve heksadimetrin bromit 3 ilave edin. plastik tabak sarın ve 60 dakika 37 ° C 1000 xg'de Spin transdüksiyon tekrarlayın. Plakalar paketini, ve 37 ° C'de ve% 5 CO2, gece boyunca (yaklaşık 24 saat) inkübe hücreleri.
Taze DMEM 12. eklenmesi (Gün 3)
- 24 saat sonra, aşama 11.2'deki gibi kemik iliği hücreleri, ihtiva eden altı oyuklu plakanın her bir ortamın ilk 2 ml çıkarın. (G mi -1 50), IL-3 nihai konsantrasyonları ile desteklenmiş taze DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS (20 g mi-1) çıkarılır değiştirin, IL-6 (50 g mi-1) ve SCF .
- Kemik iliği inkübebir 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe plakalara.
13. Hasat kalıt aktarımlı Kemik İliği (Gün 4)
- 24 saat sonra altı oyuklu plakalar kemik iliği hücreleri toplamak. Tüm yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile kuvvetli bir şekilde plakalar, yıkama.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücreleri ve süpernatantı süzün.
- PBS +% 0.5 (hacim / hacim) arasında küçük bir hacme (1 mi), kemik iliği, ısı ile inaktive edilmiş FBS süspanse edin. hücreleri buz üzerinde tutun.
- Her kemik iliği durumun 10 ul örnek almak ve bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücreleri sayın. 1 varsayarsak - alıcı başına 2 donör, verim alıcı fare başına en az 4 x 10 6 hücre aktarmak yeterli olacaktır. fare başına 300 ul - 200 enjekte PBS +% 0.5 (hacim / hacim) ısı ile inaktive edilmiş FBS yeterli hacimde kemik iliği süspanse edin.
- Bir transdüksiyon verimliliği en az 2 x 10 6 hücre enjekte% 25 intravenöz fare başına (8 x10 6 hücre kadar enjekte edebilir).
NOT: Biz rutin kemik iliği hücrelerinin iki adet 6-kuyucuğu başına beş alıcı fareler enjekte edilir. Verim önemli ölçüde daha düşük olması durumunda, yeterli kemik iliği sayısı elde edilene kadar, daha fazla verici farenin kullanılmalıdır. Uygun sulandırma elde etmek için, en az 5 x 10 5 kalıt (pozitif flüoresan), her bir alıcı enjekte edilmelidir.
- Bir transdüksiyon verimliliği en az 2 x 10 6 hücre enjekte% 25 intravenöz fare başına (8 x10 6 hücre kadar enjekte edebilir).
- Bir mikro pipet ile, her kemik iliği durumun 10 ul örnek almak ve flüoresan işaretleyici (Şekil 1A) 11 sentezlenmesi göre akış sitometrisi ile transdüksiyon verimliliği analiz eder.
Not: Genellikle, floresan pozitif hücrelerin yüzdesi yapısı ve retroviral titresi bağlı olarak,% 25 ve% 70 arasındadır. Gerekli transduse kemik iliği hücre sayısı bir alt ölümcül ışın fare transdüksiyon verimliliği bağlı olarak değişebilir tekrar oluşturmak için. tran düşüksduction verim, daha fazla kemik iliği hücreleri gerekli tersine, kemik iliği transdüksiyon etkinliği daha yüksek hücre daha az sayıda sulandırma için gereklidir. % 25 altında İletimi verimliliği optimal ve yetersiz sulandırma ve hayatta kalma neden olabilir. Optimal kemik iliği kurtarma ve transdüksiyon verimliliği sağlamak üzere, taze hazırlanmış doku kültür ortamı ve sitokinlerin kullanılması. Retrogenic sistemini kullanan yeni bir TCR ifade ederken, in vivo olarak bu TCR seçimi bilinmemektedir. Her TCR afinite bağlı olarak, timus ve periferal T hücre ifadesi TCR seçimi 17 değişecektir.
14. Fare Işınlama, Kemik İliği Enjeksiyon ve Bakım
- farelere kemik iliği enjeksiyonu gün önce (Adım 13 ile aynı gün) ışın tedavisi. Aşağıdaki dozların kullanılması: C57BL / 6 fareleri (ve diğer yabani tip suşlar), 900 rad; Rag1 - / - fareleri, 500 rad, SCID fareleri, 300 rad).
- Amoksisilin üzerinde yer alan fareler (50 mg / kg / gün) veya ışınlama önce başka antibiyotik su arıtma, ve kemik iliği enjeksiyonu sonrası ilk iki hafta boyunca antibiyotik üzerinde tutmak.
NOT: Optimal ışınlama dozu ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir.
- Amoksisilin üzerinde yer alan fareler (50 mg / kg / gün) veya ışınlama önce başka antibiyotik su arıtma, ve kemik iliği enjeksiyonu sonrası ilk iki hafta boyunca antibiyotik üzerinde tutmak.
- Enjeksiyon için, enjeksiyondan hemen önce, sonra, enjeksiyon için 27-gauge iğne değiştirmek hava embolisi önlemek için herhangi bir havayı dışarı atmak künt iğne kullanılarak 1 ml şırınganın içine Adım 13.1 hücreleri yükleyin. bir ısıtma lambası altında ısı fareler ve intravenöz fare başına kemik iliğinin 0.2 ml enjekte edilir.
NOT: Hücreler uzun süre veya yerleşmek hücrelerin şırınga oturup izin vermeyin. - sağlıklı kalmasını sağlamak için haftalık fareler izleyin.
- 5 sonra - 6 hafta, GFP + / Ametrine + ve TCR birlikte ifadesi, (Şekil 1B) 11 dayanarak sulandırılacak kontrol fareleri boşaltma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik iliği Örnek kemik iliği transdüksiyon şekil (Şekil 1A) içinde kuyruk damarı içinden iv enjekte edilmeden önce, kemik iliği transdüksiyon verimliliği edilen kemik iliği, yaklaşık 10 ul 100 ul ilave edildi, protokol aşama 13.3 kontrol edilir PBS ve Ametrine ifadesi için analiz edilmiştir. Genel olarak, floresan pozitif hücrelerin yüzdesi yapısı ve retroviral titresi bağlı olarak,% 25 ve% 70 arasındadır. 6 hafta kemik iliği enjeksiyondan sonra, farenin kemik iliği sulandırma (Şekil 1B) belirlenmesi için kan alınır. Yaklaşık periferik kan 25 ul kırmızı hücre lize ve anti-TCRβ ile boyanmıştır. Şekil 2B'de, bütün TCR pozitif hücrelerin buna paralel Ametrine floresan proteini ifade eder.
FiguKemik İliği İletimi ve Periferik TCR Retrogenic T hücrelerinin 1. Örnek yeniden. kemik iliği hücrelerinin A) İletimi verimlilik kemik iliği transferi gününde floresan işaretleyici (Ametrine) dayalı analiz edilir. toplanan kemik iliği yaklaşık 10 | il PBS 100 ul ilave edildi ve Ametrine ifadesi için analiz edildi. Başarılı bir kemik iliği transdüksiyon% 25 ve% 70 b.) 6 hafta kemik iliği sulandırma sonrası periferik kan TCR retrogenic T hücrelerinin, Örnek arasındaki floresan pozitif hücrelerin yüzdesi sağlayacaktır. Periferal kan elde edildi ve kırmızı kan hücreleri, RBC liziz tamponuyla lize edildi. Geri kalan hücreler TCRβ için boyandı. Ametrine ifade ve 6 hafta kemik iliği sulandırma sonrası boyama, anti-TCRβ Temsilcisi analizi. T büyük halini görmek için tıklayınızOnun rakam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolde, optimal kemik iliği sağlık, transdüksiyon verimliliği ve sulandırma sağlamak için detay birkaç kritik adımlar biz. İlk kritik bir adım üretimi ve GP + E86 viral üretici hücrelerin uygun bakım olduğunu. erken geçiş üretici hücre çizgileri kullanın% 80 birleşme ya da daha düşük, kullanımdan önce en korumak. 48 saat - taze GP + E86 viral üretici hücreleri yaparken, 293T hücreleri erken geçiş ve 24 için kültüründe büyüyen sağlamak. transdüksiyon aşaması esnasında çok fazla GP + E86 hücrelerini Kaplama viral titresi düşürecektir. GP + E86, sağlam viral üretici sağlamak için Holst ve ark. 11 'de tarif edildiği gibi viral titresi belirlenir. Buna ek olarak, hasat edilen kemik iliğinden, kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırılması transdüksiyon verimliliği artırır. Kemik iliği atalarıdır sağlığını sağlamak protokole başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu amaçla, her zaman taze ortam sonra (FCS ile takviye edilmiş, 4 ° C de en az 4 hafta) ve taze sitokinler (daha az kullanmak2 hafta daha), 4 ° C'de tutulduğunda. Bu çözelti içinde bir kez heksadimetrin bromit, her 2 ayda da bozulmaya karşı hassastır ve taze olarak yapılmalıdır. optimal kemik iliği sağlığı ve naklini sağlayacak Diğer detaylar sıkma iletimi önce santrifüj öncesi ısınma bulunmaktadır. 37 ° C'de Spin-transduce ve mümkün olduğunca gaz değişimi azaltmak için plastik wrap ile plakaları sarın. Ayrıca, kemik iliği 37 ° C inkübatör dışında veya hücre ölümünü artırır ve kemik iliği naklini ve sulandırmadan düşecektir bu kadar uzun süre boyunca buz üzerinde oturup izin vermeyin. kemik iliği hücreleri Gün 4 (adım 13) hasat edildikten sonra, sadece hemen farelere enjekte önce şırınga yükleyin. Son olarak, fareler ışınlama gün önce ya da antibiyotik gün yerleştirilir emin olun.
Bu retroviral transdüksiyon protokolünün kullanımı ile sonuçlanan kemik iliği projenitör hücrelerinin transdüksiyonu sağlarT hücresi reseptörü retrogenic farelerin oluşturulması. Retrogenic fareler TCR transgenik fareler ve tek bir TCR transgenik üreten çok daha az maliyetle daha üretmek için daha hızlıdır. Ancak, retrogenic fareler yetiştirilen edilemez ve mutlaka her bir deney 10 ile yeniden oluşturulur. Periferik T hücrelerinin sayısı, ancak TCR'nin düzenlenmesi TCR retrogenic ve TCR transgenikleri 10 ile karşılaştırılabilir TCR transjenik farelerde görülen daha retrogenic farelerde daha düşüktür. TCR retrogenic sistemi, aynı koloni içerisinde ve hatta aynı deneyde çok TCRlerin ekspresyonuna izin verir. Burada anlatılan TCR retrogenic protokolü kullanarak test etmek ve çok sayıda yeni tanımlanan MHC sınıf I ya da II sınırlı TCRlerin geliştirilmesi ve özelliğe taranması için bir araştırmacı sağlar. "Insanlaşmış fare" modelinin 18,19 gelişmesiyle birlikte, TCR retrogenic daha klonlanmış insan TCRler kullanılarak genişletilebilir. Buna ek olarak, Şekil 2A konstruktları c bağlanmışBir da CD3 zincirleri, interlökinler ve kimerik antijen reseptörlerinin 20-24 dahil olmak üzere diğer çoklu proteinleri incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma MLB, BCM'deki Diyabet Araştırma Merkezi (P30-DK079638) Pilot / Fizibilite Programı, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA NIH (5K22A1119151-01 ve 1R56DK104903-01) hibe ile desteklenmiştir 1-15-JF-07, İmmünoloji MB Bursu ve Robert ve Janice McNair Vakfı'nda AAI Kariyer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
