Introduction
T-cellereseptoren (TCR) repertoar av mennesker og mus har blitt anslått til 1 x 10 8 og 2 x 10 6 unike TCR henholdsvis 1,2. Denne store mangfoldet tillater T-celler til å gjenkjenne et bredt spekter av antigen-epitoper som stammer fra selv-peptider, så vel som fra patogener som presenteres av hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) på antigenpresenterende celler (APC). De små forskjeller i interaksjoner av TCR med unike peptid-MHC-komplekser diktere hvorvidt en T-celle vil gjennomgå apoptose, anergi, aktivering, differensiering, cytokinproduksjon eller cytotoksisitet. Men på grunn av den store TCR repertoar, analyse av hvordan en spesifikk TCR vil reagere på et spesielt antigen krever bruk av enkelt TCR-systemer.
Forskjellige TCR-transgene mus som har blitt generert for å studere funksjonen av en enkelt TCR i en in vivo-modell 3-9. Det er imidlertid begrensninger til TCR transgene mus inkludertmåltid, lengden av tid å generere en enkelt transgene mus og den såkalte legger effekten av tilfeldig transgenet innføring i kimlinje DNA 10. Derfor har relativt få TCR gene mus blitt generert for en gitt antigen og de funksjonelle konsekvensene av høy og lav TCR affinitet for samme epitop er sjelden adressert. For å møte behovet for en hurtig tilnærming til skjermen og studere flere TCR enkeltvis eller i kombinasjon, har retrogenic ( 'retro' fra retrovirus og 'fremkallende' fra transgen) mus vært benyttet som et alternativ til TCR transgene mus 11-13.
2A peptid konsensusmotiv innenfor flere virus består av et 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, hvor spaltningen oppstår mellom glysin av 2A og prolin til 2B fra cis -acting hydrolase aktivitet, noe som resulterer i ribosomalt hopping under oversettelse 10,14-16. For en detaljert diagram som viser cleavage av de forskjellige 2A peptider (F2A, E2A, T2a og P2A) henvises det til referansene 10 - 12. På denne måte, 2 cistroner (TCR alfa- og beta TCR) kan kobles som resulterer i støkiometrisk translasjon i en enkelt vektor. Utnytte denne tilnærmingen, er vi i stand til å uttrykke og direkte sammenligne flere antigen spesifikke TCR in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alt er gjort for å holde dyr ubehag eller stress til et minimum under bestråling og halen vein injeksjoner. Mus brukes som en kilde av celler i disse eksperimentene; som sådan er det ingen rutiner eller manipulasjoner bortsett fra aktiv dødshjelp. Mus vil bli avlivet ved CO 2 innånding fulgt ved halshugging for å bekrefte dødsfallet. Denne fremgangsmåten er i tråd med anbefalingene fra panelet på Avliving av American Veterinary Medical Association.
1. Forbered Retroviral Konstruer
- Sub-klone den T-celle-reseptor (TCR) alfa- og betakjedene, adskilt av et 2A linker, til et MSCV-basert retroviral vektor 11 (f.eks pMIAII eller pMIGII) 11.
MERK: 2A linker tillater støkiometrisk og overensstemmende ekspresjon av alfa- og beta TCR-kjeder fra en enkelt åpen leseramme. Vektoren omfatter en IRES fluorescerende protein kassett (ametrine eller GFP) som brukes til åspore transduced celler og transduksjon effektivitet. For en detaljert protokoll se Holst et al. 11 - Isoler Plasmid DNA ved hjelp av kommersielt innhentet plasma prep kit eller et lignende produkt. Bruk en arbeidsgruppe konsentrasjon på 1 - 2 mikrogram ul -1.
2. Generering av Retrovirale Produsent cellelinjer
- Utnytte en to-trinns prosess for å fremstille retrovirale produsent-cellelinjer.
MERK: For en detaljert protokoll, kan du se Holst et al 11..- Generere retrovirus ved transient transfeksjon av 293T celler med tre plasmider (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) og vektor av interesse 11) og ta retroviral supernatanten fra 293T celler til transduce GP + E86 ekotropisk retroviral produsent cellelinje.
- Isoler topp 40% av fluorescerende uttrykker GP + E86 produsent celler ved FACS og forplante transdcuced-GP + E86 produsent celler som en kilde til virus.
MERK: generasjonenmed høy titer produkt er kritisk for effektiv transduksjon av benmargsceller. For en fullstendig protokoll kan du se Holst et al. 11
3. Retrovirus-mediert Stem Cell Gene Transfer (Dag -5)
- Tine opp og kultur 0,5 -1,0 x 10 6 av hver GP + E86 produsent cellelinje i fullstendig DMEM 10% (vol / vol) FBS å gi tilstrekkelig vekst for to konfluente 150 mm plater av Dag 0 av denne protokollen.
MERK: Tining 0,5 til 1,0 x 10 6 av hver GP + E86 produsent-cellelinje i en 10 cm plate vil tillate 30 - 50% konfluens på dag 5. Dette gir også mulighet for 5 dagers dyrking, for å utvide den GP + E86 produsentcellelinjer til to konfluente 150 mm plater av dag 0.- Kultur retrovirale produsent-cellelinje i fullstendig vev kulturmedium inneholdende 5% feta kalveserum, og ciprofloksacin (10 ug / ml) for å unngå forurensning mycoplasma.
MERK: Ikke bruk av ciprofloksacin ved frembringelseg viral supernatanten for benmargsoverføring. Unngå overvekst av produsent-cellelinje, da dette vil ha en negativ innvirkning benmarg transduksjon effektivitet.
- Kultur retrovirale produsent-cellelinje i fullstendig vev kulturmedium inneholdende 5% feta kalveserum, og ciprofloksacin (10 ug / ml) for å unngå forurensning mycoplasma.
4. Injiser Donor mus med 5-fluorouracil (5-FU) (Day -3)
- Veie donor-mus (5 - 12 uker gamle) for å bestemme mengden av 5-FU nødvendig. Ved hjelp av mus yngre enn 5 uker gamle resulterer i lav benmarg yield. For å sikre uttrykk for en enkelt TCR, bruke en T-celle mangelfull musestamme som SCID, RAG eller TCR alfa mangelfull mus som beinmargsdonorer.
- Arbeider i vevskultur hette, fortynne 5-FU lager med steril PBS for å lage en tilstrekkelig mengde av 10 mg ml -1 arbeidsløsning av 5-FU for å gi 0,15 mg 5-FU per gram kroppsvekt.
- Anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 37 G nål, intraperitonealt å injisere 0,15 mg 5-FU per gram kroppsvekt pr donor mus.
MERK: Bruk en donor mus per én mottaker til å begynne og justereantall donor mus i henhold til den celleutbyttet. En alternativ metode til 5-FU-behandling for anriking og isolering av benmarg forløpere er negativ seleksjon av avstamning-positive celler som beskrevet i Viret et al.
5. Bone Marrow Extraction Procedure (dag 0)
- Skaff disseksjon saks og pinsett for bein isolasjon. Tilberede media (HBSS supplert med 5% FCS (volum / volum)) til å samle bein i et 50 ml konisk rør. Hold 50 ml konisk inneholder media på is. Avlive mus ved CO 2 innånding fulgt ved halshugging for å bekrefte dødsfallet. Knip labben for å sikre at det ikke oppdages reflekser.
- Sterilisere kirurgiske området og kirurgiske verktøy med etanol eller metanol. Ta av femur, tibia, humerus, og bekkenet nøye ved først å kutte opp og under bekkenet. Kutt ned igjen langs femur til tibia. Fjern alle omkringliggende vev ved hjelp av saks og pinsett for å skaffe rent bein. Beholdeben hydrert i HBSS + 5% (volum / volum) FBS.
- Skill bein ved å kutte i leddene, og pass på å klippe begge ender av hver bein. Sette inn en 25-gauge nål festet til en 10 ml sprøyte inneholdende HBSS + 5% (volum / volum) FBS. Påfør trykk og tømme hele benmarg gjennom en 70-mikrometer sil hvile i en 50 ml konisk.
- Med jevne mellomrom, presse benmargen gjennom 70-mikrometer filter ved hjelp av stempelet fra en 1 ml eller 3 ml sprøyte. Skyll silen med HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dette vil sikre en enkeltcelle-suspensjon som er fri for beinrester og vev. Hold celler steril ved å utføre prosedyren i en steril hette.
- Sentrifuger benmargceller ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
6. Bone Marrow kultur (dag 0)
- Dekanter eller aspirer media og resuspender cellepelleten i 1 ml ammoniumklorid basert rødt blod lysis buffer (eller RBC lysis buffer tilsvarende) per 50 ml konisk rør. Etter 1 min inkubasjon ved værelsestemperatur, slukker den røde cellelyseringsbuffer ved tilsetning av 10 ml komplett DMEM 20% (volum / volum) FBS.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Dekanter eller aspirer supernatanten og resuspender benmarg i 5 ml komplett DMEM 20% (vol / vol) FBS. Telle celler med et Neubauer tellekammer.
MERK: General utbytte bør være ca 5-10 x 10 6 celler per mus; imidlertid, kan utbyttet variere blant forskjellige stammer av mus. - Plate benmargceller ved en tetthet på 4 x 10 7 celler pr 150 mm skål i 30 ml komplett DMEM 20% (volum / volum) FBS supplert med IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) og SCF (50 g ml-1).
MERK: Bruk ferskt tint-porsjonert cytokiner. Ikke bruk cytokiner som har vært frosset og tint mer enn en gang eller holdt ved 4 ° C i mer enn 2 uker. - Inkuber benmarg over natten (ca. 24 timer) ved 37 ° C med 5% CO2.
- Plate 3 x 10 6 retrovirale produsent celler pr 150 mm skål i 18 ml komplett DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Inkuber retrovirale produsentceller ved 37 ° C over natten. Forutse en 150-mm plate for 15 millioner benmargceller (ca. 2 - 3 giver mus).
8. Retroviral Supernatant (dag 1)
- Neste dag (ca. 24 timer senere), høster retrovirale supernatanten fra produsent plater (satt opp i trinn 7) ved å tegne opp retrovirale supernatanten direkte ut av 150-mm plate med en 10 ml sprøyte og filter ved hjelp av en 0,45 -μm sprøytefilter.
- erstatte forsiktig fjernet retrovirale supernatanten med 18 ml friskt komplett DMEM 20% (volum / volum) FBS.
- Supplere den filtrerte retrovirale supernatanten med IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) og Hexadimethrine bromid (polybren) (6 &# 956; g ml-1).
MERK: Hexadimethrine bromide bør gjøres fersk hver 2 måneder for å unngå et fall i effekt av retroviral transduksjon.
9. Bone Marrow Harvests (Dag 1)
- Etter å ha fullført trinn 8,3 og høste benmargceller i trinn 6,4 og overføre medier som inneholder ikke-heftende celler i sterile 50 ml rør.
- Vask platene kraftig med 10 ml PBS og samles i 50 ml konisk fra trinn 9.1. Om nødvendig, gjenta vasketrinnet.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C, dekanter supernatanten, resuspender cellene i et lite volum (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (vol / vol) FBS, og telle. Forutse 50-75% gjenvinning fra dag 0. Resuspender benmarg ved 1 x 10 6 celler pr 1 ml av den retrovirale supernatanten inneholdende cytokiner og Hexadimethrine bromid.
10. Bone Marrow Transduksjon (Dag 1)
- Plate retrovirale supernatanten / bein marrow blanding ved et volum på 3 ml pr brønn i en seks-brønns vevskulturplate. Pakk platene i plastfolie for å minimere gassutveksling under sentrifugering i trinn 10.2.
- Spinn innpakket seks-brønns plater ved 1000 xg i 60 min ble en 37 ° C.
- Etter spinningen er fullført, fjerner plastfolie og legg platene i en 37 ° C CO 2 inkubator i 24 timer.
11. Retroviral Supernatant og Transduksjon (Dag 2)
- Etter 24 timer, samle frisk viral supernatant fra det virale produsent-cellelinje. Filtrer den retrovirale supernatant ved anvendelse av en 10 ml sprøyte og en 0,45-um sprøytefilter. Supplere den filtrerte retrovirale supernatanten med IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) og SCF (50 g ml-1) og Hexadimethrine bromid (6 g ml-1).
- Deretter forsiktig fjerne med pipette eller aspirer toppen 2 ml media fra hver brønn på seks-brønns plate som inneholder benmargceller.
MERK: Arbeidet forsiktig for ikke å suge benmargen, som vanligvis er konsentrert i midten av brønnen. Alternativt kan den fjernes supernatanten spinnes ned å gjenopprette eventuelle tapte benmargceller. - Til hver brønn i benmargen 6-brønns plate tilsett 3 ml frisk viral supernatant inneholdende cytokiner og Hexadimethrine bromid. Pakk platene i plast, og gjenta spin transduksjon ved 1000 xg i 60 min en 37 ° C. Pakke platene, og inkubere cellene ved 37 ° C og 5% CO2 over natten (ca. 24 timer).
12. Tilsetting av Fresh Supplert DMEM (Dag 3)
- Etter 24 timer, fjerne de øverste 2 ml media fra hver brønn på seks-brønns plate som inneholder benmargceller, som i trinn 11.2. Erstatte den fjernede media med frisk DMEM 20% (volum / volum) FBS supplert med sluttkonsentrasjoner av IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) og SCF (50 g ml-1) .
- Inkuber benmargplater ved 37 ° C CO2-inkubator i ytterligere 24 timer.
13. Harvest-transduced Bone Marrow (Dag 4)
- Etter 24 timer, samle benmargceller fra de seks-brønns plater. Vask platene kraftig med PBS for å fjerne alle ikke-adherente celler.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C, og dekanter supernatanten.
- Resuspender benmargen i et lite volum (1 ml) i PBS + 0,5% (vol / vol) varmeinaktivert FBS. Hold celler på is.
- Ta en 10 pl prøve av hver benmarg tilstand og telle celler ved hjelp av et Neubauer tellekammer. Forutsatt 1-2 donor per mottaker, vil avkastningen være tilstrekkelig til å overføre minst 4 x 10 6 celler per mottaker mus. Resuspender benmargen i et tilstrekkelig volum av PBS + 0,5% (vol / vol) varmeinaktivert FBS å injisere 200 - 300 mikroliter per mus.
- Injiser minst 2 x 10 6 celler med en transduksjon effektivitet25% (kan injisere inntil 8 x10 6 celler) per mus intravenøst.
MERK: Vi rutinemessig injisere fem mottaker mus per to seks-brønns plater av benmargceller. Hvis avkastningen er vesentlig lavere, bør flere donor mus brukes før tilstrekkelig benmargs tallet kan hentes. For å oppnå optimal rekonstitusjon, minst 5 x 10 5 transdusert (fluorescerende positiv) skal injiseres inn i hver mottaker.
- Injiser minst 2 x 10 6 celler med en transduksjon effektivitet25% (kan injisere inntil 8 x10 6 celler) per mus intravenøst.
- Med en mikro pipette, ta en 10 pl prøve av hver benmarg tilstand og analysere transduksjon effektivitet ved hjelp av strømningscytometri basert på ekspresjon av det fluorescerende markør (figur 1A) 11.
MERK: Generelt er prosentandelen av positive celler fluorescerende mellom 25% og 70%, avhengig av konstruksjonen og retrovirale titer. Antallet transduserte benmargceller er nødvendig for å rekonstituere en sub-letalt bestråle mus kan variere avhengig av transduksjon effektivitet. Jo lavere transduction effektivitet, de mer benmargceller nødvendig, og omvendt, jo høyere benmargen transduksjon effektivitet, lavere antall celler som kreves for rekonstituering. Transduksjon effektivitet under 25% er suboptimal, og kan resultere i utilstrekkelig rekonstituering og overlevelse. For å sikre optimal benmarg utvinning og transduksjon effektivitet, bruker nylagde vev kultur media og cytokiner. Ved å uttrykke en ny TCR utnytte retrogenic system, er valget av den TCR in vivo ukjent. Avhengig av hver enkelt TCR affinitet, vil TCR utvalg i thymus og perifere T-celle uttrykk varierer 17.
14. Mouse Bestråling, Bone Marrow Injection og omsorg
- Bestråler mus dagen før benmarg injeksjon (Samme dag som trinn 13). Bruk følgende dosering: C57BL / 6 mus (og andre villtype stammer), 900 rads, Rag1 - / - mus, 500 Rads, SCID-mus, 300 rad).
- Plasser mottaker mus på Amoxicillin (50 mg / kg / dag) eller et annet antibiotikum vannbehandling før bestråling, og holder på antibiotika for de to første ukene etter benmarg injeksjon.
MERK: Optimal bestråling dosen må bestemmes empirisk.
- Plasser mottaker mus på Amoxicillin (50 mg / kg / dag) eller et annet antibiotikum vannbehandling før bestråling, og holder på antibiotika for de to første ukene etter benmarg injeksjon.
- For injeksjon, laste cellene i trinn 13.1 inn i en 1 ml sprøyte med butte nåler umiddelbart før injeksjon, og deretter endre nålen til 27-gauge for injeksjon, Fjern all luft for å unngå luftemboli. Varme mus i henhold til en varmelampe og injisere 0,2 ml benmarg per mus intravenøst.
MERK: Ikke la cellene sitte i sprøyten i lengre tid eller cellene vil slå seg ned. - Overvåke mus ukentlig for å sikre at de forblir friske.
- Etter 5 - 6 uker, blø musene for å se etter rekonstituering på basis av GFP + / + ametrine og TCR ko-ekspresjon (figur 1B) 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benmarg transduksjon effektivitet blir kontrollert i trinn 13,3 i protokollen før benmargen er injisert inn i halevenen iv I den representative benmargen transduksjon figur (figur 1A), ca. 10 ul av det høstede beinmargen ble tilsatt til 100 pl av PBS og analysert for ekspresjon ametrine. Generelt er prosentandelen av fluorescerende positive celler er mellom 25% og 70%, avhengig av konstruksjonen og retrovirale titer. Etter 6 uker benmarg injeksjon blir musene tappet for blod for å bestemme benmarg rekonstitusjon (figur 1B). Omtrent 25 ul av perifert blod ble røde celler lysert og farget med anti-TCRβ. I figur 2B alle TCR positive celler concordantly uttrykke ametrine fluorescerende protein.
Figure 1. Eksempel på Bone Marrow Transduction og Peripheral TCR Retrogenic T-celler. A) Transduksjon effektiviteten av benmargceller er analysert basert på fluoriserende fargestoff (ametrine) på dagen for benmargsoverføring. Omtrent 10 pl av det høstede beinmargen ble tilsatt til 100 ul av PBS og analysert for ekspresjon ametrine. En vellykket benmargsoverføringen vil gi en prosentandel av fluorescerende positive celler mellom 25% og 70%. B) Eksempel på TCR retrogenic T-celler i perifert blod 6 uker etter benmargs rekonstituering. Perifert blod ble erholdt og røde blodceller ble lysert med RBC lyseringsbuffer. De resterende cellene ble farget for TCRβ. Representant analyse for ametrine uttrykk og anti-TCRβ farging 6 uker etter benmargs tilberedning. Klikk her for å se en større versjon av thans skikkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollen vi detalj flere viktige skritt for å sikre optimal benmarg helse, transduksjon effektivitet og tilberedning. Første kritiske trinn er produksjon og vedlikehold av GP + E86 viral produsentceller. Bruk tidlig passasje produsentcellelinjer og vedlikeholde ved 80% konfluens eller lavere før bruk. Når du lager ferske GP + E86 viral produsentceller, sikre 293T celler er tidlig passasje og vokser i kultur for 24-48 timer. Plating for mange GP + E86 celler under transduksjon trinnet vil senke viral titer. Bestem viral titer som beskrevet i Holst et al. 11 for å sikre GP + E86 er robuste virusprodusenter. I tillegg, fjerning av røde blodceller fra det høstede beinmargen forbedrer transduksjon effektivitet. Å sikre helsen til beinmargsstamfedre er avgjørende for å lykkes i protokollen. For å oppnå dette, må du alltid bruke friske medier (mindre enn 4 uker ved 4 ° C etter supplert med FCS) og friske cytokiner (mindreenn 2 uker når det oppbevares ved 4 ° C). Hexadimethrine bromid er også følsomme for degradering og bør gjøres frisk, når den er i oppløsning, hver 2 måneder. Andre detaljer som sikrer optimal benmarg helse og transduksjon inkluderer forvarme sentrifuge før spinn transduksjon. Spin-transduce ved 37 ° C og pakk plater med plastfolie for å minske gassutveksling så mye som mulig. Også, ikke la benmargen sitte ute av 37 ° C inkubator eller på is i lengre tid da dette vil øke celledød og redusere benmargsoverføring og tilberedning. Etter at benmargceller har blitt høstet på dag 4 (trinn 13), bare laste sprøytene umiddelbart før injisere mus. Til slutt, sørge for at mus er plassert på antibiotika dagen før eller dagen av bestrålingen.
Utnyttelse av dette retrovirus-mediert transduksjon protokollen tillater for transduksjon av stamceller i benmarg resulterer igenereringen av T-celle-reseptor-retrogenic mus. Retrogenic mus er raskere å generere enn TCR transgene mus og kostnadene betydelig mindre enn å generere en enkelt TCR transgen. Imidlertid kan retrogenic mus ikke brukes i avl, og må genereres på nytt med hvert forsøk 10. Antallet av perifere T-celler er lavere i retrogenic mus enn vist i TCR-transgene mus, men reguleringen av TCR er sammenlignbar mellom TCR retrogenic og TCR-transgene 10. TCR retrogenic Systemet tillater ekspresjon av multiple TCR innenfor samme koloni og til og med innenfor samme eksperiment. Utnytte TCR retrogenic protokollen beskrevet her åpner for en etterforsker for å teste og skjermen utvikling og funksjonaliteten til mange nylig identifiserte MHC klasse I eller II begrenset TCR. Med utviklingen av "humaniserte mus" modell 18,19, kunne den TCR retrogenic videre utvides anvendelse av klonede humane TCR. I tillegg, 2A knyttet konstruerer cen også brukes til å studere andre multi-proteiner, inkludert de CD3-kjedene, interleukiner og kimære antigen-reseptorer 20-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (5K22A1119151-01 og 1R56DK104903-01) til MLB, Pilot / Mulighets Program av Diabetes Research Center (P30-DK079638) på BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI stillinger i immunologi Fellowship til MB, og Robert og Janice McNair Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
