Summary
Fremgangsmåde til identificering af botanisk materiale arter ved direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri og multivariate statistisk analyse præsenteres.
Abstract
Vi viser, at direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri kan anvendes til at fremstille massen spektrale profiler af botanisk materiale, og at disse kemiske fingeraftryk kan anvendes til identifikation plantearter. De massespektraldata kan erhverves hurtigt og på en high throughput måde uden behov for prøveudtagningen derivatisering eller pH-justering trin. Brugen af denne teknik omgår udfordringer, som mere konventionelle teknikker, herunder langvarig kromatografi analyse tider og ressourcekrævende metoder. De høje gennemløb kapaciteter af direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri-protokol, kombineret med multivariat statistisk analyse bearbejdning af dataene, giver ikke kun klasse karakterisering af planter, men også give arter og information sorter. Her er teknikken demonstreret med to psykoaktive planteprodukter, Mitragyna speciosa (Kratom) og Datura(Jimsonweed), der blev udsat for direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri efterfulgt af statistisk analyse bearbejdning af massen spektrale data. Anvendelsen af disse værktøjer i tandem aktiveret anlægget materialer, der skal hurtigt identificeres på det niveau af sort og arter.
Introduction
I årtusinder har psykoaktive naturlige produkter blevet brugt i shamanistiske ritualer, misbrugte deres sindsændrende attributter, og forbruges for deres medicinske egenskaber. Indtagelse af disse planter og relaterede plante-baserede stoffer kan være betydelige i områder, hvor de er endemiske, og de har sociale og økonomiske betydning. For nylig har der imidlertid været en dramatisk stigning i brugen af disse "naturlige" stoffer på grund af den lette tilgængelighed gennem internet-handel. Opfattelsen, at disse stoffer er sikre at bruge, kombineret med en øget slået hårdt ned på besiddelse og brug af mere traditionelle misbrugsstoffer og syntetiske stoffer, har bidraget til stigning i misbrug af plante-baserede lægemidler. Det er generelt vanskeligt ved visualisering at skelne mellem disse produkter og harmløse plantemateriale, og der er derfor interesse i at udvikle metoder, som kan anvendes identificere disse produkter. Dog konventionelle analysemetoder til anlægidentifikation arter er tidskrævende og upraktisk at udføre. Desuden metoder udviklingsprocessen er tid og ressourcekrævende. Disse faktorer har gjort crafting af lovgivning for at bremse brugen af disse stoffer halter langt bagefter hastigheden af optrapning i deres misbrug. Der er således nogle love, der regulerer produktion, fremstilling, salg og forbrug af mange af disse naturlige psychoactives og som sådan, der er hundredvis af planter af misbrug tilgængelig for brugere i tusindvis af forskellige former. 1,2
To sådanne plantebaserede misbrugsstoffer er Mitragyna speciosa, almindeligvis kendt som Kratom, og planter fra Datura slægten, nemlig D. stramonium, D. ferox og D. inoxia. Kratom og Datura er uplanlagt i USA, men Drug Enforcement Administration har opført både som lægemidler til bekymring. 3,4 Kratom er kendetegnet ved tilstedeværelsen af de psykoaktive stoffer mitragynine enND 7-hydroxymitragynin, samt andre ikke-psykoaktive alkaloider herunder mitraphyllin, paynantheine, corynoxeine, og rhynchophylline. 4-8 De psykoaktive egenskaber Datura spp. tilskrives atropin og scopolamin, men en række andre tropan alkaloider er blevet identificeret i planterne. 9-12 Både Kratom og Datura har været impliceret i forgiftninger og dødsfald, og deres identifikation er i stigende grad nødvendigt i både retsmedicinske og toksikologiske sammenhænge, som misbruget af disse produkter er stigende. 13-16
I det store, traditionelle metoder til analyse af retsmedicinske stof materiale, såsom farve tests, mikroskopi og Raman og infrarød spektroskopi, der bruges i en regel-in / regel-out formodede kapacitet. Koblede teknikker såsom GC-MS og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), er bekræftende analyse metoder baseret på sammenligning af profilerne af opdagede analyttertil videnskabelig arbejdsgruppe om analyse af beslaglagt narkotika (SWGDRUG) bibliotekets standarder. 17. De prøve behandlingstrin, der udføres før analyse, herunder pulverisering, ekstraktion, derivatisering og fordampning, kan føje timer til driftstid og forfalske prøven, 9,11 , 18,19 gøre analyse af botaniske stoffer mindre end ligetil i forhold til, at der for andre traditionelle misbrugsstoffer som kokain eller heroin. Desuden skal udvikles for hvert produkt af interesse, hvilket gør implementeringen af standardprocedurer protokoller for hver art eller forskellige plante-baserede stofmisbrug meget upraktisk for rutinemæssig sagsbehandling individuelle kromatografiske programmer.
Direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri er en omgivende ionisering massespektrometrisk teknik, der omgår nogle af de udfordringer, der er forbundet med konventionelle analysemetoder. Gasser, væsker, faste stoffer, pulvere, TLC-plader og anlæg materIAL kan alle analyseres direkte ved direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri, og både polære og ikke-polære forbindelser kan let påvises i komplekse matricer. 20-22 Endvidere har undersøgelser vist, at psykoaktive forbindelser kan hurtigt identificeres i plantemateriale ved direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri, og artsspecifikke oplysninger kan udledes statistisk bearbejdning af de massespektrumdata. 22-26
Her vil vi vise, at direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri kan bruges til hurtigt at vurdere forskellige plantematerialer (dvs. planter, pulvere og ekstrakter frø) for deres psykoaktive komponenter, og at de arter og sorter af plante- afledte produkter kan bestemmes i en hurtig og høj-throughput måde. Analysen af retsmedicinsk relevant botanisk materiale uden behov for prøveforberedelse trin eller lang kromatografiskanalyse driftstid, foruden identificeringen planteart rapporteres.
Protocol
1. Fremstilling af plantematerialer
- Kratom Fresh bladmateriale
- Brug en 6 mm hul diameter punch til at skabe ensartede Chads af Kratom blad materiale fra M. speciosa plante. Gentag 5 gange.
- Kratom Powder Extraction
- Bland 5 ml ethanol og 5 ml destilleret vand til at skabe 1: 1 opløsningsmiddelblanding til ekstraktion.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, suspendere en lille mængde (~ 5 mg) af Kratom Bali pulver i 1 ml af 1: 1 EtOH: H2O opløsningsmiddelblanding. Gentag 5 gange.
- Sonikeres Kratom Bali pulver ekstrakt prøver i ultralydsbad i 30 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Centrifuger Kratom Bali pulver ekstrakt prøver i 2 minutter ved 750 xg ved stuetemperatur.
- Dekanteres opløsningsmidlet fra tilbageværende pulver til efterfølgende analyse.
- Datura forberedelse frø
- Skær et D. Stramonium frø i halvdelen tværs af tværgående plan under anvendelse af et barberblad. Gentag anvendelse af 5 forskellige frø.
- Gentag for D. inoxia og D. Ferox frø.
2. Direkte Analyse i Real Time Ion Source Parametre
- Gasovn Temperatur
- Indstil gasvarmer temperatur ionkilden til 350 ° C.
- Ion-tilstand
- Gennemføre analysen i positiv ion-mode med gitter spænding på 250 V.
- Helium Gas Flow Rate
- Indstil helium gasstrømningshastighed til 2,0 L / sek.
3. Time-of-flight massespektrometer Parametre
- orifice Spændinger
- Indstil åbningen 1 spændingen til 20 V og åbningen 2 spænding til 5 V.
- Ring Lens og Peak spænding
- Juster ring linse spænding til 5V og ændre toppe spænding til 600 V.
- Mass Spectral Acquisition
- Sæt massen spektrale erhvervelse sats på en spektrum per sekund over en masse forskellige m / z 60-800.
- Mass Spectrometer opløsningsevne
- Indstil opløsningsevne af massespektrometeret til 6000 FWHM.
4. Analyse af plantematerialer
- Analyse af Kratom Leaf
- Tryk på "Start Kør" i massespektrometer kontrol software. Hæng chad af plantemateriale mellem ionkilde og massespektrometer indløb (ca. 2 cm fra indløbet) med en pincet, indtil et spektrum er opnået. Gentag 5 gange med separate Chads af plantemateriale.
- Kalibrer spektret med polyethylenglycol 600 (PEG).
- Dyp den lukkede ende af et smeltepunkt kapillarrør i PEG standard. Hæng coatede kapillær betwEen ionkilden og massespektrometeret indløb.
- Efter at have analyseret PEG standard, skal du vælge knappen "Stop" for at afslutte analytisk kørsel.
- Tryk på "Start Kør" i massespektrometer kontrol software. Suspender en lille mængde tørret bladmateriale mellem ionkilden og massespektrometer indløb med en pincet, indtil et spektrum opnås. Gentag 5 gange, analysere nyt plantemateriale hver gang.
- Kalibrer spektret med PEG.
- Dyp den lukkede ende af et kapillarrør i PEG standard. Suspendere overtrukket kapillarrør mellem ionkilden og massespektrometeret indløb.
- Efter at have analyseret PEG standard, skal du vælge knappen "Stop" for at afslutte analytisk kørsel.
- Analyse af Kratom Powder
- Tryk på "Start Kør" i massespektrometer kontrol software. Dyp den lukkede ende af smeltepunktskapillaret i Kratom pulver.
- Suspend den overtrukne kapillar mellem ionkilden og massespektrometer indløb indtil et spektrum opnås. Gentag analysen 5 gange med en ny kapillær hver gang.
- Kalibrer spektret med PEG.
- Dyp den lukkede ende af et kapillarrør i PEG standard. Suspendere overtrukket kapillarrør mellem ionkilden og massespektrometeret indløb.
- Efter at have analyseret PEG standard, skal du vælge knappen "Stop" for at afslutte analytisk kørsel.
- Analyse af Kratom ekstrakt
- Nedsænke den lukkede ende af et kapillarrør i ekstrakten.
- Suspender kapillarrøret i holderen 12-prøven på den lineære skinne fastgjort til massespektrometeret. Gentag 5 gange med en anden ekstrakt hver gang.
- Tryk på "Start Kør" i massespektrometer kontrol software. Brug af kontrolpanelet, skal du vælge knappen ">" for at fremme den lineære jernbane gennem ion strøm ved hastighed på 1 mm / sek tilindsamle spektre.
- Kalibrer spektret med PEG.
- Dyp den lukkede ende af et kapillarrør i PEG standard. Suspendere overtrukket kapillarrør mellem ionkilden og massespektrometeret indløb.
- Efter at have analyseret PEG standard, skal du vælge knappen "Stop" for at afslutte analytisk kørsel.
- Analyse af Datura frø
- Tryk på "Start Kør" i massespektrometer kontrol software. Hæng Datura frø halvdelen mellem ionkilde og massespektrometer indløb med en pincet, indtil et spektrum indsamles. Sørg for, at den afskårne side er orienteret til ansigt ion kilde. Gentag 5 gange, analysere en ny frø halv hver gang.
- Kalibrer spektret med PEG.
- Dyp den lukkede ende af et kapillarrør i PEG standard. Suspendere overtrukket kapillarrør mellem ionkilden og massespektrometeret indløb.
- Efter at have analyseret PEG standard,vælge knappen "Stop" for at afslutte analytisk kørsel.
- Gentag trin 4.4.1-4.4.3 for hver Datura arter.
5. Databehandling
- Oversættelse datafiler
- I databehandling software, vælge Filer, "Oversæt DART filer" med "automatisk kalibrering" tændt, for at skabe kalibrerede datafiler.
- Venstre klik og træk en boks omkring den første top i kromatogrammet og vælg "Average" for at oprette en gennemsnitlig spektrum.
- Højreklik og træk en boks omkring et område, hvor der ikke prøven er udtaget, og vælg "Average hele kasse som baggrund" for at trække baggrund fra gennemsnit spektrum.
- Gem massespektret som en .txt-fil.
- Gentag trin 5.1.1-5.1.4 for hver top i kromatogrammet for at skabe et gennemsnit spektrum for hver replikere i filen.
- Gentag trin 5.1.2-5.1.5 for hver fil indsamlet.
6. Statistisk analyse
- Principal Component Analysis
- I Klassificer afsnit af den spektrale analyse software (Se liste over materialer), i henhold til "Opsætning" fanen, skal du oprette klasser for databehandling ved at vælge "Tilføj Class".
- Importér tekstfiler data ved at vælge "Tilføj fil (er)".
- Tildel datafiler til den relevante klasse af planter ved at vælge tekstfiler og "Set klasse for valgte filer".
- Vælg funktion masserne for diskrimination fra MS fra Training Set og indstille Threshold% til 1%.
- Sæt en masse tolerance (MMU) til 10, og vælg "Build vektorer fra datafiler".
- I afsnittet "Compute", udføre principal komponent analyse ved at markere feltet for 3D PCA Graf og vælg "Beregn".
- Udfør leave-one-out cross validering ved at vælge "Validate (SLOW!)."
- I fanebladet Frequency Plot af den spektrale analyse software, generere et zonekort data ved at vælge "Heat Map".
- Vælg "Threshold gemte data" for at indstille overflod tærskel til 1%.
- Eksporter zonekort til et regneark ved at vælge "Gem Heat Kort til Excel."
- I regneark, gemme den eksporterede zonekort som en .txt-fil.
- Hierarkisk Clustering Analysis
- Importer zonekort som en .txt fil i Cluster 3,0 software.
- I den hierarkiske fanen Cluster 3,0, under Gener og Arrays, afkrydsningsfelter "Cluster" og "Beregn vægte". Set cutoff på 0,1 og eksponent til 1. Vælg enkelt kobling clustering til at udføre analysen.
- Se den genererede .cdt datafil i Java Treeview.
Representative Results
Repræsentative blød ionisering positiv-ion-mode direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri data for Kratom produkter og Datura frø er vist i figurerne 2 og 3. Forskellige forbindelser, som tidligere er isoleret fra M. speciosa, herunder mitragynine (C 23 H 30 N 2 O 4 + H +, m / z 399,2284) og 7-hydroxymitragynin (C 23 H 30 N 2 O 5 + H +, m / z 415,2233), blev påvist i alle fire prøver og de tilsvarende masse måledata er vist i tabel 1. 4-8 repræsentant Datura data er vist i figur 3 og underskrift biomarkører herunder atropin (C17 H 23 NO 3 + H +, m / z 290,1756) og scopolamin (C 17 H 21 NO 4 + H + M / z 304.1549) blev påvist i de tre arter. Masse måledata i forbindelse med figur 3 er vist i tabel 2. 9-12 Sammensatte identiteter blev bekræftet gennem grundstofsammensætning beslutsomhed, isotop matching, og sammenligninger til rapporter i litteraturen. 23-24
Heat map gengivelser af den direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri spektre af Kratom og Datura er illustreret i figur 4. De præsenterede data blev brugt i principal komponent analyse (PCA) til at skelne mellem de to klasser af plante-baserede lægemidler af misbrug (figur 5). PCA plot blev bygget ved hjælp af ti har masser (anført i tabel 3), med blå cirkler, der repræsenterer Kratom data og røde firkanter repræsenterer Datura data. De har masser udvalgte svarede til forskellige alkaloider stede iDatura eller Mitragyna spp., Herunder psykoaktive stoffer atropin, skopolamin, mitragynine og 7-hydroxymitragynin. 23-24 Tre hovedkomponenter udgjorde 75,26% af variansen og leave-one-out cross validering (LOOCV) var 100%. PCA plot viser klart, at Kratom data og Datura data godt opløst fra hinanden. PCA-analyse viste også, at de enkelte sorter af Kratom og de forskellige arter af Datura kunne identificeres og skelnes fra hinanden (figur 6). LOOCV var 94,29% med tre hovedkomponenter, der dækker 75,26% af variansen. De to sorter af Kratom (Bali i blå cirkler og Rifat i røde firkanter) klynge sammen, hvilket indikerer, at de tilhører arten M. speciosa, men løses fra hinanden, hvilket viser, at de repræsenterer forskellige sorter. Endvidere Datura arter samle og adskilt fra M. speciosa data, men hver af de enkelte arter af Datura (D. inoxia i grønne trekanter, D. stramonium i pink pladser og D. ferox i turkis cirkler), klart adskilles. Trods et datapunkt for D. stramonium synes at være en outlier, er frøet korrekt klassificeret som D. stramonium og ikke D. inoxia hjælp PCA. Vigtigst er det, at forskellen i frø farve mellem D. stramonium og D. inoxia bekræfter at de er forskellige arter, og at data pågældende punkt ikke kan være D. inoxia.
Hierarkisk klyngedannelse (figur 7) blev udført uden a priori udvalg af karakteristika masserne. I stedet blev hele gruppen af spektrale datasæt spænder over en masse forskellige m / z 60-800 importeret til open source genomisk klyngedannelse software og en dendrogram byder disse data blev produceret. Resultaterne of HCA afslørede også klasse, art og sort differentiering udelukkende baseret på direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri afledte data og bekræftede dem i PSA-analyse. De to klasser af plante-baserede misbrugsstoffer, Kratom og Datura, blev adskilt i individuelle clader af dendrogram. Desuden Rifat og Bali sorter af Kratom blev hver isoleret i individuelle sub-clader i Kratom klassen. Tilsvarende D. inoxia, D. ferox og D. stramonium blev løst i deres egne clader af arter inden for Datura klassen.
Figur 1. Billeder af M. speciosa (Kratom) produkter og Datura spp frø a: Bali Kratom tørret blad; b:.. Bali Kratom pulver; c: Rifat Kratom levende planter;
Figur 2. Direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri positiv-ion spektre af M. speciosa (Kratom) produkter a: Rifat friske blade, b:. Bali tørrede blade c: Bali pulver; d: Bali pulver ekstrakt. De masse måledata forbundet med disse spektre er vist i tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri positiv-ion spektre af Datura spp. . frø a: D. ferox b: D. inoxia c: D. stramonium. De masse måledata forbundet med disse spektre er vist i tabel 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Heat map gengivelser af den direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri spektre af Kratom og Datura plantematerialer. High intensitet toppe er vist i mørkerøde og lavere intensitet toppe er angivet i lysere nuancer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Principal komponent analyse (PCA) plot af Kratom og Datura produkter konstrueret ved hjælp direkte analyse i realtid højopløsningsmassespektrometri-afledte data. Tre hovedkomponenter (pc'er) tegnede sig for 75,26% af variationen, og leave-en- ud krydsvalidering (LOOCV) var 100%. De har masser, der anvendes til PCA er angivet i tabel 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Principal komponent analyse (PCA) plot af Kratom og Datura produkter ved hjælp af direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri data. Klasse opgaver var baseret på sort (Kratom) eller art (Datura) af plantematerialer. Tre hovedkomponenter (pc'er) tegnede sig for 75,26% af variationen og leave-one-out cross validering (LOOCV) var 94,29%. De har masser bruges til PCA er angivet i tabel 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Hierarkiske klyngedannelse resultater opnået ved hjælp af den direkte analyse i real timig-høj opløsning massespektrometri-afledte data fra analyse af Kratom og Datura plantematerialer. De to klasser af planter er klart adskilte i to forskellige grene i dendrogram (vist i blå og røde beslag til Kratom og Datura henholdsvis). De Datura frø arter er også løst fra hinanden (vist i grøn, turkis og pink stiplede kasser for D. inoxia, D. ferox, og D. stramonium henholdsvis). De Kratom plantematerialer er adskilt af sort (vist i rød og blå stiplede kasser til Rifat og Bali, henholdsvis). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Masse måledata forbundet med den bløde ionisering spektre af Kratom products præsenteret i figur 2. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 2. Mass måledata forbundet med den bløde ionisering spektre af Datura frø præsenteret i figur 3. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 3. Feature masser anvendes til principal komponent analyse plot af Kratom og Datura produkter vist i figur 5 og 6.
Discussion
Evnen til at identificere plantebaserede misbrugsstoffer er af stigende nødvendighed på grund af den dramatiske stigning i markedsføring, salg og forbrug af uplanlagte psykoaktive stoffer. 2 Traditionelle metoder til identificering af botanisk materiale normalt inddrage karakterisering af fysiske egenskaber kombineret med analyse af kemiske bestanddele ved bindestreg kromatografiske-massespektrometriske metoder. Imidlertid har begge disse fremgangsmåder giver vanskeligheder for strømlinet analyse. Fysiske træk fra planterne ofte ødelagt, når planterne er tørret, pulveriseret eller ekstraheret under fremstillingsprocessen, og som sådan, er det ofte vanskeligt at skelne en type af plante-baserede psykotropisk produkt fra en anden baseret på fysiske egenskaber alene. 23. Analyse ved kromatografiske-massespektrometriske metoder kan aktivere identifikation af de psykoaktive stoffer i vegetabilske matricer, men forberedelse prøve og metodeudvikling er gang ennd ressourcekrævende, og oprettelsen af nye protokoller for de enkelte klasser eller arter af plante-baseret stofmisbrug er upraktisk i mange retskemiske laboratorier.
Direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri omgår nogle af disse udfordringer, som komplekse matricer såsom blade, pulvere, ekstrakter og frø kan analyseres med lidt prøveforberedelse. På trods af de komplekse matricer af materialerne i stikprøven her, de psykoaktive bestanddele var lette at identificere, selv ved nanogram koncentrationer, 21 på grund af den høje følsomhed massespektrometeret. Frø, blade og pulvere blev påvist at være let analyseret ved direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri, og en række andre typer af materialer kan også udtages prøver på samme måde, herunder TLC-plader, valuta, tabletter, blomster, fastfase-mikroekstraktion (SPME) fibre og endog insekter puparial tarme. 21-22 Gennem nøjagtig masse analysis, grundstofsammensætning bestemmelse og isotop matching, biomarkører og forbindelserne af interesse kan identificeres, uanset om forbindelserne er indeholdt i et blad, spottet på en TLC-plade eller overtrukket på et kapillarrør.
kan anvendes direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri metode til strømlinet analyse som der er meget få parametre, der skal ændres fra eksperiment til eksperiment. Analyse kan udføres på positiv-ion eller negativ-ion-mode, og kan påvises molekyler på op til 3.000 amu i begge tilfælde. Ionisering i positiv-ion-mode opstår ved proton overførsel fra aktiverede vand klynger, 21 og helst forbindelse med en proton affinitet højere end vands vil blive ioniseret. Her blev positiv ion-mode anvendes på grund af den høje proton affinitet af alkaloider, som bevirker, at de let ioniseres ved protonering. Analyse i negativ-ion-mode kan anvendes til vellykket detektion af Hydrocarbons (som O 2 addukter) 21, eksplosive materialer 27 og organiske syrer, såsom artesunat i malaria medicin. 28. På grund af ionisering metode til proton-overførsel og den manglende evne til at producere multipelt ladede ioner, direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometriske spektrometri er hovedsageligt begrænset til analyse af små molekyler på op til 3000 amu.
Andre end ioniseringsmåde, temperaturen af ionkilden er en vigtig parameter og den passende temperatur afhænger i høj grad af den prøve, der analyseres. For eksempel er det vigtigt at anvende lavere temperaturer (~ 250 ° C) for SPME fiber analyse for at forhindre ødelæggelse af coatingmaterialet på fiberen, mens højere temperaturer (~ 500 ° C) bør anvendes til aminosyreanalyse til desorption og efterfølgende ionisering. Her blev plantemateriale analyser udført ved 350 ° C, da dette giver mulighed for ionisering af alkaloider og andre forbindelser af interesse medat forårsage pyrolyse af forbindelser i planten matrix.
Direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri analyse ikke alene muliggør identifikation af de psykoaktive bestanddele af plantematerialet baseret på nøjagtige masser, grundstofsammensætning beslutsomhed og isotop matching, men den producerer også unikke kemiske fingeraftryk, der kan udnyttes til identifikation af arter ved hjælp multivariate statistisk analyse med yderst reproducerbare resultater, selv med mindre datasæt. Multivariat statistisk analyse er blevet anvendt på en bred vifte af direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri data, herunder at stammer fra træ, puparial tarme, frø, blade materiale, og biodiesel fuelstocks, fremvisning af den alsidighed og metodens reproducerbarhed. 22-26 den high-throughput kapaciteter direkte analyse i realtid-høj opløsning massespektrometri muliggøre køb af store mængder af masse spectral data i et kort tidsrum, og det store antal gentagelser er nødvendige til statistisk analyse, let erhverves ved hjælp af denne metode. Den direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri massespektral datasæt af Datura og Kratom bestod af over 100 individuelle spektre der blev opsamlet med mindre end en time af den samlede tid investering. For at opnå det samme antal spektre bruger GC-MS med en ovn temperatur program på 30 minutter ville tage cirka 50 timer, uden hensyntagen til den ekstra tid til prøveforberedelse trin, såsom udvinding eller derivatisering.
Principal komponent analyse kan anvendes til at fremhæve forskelle mellem sæt af vegetabilske stoffer baseret på tilstedeværelsen og intensiteten af udvalgte karakteristika masserne. Den statistiske analyse behandling giver arter identifikation, samt oplysninger sorter. Andre metoder til statistisk analyse, såsom hierarkisk clustering analyse (HCA), kan også væreanvendes uden a priori udvalg af funktionen masserne. Resultaterne af HCA af omfattende kemiske fingeraftryk viser, at ukontrollerede statistisk analyse med held kan anvendes til identifikation af plante-baserede misbrugsstoffer arter. 25
Den diskrimination arter af retsmedicinsk botanisk materiale ved direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri blev påvist under anvendelse af identifikationen af psykotrope forbindelser og andre biomarkører i den bløde-ionisering massespektre, og anvendelsen af multivariate statistisk analyse. Anvendelsen af to typer statistiske analyser viste ikke blot, at der kan identificeres klassen af en plante-baseret stofmisbrug, men også, at sort og arter af nævnte kan bestemmes lægemiddel baseret på de unikke kemiske fingeraftryk observeret ved direkte analyse i realtid-højopløsningsmassespektrometri. Fremgangsmåden præsenteres her muliggøres hurtig, højkapacitetsidentifikation af mind-ændre stoffer på en måde, omgår udfordringer støder på i traditionelle analysemetoder, og giver retsmedicinske laboratorier med et middel til at karakterisere og identificere psykoaktive plantemateriale uden tid og ressourcekrævende metodeudvikling. Denne protokol kan udvides til arter differentiering af en række andre planteafledte materialer. 22-26
Acknowledgments
Forfatterne takker et universitet i Albany-SUNY Presidential initiativer Fonden for forskning og Scholarship i retsmedicin og Cybersecurity tilskud, en National Science Foundation tilskud (Grant # 1.310.350) og en National Institute of Justice tilskud (Grant # 2015-DN-BX- K057) til RAM. Vi anerkender også Justine E. Giffen for at træffe de fotografier af plantematerialer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuTOF Mass Spectrometer | JEOL USA, Inc. | ||
| DART-SVP Ion Source | IonSense, Inc. | DART-SVP | |
| Linear Rail System | IonSense, Inc. | HW-10029 | |
| Hole puncher (6 mm) | Swingline | A7074005 | |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner | Cole-Palmer | EQ-08849-00 | |
| 1.5 ml Eppendorf Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| AccuSpin Micro 17R Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100676 | |
| #9 Stainless Steel Razor blade | Stanley | 11-515 | |
| Dip-it Tip Holder | IonSense, Inc. | SCT-70003 | |
| Dip-it Tips | IonSense, Inc. | DPT-110 | |
| Melting Point Capillary | Krackeler Scientific | 1-9530-3 | |
| Polyethylene glycol (600) | Sigma Aldrich | 81180 | |
| Rifat Kratom Live Plant | World Seed Supply Kratom Collection | LIVEKRATOMPLANT | |
| Bali Kratom Dried Leaf | The Kratom King | OZKRAPCOM | |
| Bali Kratom Powder | The Kratom King | OZKRAPCOMPOW | |
| Datura stramonium seeds | Horizon Herbs LLC | PDATUJ | |
| Datura inoxia seeds | Horizon Herbs LLC | PDATUM | |
| Datura ferox seeds | Georgia Vines | 255/737 | |
| Ethanol, anhydrous | Krackeler Scientific | 1328-E402-4L | |
| Mass Mountaineer Spectral Analysis Software | mass-spec-software.com | MM-20030-PCA-DVD | |
| TSSPro3 Data Processing/Data Reduction Software | Shrader Labs | ||
| Cluster 3.0 | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm | Open Source Software | |
| Java Treeview | http://jtreeview.sourceforge.net/ | Open Source Software |
References
- Authority, E.F.S. EFSA Compendium of botanicals that have been reported to contain toxic, addictive, psychotropic or other substances of concern onrequest of EFSA. EFSA Journal. 7, 1-100 (2009).
- The challenge of new psychoactive substances: list of plant-based substances (20 Substances). , UNODC. 101-102 (2013).
- Kratom (Mitragyna speciosa Korth). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/kratom.pdf (2013).
- Jimson Weed (Datura stramonium). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/jimson_w.pdf (2013).
- Jansen, K., Prast, C. Ehtnopharmacology of Kratom and the Mitragyna alkaloids. J. Ethnopharmacol. 23, 115-119 (1988).
- Matsumoto, K. Pharmacological Studies on 7-Hydroxymitragynine, Isolated from the Thai Herbal Medicine Mitragyna speciosa: Discovery of an Orally Active Opioid Analgesic. , Chiba University. (2006).
- Matsumoto, K., et al. Involvement of µ-opioid receptors in antinociception and inhibition of gastrointestinal transit induced by 7-hydroxymitragynine, isolated from Thai herbal medicine Mitragyna speciosa. Eur. J. Pharmacol. 549, (2006).
- Matsumoto, K., et al. Antinociceptive effect of 7-hydroxymitragynine in mice: Discovery of an orally active opioid analgesic from the Thai medicinal herb Mitragyna speciosa. Life Sciences. 74, 2143-2155 (2004).
- El Bazaoui, A., Stambouli, H., Bellimam, M. A., Soulaymani, A. Determination of tropane alkaloids in seeds of Datura stramonium L. by GC/MS and LC/MS. Ann. Toxicol. Anal. 21, 183-188 (2009).
- Friedman, M., Levin, C. E. Composition of Jimson Weed (Datura stramonium) seeds. J. Agr. Food Chem. 37, 998-1005 (1989).
- Philipof, S., Berkhov, S. GC-MS Investigation of tropane alkaloids in Datura stramonium. Z Naturforsch. 57, 559-561 (2002).
- Preissel, U., Preissel, H. -G. Brugmansia and Datura: Angel's Trumpets and Thorn Apples. , Firefly Books. (2002).
- Boumba, V. A., Mitselou, A., Vougiouklakis, T. Fatal poisoning from ingestion of Datura stramonium seeds. Vet. Hum. Toxicol. 46, 81-82 (2004).
- Kronstrand, R., Roman, M., Thelander, G., Eriksson, A. Unintentional Fatal Intoxications with Mitragynine and O-Desmethyltramadol from the Herbal Blend Krypton. J. Anal. Toxicol. 35, 242-247 (2011).
- Neerman, M., Frost, R., Deking, J. A drug fatality involving Kratom. J. Forensic Sci. 58, 278-279 (2013).
- Steenkamp, P. A., Harding, N. M., Van Heerden, F. R., Van Wyk, B. -E. Fatal Datura poisoning: Identification of atropine and scopolamine by high performance liquid chromatography / photodiode array / mass spectrometry. Forensic Sci. Int. 145, 31-39 (2004).
- Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drug Recommendations. , Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs. (2014).
- Kikura-Hanajiri, R., et al. Simultaneous analysis of mitragynine, 7-hydroxymitragynine, and other alkaloids in the psychotropic plant "Kratom" (Mitragyna speciosa) by LC-ESI-MS. Forensic Toxicol. 27, 67-74 (2009).
- Wang, M., et al. Comparison of three chromatographic techniques for the detection of mitragynine and other indole and oxindole alkaloids in Mitragyna speciosa (Kratom) plants. J. Separation Sci. , (2014).
- Cody, R. Observation of molecular ions and analysis of nonpolar compounds with the Direct Analysis in Real Time ion source. Anal. Chem. 81, 1101-1107 (2009).
- Cody, R., Laramee, J., Durst, H. D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions. Anal. Chem. 77, 2297-2302 (2005).
- Musah, R. A., et al. A High Throughput Ambient Mass Spectrometric Approach to Species Identification and Classification from Chemical Fingerprint Signatures. Sci. Rep. 5, (2015).
- Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Rapid detection by direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) of psychoactive plant drugs of abuse: The case of Mitragyna speciosa aka "Kratom". Forensic Sci. Int. 242, 210-218 (2014).
- Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Plant Seed Species Identification from Chemical Fingerprints: A High-Throughput Application of Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry. Anal. Chem. , (2015).
- Espinoza, E. O., et al. Distinguishing wild from cultivated agarwood (Aquilaria spp.) using direct analysis in real time and time of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 281-289 (2014).
- Lancaster, C., Espinoza, E. Evaluating agarwood products for 2-(2-phenylethyl)chromones using direct analysis in real time time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2649-2656 (2012).
- Sisco, E., Dake, J., Bridge, C. "Screening for trace explosives by AccuTOF™-DART®: An in-depth validation study.". Forensic Sci. Int. 232, 160-168 (2013).
- Fernandez, F. M., et al. Characterizatoin of solid counterfeit drug samples by desorption electrospray ionization and direct analysis in real time coupld to time-of-flight mass spectrometry. Chem. Med. Chem. 1, 702-705 (2006).
