Summary
En fremgangsmåte for identifisering av arter av botanisk materiale ved direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri og multivariat statistisk analyse er presentert.
Abstract
Vi viser at direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri kan anvendes for å fremstille massespektrale profiler av botanisk materiale, og at disse kjemiske fingeravtrykk kan anvendes for plantearter identifikasjon. Massespektraldataene kan erverves hurtig og i en høy gjennomstrømning måte uten behov for prøven ekstraksjon, derivatiseringsreaksjoner eller pH-justeringstrinn. Bruken av denne teknikken forbigår utfordringene mer konvensjonelle teknikker, inkludert lange kromatografi analysetider og ressurskrevende metoder. De høye gjennomløps egenskapene til direkte analyse i sanntid høy oppløsning massespektrometri protokoll, kombinert med multivariabel statistisk analyse behandling av dataene, gir ikke bare klasse karakterisering av planter, men også dannelse av arter og Sorte informasjon. Her er teknikken demonstrert med to psykoaktive planteprodukter, kratom (Kratom) og Datura(Jimsonweed), som ble underkastet direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri fulgt av statistisk analyse behandling av de massespektrale data. Anvendelsen av disse verktøyene i tandem aktivert plantematerialer for å bli hurtig identifisert ved nivået for variasjon og arter.
Introduction
I årtusener har psyko naturlige produkter blitt brukt i sjamanistiske ritualer, misbrukt for sine bevissthetsendrende egenskaper, og konsumert for sine medisinske egenskaper. Inntak av disse plantene og beslektede plantebaserte stoffer kan være viktig i områder der de er endemisk, og de har sosial og økonomisk betydning. Nylig har det imidlertid vært en dramatisk økning i bruken av disse "naturlige" narkotika på grunn av enkel tilgjengelighet via internett handel. Oppfatningen om at disse stoffene er trygge å bruke, kombinert med økt aksjon mot besittelse og bruk av mer tradisjonelle narkotiske stoffer og syntetiske stoffer, har bidratt til økning i misbruk av plantebaserte legemidler. Det er generelt vanskelig ved visualisering å skille mellom disse produktene og ufarlig plantemateriale, og derfor er det interesse for å utvikle metoder som kan brukes til å identifisere disse produktene. Imidlertid konvensjonelle analysemetoder for anleggartsidentifikasjon er tidkrevende og upraktisk å utføre. Videre er fremgangsmåter utviklingsprosessen tid og ressurskrevende. Disse faktorene har gjort laging av lovgivning for å dempe bruken av disse stoffene ligger langt bak frekvensen av opptrapping i sitt misbruk. Dermed er det få lover som regulerer produksjon, produksjon, salg og forbruk av mange av disse naturlige psychoactives og som sådan, det er hundrevis av planter for overgrep tilgjengelig for brukere i tusenvis av forskjellige former. 1,2
To slike plantebaserte legemidler av misbruk er kratom, vanligvis kjent som Kratom, og planter fra Datura slekten, nemlig D. stramonium, D. ferox og D. inoxia. Kratom og Datura er planlagt i USA, men Drug Enforcement Administration har oppført både som legemidler av bekymring. 3,4 Kratom er preget av tilstedeværelsen av de psykoaktive forbindelser mitragynine ennd 7-hydroxymitragynine, samt andre ikke-psykoaktive alkaloider inkludert mitraphylline, paynantheine, corynoxeine, og rhynchophylline. 4-8 De psykoaktive egenskapene til Datura spp. er tilskrevet atropin og skopolamin, men en rekke andre tropanforbindelse alkaloider har blitt identifisert i plantene. 9-12 Både Kratom og Datura har vært innblandet i forgiftninger og dødsfall, og deres identifikasjon er stadig mer nødvendig i begge rettsmedisinske og toksikologiske sammenhenger som misbruk av disse produktene er på vei oppover. 13-16
Av og store, tradisjonelle metoder som brukes for analyse av rettsmedisinske narkotika materiale, for eksempel fargeprøver, mikroskopi og Raman og infrarød spektroskopi, blir brukt i en regel-in / regel-out presumptive kapasitet. Bindestrek teknikker så som GC-MS og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), er bekreftelses analysemetoder basert på sammenligning av profiler av detekterte analytterScientific Working Group on Analyse av beslaglagt narkotika (SWGDRUG) bibliotek standarder. 17 Eksempelbehandlingstrinn som utføres før analyse inkludert pulverisering, utvinning, derivatisering og fordampning, kan legge timer til kjøring og forfalske prøven, 9,11 , 18,19 making analyse av botaniske stoffer mindre enn grei sammenlignet med andre tradisjonelle narkotiske stoffer som kokain eller heroin. Videre enkelte kromatografiske programmer må utvikles for hvert produkt av interesse, noe som gjør gjennomføringen av standard operasjonsprotokoller for hver art eller rekke plantebasert legemiddelmisbruk svært upraktisk for rutinemessig saksbehandling.
Direkte analyse i sanntid-høyoppløselig massespektrometri er en ambient ionisering massespektrometrisk teknikk som omgår noen av utfordringene forbundet med konvensjonelle analysemetoder. Gasser, væsker, faste stoffer, pulver, TLC-plater og anlegg material kan alle bli analysert direkte ved hjelp av direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri, og både polare og ikke-polare forbindelser kan lett oppdages i komplekse matriser. 20-22 Videre studier har vist at psykoaktive forbindelser kan raskt identifisert i plantemateriale ved direkte analyse i sann tid med høy oppløsning massespektrometri, og artsspesifikke informasjonen kan leses ut fra statistisk behandling av de massespektrale data. 22-26
Her viser vi at direkte analyse i sanntid-høyoppløselig massespektrometri kan brukes til raskt å vurdere ulike plantemateriale (dvs. planter, pulver, ekstrakter og frø) for sine psykoaktive komponenter, og at arter og varianter av anlegget- avledede produkter kan bestemmes i en rask og høy gjennomstrømming måte. Analysen av forensically relevant botanisk materiale uten behov for prøveopparbeidelse trinn eller lang kromatografiskanalyse kjøre ganger, i tillegg til planteartsbestemmelse er rapportert.
Protocol
1. Utarbeidelse av plantemateriale
- Kratom Fresh Leaf Material
- Bruk en 6 mm diameter hulle å skape ensartede chads av Kratom bladmateriale fra M. speciosa anlegget. Gjenta 5 ganger.
- Kratom Powder Extraction
- Bland 5 ml etanol og 5 ml destillert vann for å lage 1: 1 oppløsningsmiddelblanding for ekstraksjon.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, suspendere en liten mengde (~ 5 mg) av Kratom Bali pulver i 1 ml av 1: 1 EtOH: H2O løsningsmiddelblanding. Gjenta 5 ganger.
- Sonikere Kratom Bali pulver ekstraktprøver i et ultralydbad i 30 min ved omgivelsestemperatur.
- Sentrifuger Kratom Bali pulver ekstrakt prøver i 2 min ved 750 xg ved romtemperatur.
- Dekanter løsningsmidlet fra gjenværende pulver for etterfølgende analyse.
- Datura frø forberedelse
- Skjær en D. stramonium frø i halvparten over tverrplanet ved hjelp av et barberblad. Gjenta ved hjelp av 5 forskjellige frø.
- Gjenta for D. inoxia og D. ferox frø.
2. Direkte analyse i sanntid Ion Kilde Parametere
- Gas Heater Temperatur
- Still gassvarmeren temperaturen i ionekilden til 350 ° C.
- ion-modus
- Gjennomføre analysen i positiv ion modus med gitterspenning på 250 V.
- Helium Gas Flow Rate
- Still heliumgassen strømningshastigheten til 2,0 l / sek.
3. Time-of-flight massespektrometer Parametere
- orifice spenninger
- Angi at åpningen en spenning 20 V, og åpningen 2-spenning til 5 V.
- Ring Lens og Peak Spenning
- Juster ring objektivet spenning til 5V og endre topper spenningen 600 V.
- Mass Spectral Acquisition
- Sett masse spektral oppkjøpet satsen til en spektrum per sekund over en masse spekter av m / z 60-800.
- Mass Spectrometer oppløsningsevne
- Sett oppløsningen til massespektrometer til 6000 FWHM.
4. Analyse av plantemateriale
- Analyse av Kratom Leaf
- Trykk "Start Run" i massespektrometer kontroll programvare. Suspender den Chad av plantemateriale mellom ionekilden og massespektrometeret innløp (ca. 2 cm fra innløpet) med pinsett til et spektrum oppnås. Gjenta 5 ganger med separate chads av plantemateriale.
- Kalibrer-spektrum med polyetylenglykol 600 (PEG).
- Dypp den lukkede ende av et smeltepunkt kapillarrør inn i PEG-standarden. Suspendere belagt kapillær between ionekilden og massespektrometer innløpet.
- Etter å ha analysert PEG standard, velger du "Stopp" -knappen for å avslutte analytiske kjøring.
- Trykk "Start Run" i massespektrometer kontroll programvare. Suspendere en liten mengde av tørket bladmateriale mellom ionekilden og massespektrometer innløp med pinsett til et spektrum oppnås. Gjenta 5 ganger, analysere nytt plantemateriale hver gang.
- Kalibrere spekteret med PEG.
- Dypp den lukkede ende av et kapillært inn i PEG-standarden. Suspendere det belagte kapillært mellom ionekilden og massespektrometer innløpet.
- Etter å ha analysert PEG standard, velger du "Stopp" -knappen for å avslutte analytiske kjøring.
- Analyse av Kratom Powder
- Trykk "Start Run" i massespektrometer kontroll programvare. Dypp den lukkede enden av et kapillar-smeltepunkt inn i den Kratom pulver.
- setet fjæringd den belagte kapillært mellom ionekilden og massespektrometer innløp til et spektrum oppnås. Gjenta analysen 5 ganger med en ny kapillær hver gang.
- Kalibrere spekteret med PEG.
- Dypp den lukkede ende av et kapillært inn i PEG-standarden. Suspendere det belagte kapillært mellom ionekilden og massespektrometer innløpet.
- Etter å ha analysert PEG standard, velger du "Stopp" -knappen for å avslutte analytiske kjøring.
- Analyse av Kratom Extract
- Dyppe den lukkede ende av et kapillarrør inn i ekstrakten.
- Suspendere kapillarrøret i 12-prøveholderen på den lineære skinnen er festet til massespektrometeret. Gjentas 5 ganger med en annen ekstrakt hver gang.
- Trykk "Start Run" i massespektrometer kontroll programvare. Bruke kontrollpanelet, velg ">" -knappen for å fremme rett skinne gjennom ion strøm ved hastighet på 1 mm / sek tilsamle spektra.
- Kalibrere spekteret med PEG.
- Dypp den lukkede ende av et kapillært inn i PEG-standarden. Suspendere det belagte kapillært mellom ionekilden og massespektrometer innløpet.
- Etter å ha analysert PEG standard, velger du "Stopp" -knappen for å avslutte analytiske kjøring.
- Analyse av Datura frø
- Trykk "Start Run" i massespektrometer kontroll programvare. Heng Datura frø halv mellom ion kilden og massespektrometer innløp med pinsett til et spektrum samles. Sørg for at kuttet side er orientert til å møte ion kilden. Gjentas 5 ganger, analysere et nytt frø halv hver gang.
- Kalibrere spekteret med PEG.
- Dypp den lukkede ende av et kapillært inn i PEG-standarden. Suspendere det belagte kapillært mellom ionekilden og massespektrometer innløpet.
- Etter å ha analysert PEG standard,velg "Stopp" -knappen for å avslutte analytiske kjøring.
- Gjenta trinn 4.4.1-4.4.3 for hver Datura arter.
5. Behandling av data
- Sette datafiler
- I databehandling programvare, velger du Fil "Trans DART filer" med "automatisk kalibrering" slått på, for å skape kalibrert datafiler.
- Venstre klikk og dra en boks rundt den første toppen i kromatogrammet og velg "Average" for å lage et gjennomsnitt spektrum.
- Høyreklikk og dra en boks rundt et område der det ikke prøven ble samlet inn og velg "Average hele boksen som bakgrunn" for å trekke bakgrunn fra gjennomsnitt spekteret.
- Lagre massespekteret som en .txt-fil.
- Gjenta trinnene 5.1.1-5.1.4 for hver topp i kromatogrammet for å skape et gjennomsnitt spektrum for hver replikere i filen.
- Gjenta trinn 5.1.2-5.1.5 for hver fil samlet.
6. Statistisk analyse
- Principal Component Analysis
- I Gi delen av spektralanalyse programvare (Se liste over materialer), under "Oppsett" -kategorien, opprette klasser for databehandling ved å velge "Legg Class".
- Importere tekstfiler med data ved å velge "Legg til fil (er)".
- Tildele datafiler til riktig klasse av anlegget ved å velge tekstfiler og "Set klasse for valgte filer".
- Select har masser for diskriminering fra MS fra Training Set og satt Terskel% til 1%.
- Sett en masse toleranse (MMU) til 10 og velg "Bygg vektorer fra datafiler".
- I "Compute" -delen, utføre prinsipal komponent analyse ved å krysse av boksen for 3D PCA graf og velg "Beregn".
- Utfør leave-one-out kryssvalidering ved å velge "Bekreft (sakte!)."
- I kategorien Frequency Plot av spektralanalyse programvare, generere et varmekart av data ved å velge "Heat kart."
- Velg "Threshold lagrede data" for å sette overflod terskelen til 1%.
- Eksportere varmekartet til et regneark ved å velge "Lagre Heat Map til Excel."
- I regnearkprogram, lagre den eksporterte varmen kartet som en .txt-fil.
- Hierarkisk Clustering Analysis
- Importer kartet varmen som en .txt-fil til Cluster 3.0-programvaren.
- I den hierarkiske kategorien av Cluster 3.0 under Gener og Arrays, avmerkingsbokser "Cluster" og "Beregn vekter". Sett cutoff på 0,1 og eksponent til 1. Velg én kobling clustering å utføre analysen.
- Se den genererte .cdt datafilen i Java Utforsker.
Representative Results
Representative myk ionisering positiv-ion-modus direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri data for Kratom produkter og Datura frø er vist i figurene 2 og 3. Ulike forbindelser tidligere isolert fra M. speciosa, inkludert mitragynine (C 23 H 30 N 2 O 4 + H +, m / z 399,2284) og 7-hydroxymitragynine (C 23 H 30 N 2 O 5 + H +, m / z 415,2233), ble detektert i alle fire prøvene og de tilsvarende massemåledataene er angitt i tabell 1. 4-8 Representative Datura data er vist i figur 3 og signatur biomarkører inkludert atropin (C 17 H 23 NO 3 + H +, m / z 290,1756) og scopolamin (C 17 H 21 NO 4 + H + m / z 304.1549) detektert i de tre artene. Massedatamålingen i forbindelse med Figur 3 er presentert i tabell 2. 9-12 Sammensatte identitet ble bekreftet ved elementsammensetningen bestemmelse, isotop tilpasning, og sammenligninger til rapporter i litteraturen. 23-24
Varmekart gjengivelser av den direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri spektra av Kratom og Datura er illustrert i figur 4. Dataene som er presentert ble brukt i hovedkomponentanalyse (PCA) for å skille mellom de to klasser av plante-baserte legemidler av misbruk (figur 5). PCA tomten ble bygget ved hjelp av ti har masser (oppført i tabell 3), med blå sirklene representerer Kratom data og røde firkanter som representerer Datura data. De har masser utvalgte samsvarer med ulike alkaloider stede iDatura eller Mitragyna spp., Herunder psyko forbindelser atropin, skopolamin, mitragynine og 7-hydroxymitragynine. 23-24 tre hovedkomponenter stod for 75,26% av variansen og leave-one-out kryssvalidering (LOOCV) var 100%. PCA plottet viser tydelig at Kratom data og Datura data er godt løst fra hverandre. PCA-analyse viste også at de individuelle varianter av Kratom og forskjellige arter av Datura kunne identifiseres og skilles fra hverandre (figur 6). LOOCV var 94,29% med tre hovedkomponenter som dekker 75,26% av variansen. De to varianter av Kratom (Bali i blå sirklene og Rifat i røde firkanter) klynge sammen, noe som indikerer at de tilhører arten M. speciosa, men er løst fra hverandre, noe som viser at de representerer forskjellige varianter. Videre Datura artsgruppen sammen og atskilt fra M. speciosa data, men hver av de enkelte arter av Datura (D. inoxia i grønne trekanter, D. stramonium i rosa firkanter og D. ferox i turkise sirkler) er tydelig differensiert. Til tross for et datapunkt for D. stramonium synes å være en avvikende, er frøet korrekt klassifisert som D. stramonium og ikke D. inoxia hjelp PCA. Viktigst, forskjellen i frøet farge mellom D. stramonium og D. inoxia bekrefter at de er forskjellige arter, og at datapunktet i spørsmålet ikke kan være D. inoxia.
Hierarkisk clustering (figur 7) ble utført uten den a priori utvalg av spille massene. I stedet, ble hele gruppen av spektrale datasett som spenner over en rekke masse m / z 60-800 importert inn i fri genomisk gruppering programvare og et dendrogram med disse data ble produsert. Resultatene of HCA også avdekket klasse, arter og forskjellige differensiering utelukkende basert på direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri utledet av data og bekreftet de av den PCA-analyse. De to klasser av plantebaserte legemidler av misbruk, Kratom og Datura, ble delt inn i individuelle subtypene av dendrogram. Videre Rifat og Bali varianter av Kratom ble hver isolert i enkelte under clades innenfor Kratom klassen. På samme måte, D. inoxia, D. ferox og D. stramonium ble løst i egne subtypene av arter innen Datura klassen.
Figur 1. Bilder av M. speciosa (Kratom) produkter og Datura spp frø en: Bali Kratom tørket blad, b:.. Bali Kratom pulver; c: Rifat Kratom levende plante;
Figur 2. Direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri positiv-ion-spektra av M. speciosa (Kratom) produkter a: Rifat frisk blad, b:. Bali tørket blad; c: Bali pulver; d: Bali pulver ekstrakt. De masse måledata knyttet til disse spektrene er vist i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri positiv-ion-spektra av Datura spp. . frø a: D. ferox, b: D. inoxia; c: D. stramonium. Masse måledata knyttet til disse spektrene er vist i tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Heat kart gjengivelser av direkte analyse i sanntid-høyoppløselig massespektrometri spektra av Kratom og Datura plantematerialer. High intensitetstopper er vist i mørk rød og lavere intensitet topper er angitt i lysere nyanser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Prinsipal komponent analyse (PCA) tomt på Kratom og Datura produkter konstruert ved hjelp av direkte analyse i sanntid høyoppløselig massespektrometri-avledet data. Tre hovedkomponenter (PC) stod for 75,26% av variasjonen, og leave-en- ut kryssvalidering (LOOCV) var 100%. De har masser brukes til PCA er oppført i tabell 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Prinsipal komponent analyse (PCA) tomt på Kratom og Datura produkter ved hjelp av direkte analyse i sanntid-høyoppløselig massespektrometri data. Klasse oppdrag var basert på utvalg (Kratom) eller arter (Datura) av plantemateriale. Tre hovedkomponenter (PC) stod for 75,26% av variasjonen og leave-one-out kryssvalidering (LOOCV) var 94,29%. De har masser som brukes til PCA er oppført i tabell 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Hierarkiske clustering resultater oppnådd ved hjelp av direkte analyse i sanntid time-høyoppløselig massespektrometri-avledet data fra analyse av Kratom og Datura plantemateriale. De to klasser av planter er tydelig delt inn i to forskjellige grener i dendrogram (vist i blått og rødt braketter for Kratom og Datura, henholdsvis). De Datura frø arter er også løst fra hverandre (vist i grønt, turkis og rosa stiplede bokser for D. inoxia, D. ferox og D. stramonium henholdsvis). De Kratom plantemateriale er atskilt med variasjon (vist i rød og blå stiplede bokser for Rifat og henholdsvis Bali,). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Masse måledata knyttet til myk ionisering spektra av Kratom proCTS presentert i figur 2. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2. Mass måledata knyttet til myk ionisering spektra av Datura frø presentert i Figur 3. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 3. Funksjons massene brukes til prinsipal komponent analyse tomt på Kratom og Datura produkter vist i figur 5 og 6.
Discussion
Evnen til å identifisere plantebaserte legemidler for overgrep er av økende nødvendighet på grunn av den dramatiske økningen i markedsføring, salg og forbruk av ikke-planlagte psykoaktive stoffer. 2 Tradisjonelle metoder for identifisering av botanisk materiale som regel innebære karakterisering av fysiske egenskaper kombinert med analyse av kjemiske bestanddeler av bindestreks kromatografiske-massespektrometri metoder. Men begge disse tilnærmingene presentere utfordringer for strømlinjeformet analyse. Fysiske egenskaper til plantene blir ofte ødelagt når plantene er tørket, pulverisert eller trekkes ut under fremstillingsprosessen og som sådan, er det ofte vanskelig å skille en type plantebasert psykotrope produkt fra en annen basert på fysiske egenskaper alene. 23 Analyse av kromatografiske-massespektrometri metoder kan aktivere identifisering av psykoaktive stoffer i plante matriser, men prøveopparbeidelse og metodeutvikling er tid ennd ressurskrevende, og etablering av nye protokoller for hver klasse eller arter av plantebasert legemiddelmisbruk er upraktisk i mange rettsmedisinske kjemi laboratorier.
Direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri omgår noen av disse utfordringene, som komplekse matrikser så som blader, pulvere, ekstrakter og frø kan analyseres med lite prøvepreparering. Til tross for de komplekse matriser av materialene samplet her, de psykoaktive bestanddelene var lett identifiserbare, selv ved konsentrasjoner nanogram, 21 på grunn av den høye følsomheten til massespektrometer. Frø, blader og pulvere ble demonstrert å være lett analyseres ved direkte analyse i sann tid med høy oppløsning massespektrometri, og en rekke andre typer materialer kan også være samplet på samme måte, herunder TLC-plater, valuta, tabletter, blomster, solid mikroekstraksjon (SPME) fibre og selv insekt puparial foringsrør. 21-22 Gjennom nøyaktig masse analysis, sammensetning av forbindelser bestemmelse og isotopen samsvarende, biomarkører og forbindelser av interesse kan identifiseres, uavhengig av om forbindelsene er inneholdt i et blad, flekket på en TLC-plate eller belagt på et kapillarrør.
kan brukes direkte analyse i sanntid-høyoppløselig massespektrometri metodikk for strømlinjeformet analyse som det er svært få parametere som må endres fra eksperiment for å eksperimentere. Analyse kan utføres på positiv-ion eller negativ-ion-modus, og molekyler med opp til 3000 amu kan påvises i begge tilfeller. Ioniseringen i positiv-ion-modus inntreffer ved protonoverføring fra aktiverte vann klynger, 21 og en hvilken som helst forbindelse med en proton affinitet høyere enn den for vann vil bli ionisert. Her ble det positiv-ion-modus brukes på grunn av den høye affiniteten av proton alkaloider, noe som får dem til å bli lett ioniseres ved protonering. Analyse i negativ-ion-modus kan brukes for en vellykket påvisning av Hydrocarbons (som O 2 addukter) 21, eksplosive materialer 27 og organiske syrer slik som artesunate i malarial medisiner. 28 På grunn av ionisering fremgangsmåte for protonoverføring, og manglende evne til å produsere multiplisere ladede ioner, direkte analyse i sann tid-høyoppløselig masse spektrometri er begrenset hovedsakelig til analyse av små molekyler på opp til 3000 amu.
Annet enn ionisering modus, er temperaturen i ionekilden en viktig parameter, og den aktuelle temperatur i stor grad avhenger av den prøve som analyseres. For eksempel, er det viktig å bruke lavere temperaturer (~ 250 ° C) for SPME fiber analyse for å forhindre ødeleggelse av beleggmaterialet på fiberen, mens høyere temperaturer (~ 500 ° C) bør brukes for aminosyreanalyse for desorpsjon og påfølgende ionisering. Her ble plantemateriale analyser utført ved 350 ° C, da dette gjør det mulig for ionisering av alkaloider og andre forbindelser av interesse medå forårsake pyrolyse av forbindelser i anlegget matrisen.
Direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometrianalyse ikke bare muliggjør identifikasjon av de psykoaktive bestanddeler av plantemateriale basert på nøyaktige masser, elementsammensetningen bestemmelse og isotopen tilpasning, men det frembringer også unike kjemiske fingeravtrykk som kan utnyttes for artsidentifikasjon ved hjelp multivariat statistisk analyse med svært reproduserbare resultater, selv med mindre datasett. Multivariat statistisk analyse er blitt anvendt på en rekke direkte analyse i sanntid-høyoppløste massespektrometri data, inkludert det som er avledet fra tre, puparial foringsrør, frø, blad materiale, og biodiesel fuelstocks, et utstillingsvindu for allsidighet og reproduserbarhet av metoden. 22-26 High-throughput egenskapene til direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri muliggjøre anskaffelse av store mengder masse spectral data i en kort tidsperiode, og det store antall av replikasjoner som er nødvendig for statistisk analyse kan lett skaffes ved hjelp av denne metoden. Den direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri massespektral datasett av Datura og Kratom besto av over 100 individuelle spektra som ble samlet opp med mindre enn en time av total tid investering. For å oppnå det samme antall spektre ved hjelp av GC-MS med en ovn temperaturprogram på 30 minutter vil ta omtrent 50 timer, uten hensyn til den ekstra tid for prøvefremstillingstrinn, slik som ekstraksjon eller derivatisering.
Prinsipal komponent analyse kan brukes til å markere variasjoner mellom sett av plantestoffer basert på tilstedeværelse og intensiteten av utvalgte har massene. Den statistiske analysen behandling gir artsbestemmelse, samt Sorte informasjon. Andre metoder for statistisk analyse, slik som hierarkisk clustering analyse (HCA), kan også blipåføres uten a priori utvalg av spille massene. Resultatene av HCA av omfattende kjemiske fingeravtrykk viser at uten tilsyn statistisk analyse kan med hell brukes for artsbestemmelse av plantebaserte legemidler av misbruk. 25
Arten diskriminering av rettsmedisinske botanisk materiale ved direkte analyse i sann tid høy oppløsning massespektrometri ble demonstrert ved hjelp av identifikasjon av psykotrope forbindelser og andre biomarkører i myk-ioniseringsmassespektra, og anvendelsen av multivariat statistisk analyse. Anvendelsen av to typer statistiske analyser viste ikke bare at klassen av et plantebasert legemiddelmisbruk kan identifiseres, men også at variasjonen og arter av nevnte legemiddel kan bestemmes på grunnlag av de unike kjemiske fingeravtrykk observert ved direkte analyse i sanntid høy oppløsning massespektrometri. Metoden som presenteres her muliggjør rask, high-throughput identifikasjon av mind rende stoffer på en måte som omgår utfordringene som oppstår i konvensjonelle analytiske fremgangsmåter, og gir kriminaltekniske laboratorier med et middel for å karakterisere og identifisere psykoplantemateriale uten tid og ressurskrevende metodeutvikling. Protokollen kan utvides til arten differensiering av en rekke andre plante-avledet materiale. 22-26
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for en Universitetet i Albany-SUNY Presidential Initiatives Fondet for forskning og stipend i Forensic Science and Cyber stipend, en National Science Foundation bevilgning (Grant # 1310350) og en National Institute of Justice tilskuddet (Grant # 2015-DN-BX- K057) til RAM. Vi erkjenner også Justine E. Giffen for å ta fotografier av plantematerialer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuTOF Mass Spectrometer | JEOL USA, Inc. | ||
| DART-SVP Ion Source | IonSense, Inc. | DART-SVP | |
| Linear Rail System | IonSense, Inc. | HW-10029 | |
| Hole puncher (6 mm) | Swingline | A7074005 | |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner | Cole-Palmer | EQ-08849-00 | |
| 1.5 ml Eppendorf Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| AccuSpin Micro 17R Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100676 | |
| #9 Stainless Steel Razor blade | Stanley | 11-515 | |
| Dip-it Tip Holder | IonSense, Inc. | SCT-70003 | |
| Dip-it Tips | IonSense, Inc. | DPT-110 | |
| Melting Point Capillary | Krackeler Scientific | 1-9530-3 | |
| Polyethylene glycol (600) | Sigma Aldrich | 81180 | |
| Rifat Kratom Live Plant | World Seed Supply Kratom Collection | LIVEKRATOMPLANT | |
| Bali Kratom Dried Leaf | The Kratom King | OZKRAPCOM | |
| Bali Kratom Powder | The Kratom King | OZKRAPCOMPOW | |
| Datura stramonium seeds | Horizon Herbs LLC | PDATUJ | |
| Datura inoxia seeds | Horizon Herbs LLC | PDATUM | |
| Datura ferox seeds | Georgia Vines | 255/737 | |
| Ethanol, anhydrous | Krackeler Scientific | 1328-E402-4L | |
| Mass Mountaineer Spectral Analysis Software | mass-spec-software.com | MM-20030-PCA-DVD | |
| TSSPro3 Data Processing/Data Reduction Software | Shrader Labs | ||
| Cluster 3.0 | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm | Open Source Software | |
| Java Treeview | http://jtreeview.sourceforge.net/ | Open Source Software |
References
- Authority, E.F.S. EFSA Compendium of botanicals that have been reported to contain toxic, addictive, psychotropic or other substances of concern onrequest of EFSA. EFSA Journal. 7, 1-100 (2009).
- The challenge of new psychoactive substances: list of plant-based substances (20 Substances). , UNODC. 101-102 (2013).
- Kratom (Mitragyna speciosa Korth). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/kratom.pdf (2013).
- Jimson Weed (Datura stramonium). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/jimson_w.pdf (2013).
- Jansen, K., Prast, C. Ehtnopharmacology of Kratom and the Mitragyna alkaloids. J. Ethnopharmacol. 23, 115-119 (1988).
- Matsumoto, K. Pharmacological Studies on 7-Hydroxymitragynine, Isolated from the Thai Herbal Medicine Mitragyna speciosa: Discovery of an Orally Active Opioid Analgesic. , Chiba University. (2006).
- Matsumoto, K., et al. Involvement of µ-opioid receptors in antinociception and inhibition of gastrointestinal transit induced by 7-hydroxymitragynine, isolated from Thai herbal medicine Mitragyna speciosa. Eur. J. Pharmacol. 549, (2006).
- Matsumoto, K., et al. Antinociceptive effect of 7-hydroxymitragynine in mice: Discovery of an orally active opioid analgesic from the Thai medicinal herb Mitragyna speciosa. Life Sciences. 74, 2143-2155 (2004).
- El Bazaoui, A., Stambouli, H., Bellimam, M. A., Soulaymani, A. Determination of tropane alkaloids in seeds of Datura stramonium L. by GC/MS and LC/MS. Ann. Toxicol. Anal. 21, 183-188 (2009).
- Friedman, M., Levin, C. E. Composition of Jimson Weed (Datura stramonium) seeds. J. Agr. Food Chem. 37, 998-1005 (1989).
- Philipof, S., Berkhov, S. GC-MS Investigation of tropane alkaloids in Datura stramonium. Z Naturforsch. 57, 559-561 (2002).
- Preissel, U., Preissel, H. -G. Brugmansia and Datura: Angel's Trumpets and Thorn Apples. , Firefly Books. (2002).
- Boumba, V. A., Mitselou, A., Vougiouklakis, T. Fatal poisoning from ingestion of Datura stramonium seeds. Vet. Hum. Toxicol. 46, 81-82 (2004).
- Kronstrand, R., Roman, M., Thelander, G., Eriksson, A. Unintentional Fatal Intoxications with Mitragynine and O-Desmethyltramadol from the Herbal Blend Krypton. J. Anal. Toxicol. 35, 242-247 (2011).
- Neerman, M., Frost, R., Deking, J. A drug fatality involving Kratom. J. Forensic Sci. 58, 278-279 (2013).
- Steenkamp, P. A., Harding, N. M., Van Heerden, F. R., Van Wyk, B. -E. Fatal Datura poisoning: Identification of atropine and scopolamine by high performance liquid chromatography / photodiode array / mass spectrometry. Forensic Sci. Int. 145, 31-39 (2004).
- Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drug Recommendations. , Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs. (2014).
- Kikura-Hanajiri, R., et al. Simultaneous analysis of mitragynine, 7-hydroxymitragynine, and other alkaloids in the psychotropic plant "Kratom" (Mitragyna speciosa) by LC-ESI-MS. Forensic Toxicol. 27, 67-74 (2009).
- Wang, M., et al. Comparison of three chromatographic techniques for the detection of mitragynine and other indole and oxindole alkaloids in Mitragyna speciosa (Kratom) plants. J. Separation Sci. , (2014).
- Cody, R. Observation of molecular ions and analysis of nonpolar compounds with the Direct Analysis in Real Time ion source. Anal. Chem. 81, 1101-1107 (2009).
- Cody, R., Laramee, J., Durst, H. D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions. Anal. Chem. 77, 2297-2302 (2005).
- Musah, R. A., et al. A High Throughput Ambient Mass Spectrometric Approach to Species Identification and Classification from Chemical Fingerprint Signatures. Sci. Rep. 5, (2015).
- Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Rapid detection by direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) of psychoactive plant drugs of abuse: The case of Mitragyna speciosa aka "Kratom". Forensic Sci. Int. 242, 210-218 (2014).
- Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Plant Seed Species Identification from Chemical Fingerprints: A High-Throughput Application of Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry. Anal. Chem. , (2015).
- Espinoza, E. O., et al. Distinguishing wild from cultivated agarwood (Aquilaria spp.) using direct analysis in real time and time of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 281-289 (2014).
- Lancaster, C., Espinoza, E. Evaluating agarwood products for 2-(2-phenylethyl)chromones using direct analysis in real time time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2649-2656 (2012).
- Sisco, E., Dake, J., Bridge, C. "Screening for trace explosives by AccuTOF™-DART®: An in-depth validation study.". Forensic Sci. Int. 232, 160-168 (2013).
- Fernandez, F. M., et al. Characterizatoin of solid counterfeit drug samples by desorption electrospray ionization and direct analysis in real time coupld to time-of-flight mass spectrometry. Chem. Med. Chem. 1, 702-705 (2006).
