Summary
Een methode voor het soort identificatie van botanische materiaal door directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie en multivariate statistische analyse wordt gepresenteerd.
Abstract
We laten zien dat directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie kan worden gebruikt om massaspectrale profielen van botanische materiaal te produceren en dat deze chemische vingerafdrukken worden gebruikt voor plantensoorten identificatie. De massaspectrale gegevens kunnen snel en op een high throughput wijze worden verkregen zonder de noodzaak voor monstername, derivatisering of pH aanpassingsstappen. Het gebruik van deze techniek omzeilt uitdagingen van meer conventionele technieken, waaronder lange chromatografie analyse tijden en resource-intensieve methoden. De high throughput capaciteit van de directe analyse van real time-hoge resolutie massaspectrometrie protocol, gekoppeld aan multivariate statistische analyse verwerking van de gegevens, bieden niet alleen klasse karakterisering van planten, maar ook soorten en variëteiten informatie opleveren. Hier wordt de techniek gedemonstreerd met twee psychoactieve plantaardige producten, Mitragyna speciosa (kratom) en Datura(Jimsonweed), die werden onderworpen aan directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie gevolgd door statistische analyse verwerking van de massaspectrale gegevens. De toepassing van deze instrumenten in tandem kon de plantenmaterialen snel worden geïdentificeerd op het niveau van variatie en soorten.
Introduction
Voor millennia, hebben psychoactieve natuurlijke producten gebruikt in sjamanistische rituelen, misbruikt voor hun geestverruimende attributen en verbruikt voor hun geneeskrachtige eigenschappen. De inname van deze planten en verwante plantaardige stoffen kunnen significant in gebieden waar zij endemisch zijn, en ze hebben sociale en economische belang. Onlangs is er echter een dramatische toename van het gebruik van deze "natuurlijke" middelen als gevolg van het gemak van bereikbaarheid via het internet handel. De perceptie dat deze stoffen veilig te gebruiken, in combinatie met een verhoogde hardhandig optreden tegen het bezit en het gebruik van meer traditionele drugs en synthetische stoffen, hebben bijgedragen aan de piek in de misbruik van plantaardige drugs. Het is algemeen moeilijk door visualisatie onderscheid tussen deze produkten en onschadelijk plantmateriaal, en daarom is er belangstelling voor de ontwikkeling methoden die kunnen worden gebruikt wijzen op dergelijke producten. Echter, conventionele analysemethoden voor de plantaardigesoortidentificatie zijn tijdrovend en onpraktisch om te presteren. Bovendien zijn de methoden ontwikkelingsproces is tijd en arbeidsintensief. Deze factoren hebben het vervaardigen van de wetgeving aan te beteugelen van het gebruik van deze stoffen ver achter het tempo van de escalatie in hun misbruik gemaakt. Zo zijn er weinig wetten die reguleren van de productie, vervaardiging, verkoop en consumptie van veel van deze natuurlijke psychoactieve en als zodanig, zijn er honderden planten van mishandeling beschikbaar voor gebruikers in duizenden verschillende vormen. 1,2
Twee van dergelijke plantaardige drugs zijn Mitragyna speciosa, algemeen bekend als Kratom en planten uit het geslacht Datura, namelijk D. stramonium, D. Ferox en D. inoxia. Kratom en Datura zijn ongepland in de Verenigde Staten, maar de Drug Enforcement Administration heeft zowel beursgenoteerde als drugs van zorg. 3,4 Kratom wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van de psychoactieve verbindingen mitragynine eennd 7-HydroHydroxyMitragynine, evenals andere niet-psychoactieve alkaloïden waaronder mitraphylline, paynantheine, corynoxeine en rhynchophylline. 08/04 De psychoactieve eigenschappen van Datura spp. worden toegeschreven aan atropine en scopolamine, maar een verscheidenheid aan andere tropane alkaloïden zijn geïdentificeerd in planten. 9-12 zijn zowel Kratom en Datura betrokken bij vergiftigingen en sterfgevallen en de identificatie in zowel forensische en toxicologische contexten meer noodzakelijk, zoals het misbruik van deze producten zit in de lift. 13-16
In grote lijnen, de traditionele methoden die worden gebruikt voor de analyse van de forensische drug materiaal, zoals kleur proeven, microscopie en Raman en infrarood spectroscopie, worden gebruikt in de regel-in / regel-out vermoedelijke capaciteit. Gekoppelde technieken als GC-MS en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), zijn bevestigende analyse methoden op basis van vergelijking van de profielen van gedetecteerde analytennaar Wetenschappelijke Werkgroep Analyse van de in beslag genomen drugs (SWGDRUG) bibliotheek normen. 17 Het monster behandeling stappen die worden uitgevoerd voorafgaand aan analyse, met inbegrip verpulvering, extractie, derivatisering en verdamping, kan uren toe te voegen aan de run tijd en vervalsen van het monster, 9,11 , 18,19 making analyse van botanische drugs minder dan eenvoudig in vergelijking met die van andere traditionele drugs zoals cocaïne of heroïne. Bovendien moeten de individuele chromatografische programma's worden ontwikkeld voor elk product van belang, dat de uitvoering van de standaard operationele protocollen voor elke soort of variëteit van plantaardige drug zeer onpraktisch voor routinematige behandeling van zaken maakt.
Directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie is een ambient ionisatie massaspectrometrische techniek die enkele van de problemen van conventionele analytische methoden omzeilt. Gassen, vloeistoffen, vaste stoffen, poeders, DLC-platen en planten material zijn rechtstreeks geanalyseerd onder toepassing van rechtstreekse analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie en zowel polaire en niet-polaire verbindingen kunnen gemakkelijk worden opgespoord in complexe matrices. 20-22 Verder hebben aangetoond dat psychoactieve verbindingen snel kunnen worden geïdentificeerd plantmateriaal door directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie en species-specifieke informatie kan worden afgeleid uit de statistische verwerking van de massa spectrale gegevens. 22-26
Hier tonen we aan dat directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie kan worden gebruikt om snel beoordelen diverse plantaardige materialen (bijvoorbeeld planten, poeders, extracten en zaden) voor hun psychoactieve componenten, en de soorten en variëteiten van de plant- afgeleide producten kan worden bepaald op een snelle en zeer snelle wijze. De analyse van forensisch relevante botanische materiaal zonder de noodzaak voor monstervoorbereiding stappen of lange chromatografischeanalyse looptijden, in aanvulling op de plantensoorten identificatie wordt gerapporteerd.
Protocol
1. Bereiding van Plant Materials
- Kratom Fresh bladmateriaal
- Gebruik een 6 mm diameter perforator uniforme chads van Kratom bladmateriaal van M. te creëren speciosa plant. Herhaal 5 keer.
- Kratom Poeder Extraction
- Meng 5 ml ethanol en 5 ml gedestilleerd water tot 1 maken: 1 oplosmiddelmengsel voor extractie.
- In een 1,5 ml microcentrifugebuis schorsen een kleine hoeveelheid (~ 5 mg) Kratom Bali poeder in 1 ml 1: 1 EtOH: H2O oplosmiddelmengsel. Herhaal 5 keer.
- De ultrasone trillingen Kratom Bali poeder extract monsters in een ultrasoon bad gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de Kratom Bali poeder extract monsters gedurende 2 min bij 750 xg bij kamertemperatuur.
- Giet het oplosmiddel uit resterende poeder voor verdere analyse.
- Datura zaad voorbereiding
- Snijd een D. stramonium zaad in de helft van de overkant van de dwarse vliegtuig met behulp van een scheermesje. Herhaal dit met behulp van 5 verschillende zaden.
- Herhaal dit voor D. inoxia en D. Ferox zaden.
2. Direct Analyse in Real Time Ion Source Parameters
- Heater Gas Temperatuur
- Stel de gaskachel temperatuur van de ionenbron tot 350 ° C.
- ionmodus
- Het gedrag van de analyse in de positieve ion-modus met een netspanning van 250 V.
- Helium gasstroom
- Stel het heliumgas debiet 2,0 l / sec.
3. Time-of-flight Massa Spectrometer Parameters
- orifice Spanningen
- Stel de opening 1 spanning 20 V en de opening 2 tot 5 spanning V
- Ring Lens en Peak Voltage
- Regel de ring lens spanning 5V en verander de pieken spanning tot 600 V.
- Mass Spectral Acquisition
- Stel de massa spectrale overname tarief tot 1 spectrum per seconde over een massabereik van m / z 60-800.
- Mass Spectrometer oplossend vermogen
- Stel het oplossend vermogen van de massaspectrometer 6000 FWHM.
4. Analyse van Plant Materials
- Analyse van Kratom Leaf
- Druk op "Start Run 'in massaspectrometer besturingssoftware. Suspendeer het Tsjaad van plantaardig materiaal tussen de ionenbron en massaspectrometer inlaat (ongeveer 2 cm vanaf de inlaat) met een pincet totdat een spectrum verkregen. Herhaal dit 5 keer met aparte chads van plantaardig materiaal.
- Kalibreer het spectrum met polyethyleenglycol 600 (PEG).
- Dompel het gesloten einde met een smeltpunt capillaire buis in de PEG standaard. Hang de gecoate capillaire betwEen de ionenbron en de massaspectrometer inlaat.
- Na analyse van de PEG-standaard, selecteert u de knop "Stop" om de analytische run te beëindigen.
- Druk op "Start Run 'in massaspectrometer besturingssoftware. Schorsen kleine hoeveelheid gedroogd bladmateriaal tussen de ionenbron en massaspectrometer inlaat met een pincet tot een spectrum verkregen. Herhaal dit 5 keer, het analyseren van nieuwe plantmateriaal per keer.
- Kalibreer het spectrum met PEG.
- Dompel het gesloten einde van een capillair in de PEG standaard. Schorsen de beklede capillaire tussen de ionenbron en de massaspectrometer inlaat.
- Na analyse van de PEG-standaard, selecteert u de knop "Stop" om de analytische run te beëindigen.
- Analyse van Kratom Poeder
- Druk op "Start Run 'in massaspectrometer besturingssoftware. Dompel het gesloten einde van een smeltpuntcapillair in de Kratompoeder.
- verld de beklede capillaire tussen de ionenbron en massaspectrometer inlaat tot een spectrum verkregen. Moet de analyse 5 keer een nieuwe capillaire telkens.
- Kalibreer het spectrum met PEG.
- Dompel het gesloten einde van een capillair in de PEG standaard. Schorsen de beklede capillaire tussen de ionenbron en de massaspectrometer inlaat.
- Na analyse van de PEG-standaard, selecteert u de knop "Stop" om de analytische run te beëindigen.
- Analyse van Kratom Extract
- Dompel het gesloten uiteinde van een capillaire buis in het extract.
- Suspendeer het capillaire buisje in de 12-monsterhouder een lineaire rail aan de massaspectrometer. Herhaal 5 keer met een ander extract elke keer.
- Druk op "Start Run 'in massaspectrometer besturingssoftware. Met behulp van het bedieningspaneel, selecteert u de knop ">" om de lineaire spoor vooraf door de ion stroom met een snelheid van 1 mm / secverzamelen spectra.
- Kalibreer het spectrum met PEG.
- Dompel het gesloten einde van een capillair in de PEG standaard. Schorsen de beklede capillaire tussen de ionenbron en de massaspectrometer inlaat.
- Na analyse van de PEG-standaard, selecteert u de knop "Stop" om de analytische run te beëindigen.
- Analyse van Datura zaden
- Druk op "Start Run 'in massaspectrometer besturingssoftware. Hang de Datura zaad helft tussen de ionenbron en massaspectrometer inlaat met een pincet totdat een spectrum wordt verzameld. Zorg ervoor dat de gesneden kant is gericht op de ionenbron worden geconfronteerd. Herhaal dit 5 keer, het analyseren van een nieuw zaad half elke keer.
- Kalibreer het spectrum met PEG.
- Dompel het gesloten einde van een capillair in de PEG standaard. Schorsen de beklede capillaire tussen de ionenbron en de massaspectrometer inlaat.
- Na analyse van de PEG standaard,selecteert u de knop "Stop" om de analytische run te beëindigen.
- Herhaal stappen 4.4.1-4.4.3 voor elke Datura species.
5. Data Processing
- Vertalen gegevensbestanden
- In de data processing software, selecteert u Bestand, "Vertalen DART Files" met "automatische kalibratie" ingeschakeld, om geijkte data bestanden te maken.
- Klik met de linkermuisknop en sleep een kader rond de eerste piek in het chromatogram en selecteer "Average" om een gemiddeld spectrum te creëren.
- Klik met de rechtermuisknop en sleep een kader rond een gebied waar geen monster werd verzameld en selecteer "Average hele doos als achtergrond" om de achtergrond af te trekken van de gemiddelde spectrum.
- Sla de massa spectrum als een .txt bestand.
- Herhaal stappen 5.1.1-5.1.4 voor elke piek in het chromatogram een gemiddeld spectrum maken voor elke repliceren in het bestand.
- Herhaal stappen 5.1.2-5.1.5 voor elk verzamelde bestand.
6. Statistische analyse
- Principal Component Analysis
- In het classificeren deel van de spectrale analyse software (zie lijst van Materials), onder het tabblad "Set up", klassen voor dataverwerking maken door "Add Class" selecteren.
- Importeer de tekstbestanden van gegevens door "File (s) toevoegen" selecteren.
- gegevensbestanden naar de juiste klasse van de installatie toe te wijzen door het selecteren van tekstbestanden en "Set Class voor geselecteerde bestanden".
- Selecteer functie massa voor discriminatie van MS uit Training Set en stel Threshold% tot 1%.
- Stel een massa tolerantie (MMU) tot 10 en selecteer "Build Vectoren van gegevensbestanden".
- In het gedeelte 'Compute ", uitvoeren van principale componenten analyse door het vakje voor 3D PCA Graph en selecteer" Berekenen ".
- Voer leave-one-out kruis validatie door te kiezen voor "Bevestigen (langzaam!)."
- In het tabblad Frequentie Plot van de spectrale analyse software, het genereren van een warmte-kaart van de gegevens door te kiezen voor "Heat Map."
- Selecteer "Threshold opgeslagen data" overvloed drempel ingesteld op 1%.
- Exporteer de kaart warmte aan een spreadsheet door het selecteren van "Save Hittekaart naar Excel."
- In het spreadsheet programma, sparen de geëxporteerde heat map als een .txt bestand.
- Hiërarchische clustering Analysis
- Importeer de kaart hitte als een .txt bestand in Cluster 3.0 software.
- In het tabblad van de Cluster 3,0 hiërarchisch, onder Genes and Arrays, check boxes "Cluster" en "Bereken gewichten". Stel cutoff op 0,1 en exponent 1. Selecteer enkele linkage clustering om analyses uit te voeren.
- Bekijk de gegenereerde .CDT gegevensbestand in Java Treeview.
Representative Results
Vertegenwoordiger zachte ionisatie positieve-ion modus directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie gegevens van Kratom producten en Datura zaden worden getoond in de figuren 2 en 3. Verschillende verbindingen eerder geïsoleerd uit M. speciosa, waaronder mitragynine (C 23 H 30 N 2 O 4 + H +, m / z 399,2284) en 7-HydroHydroxyMitragynine (C 23 H 30 N 2 O 5 + H +, m / z 415,2233) werden in alle vier gedetecteerde monsters en overeenkomstige massa meetgegevens zijn in Tabel 1. 4-8 Datura Representatieve gegevens worden getoond in figuur 3 en handtekening biomarkers zoals atropine (C 17 H 23 NO 3 + H +, m / z 290,1756) en scopolamine (C 17 H 21 NO 4 + H + M / z 304.1549) werden gedetecteerd in de drie species. Massameting behorend bij figuur 3 worden in tabel 2. 9-12 Verbinding identiteit werd bevestigd door middel elementsamenstelling bepalen, isotoop matching, en vergelijkingen met rapporten in de literatuur. 23-24
Hitte kaart renderings van de directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie spectra van Kratom en Datura zijn weergegeven in figuur 4. De gepresenteerde gegevens werden gebruikt in principal component analysis (PCA) om onderscheid te maken tussen de twee klassen van plantaardige drugs misbruik (Figuur 5). Het PCA plot werd gebouwd met behulp van tien functie massa's (in tabel 3), met blauwe cirkels vertegenwoordigen Kratom data en rode vierkantjes die Datura data. De functie massa geselecteerde overeen met verschillende alkaloïden presenterenDatura of Mitragyna spp., Met inbegrip van de psychoactieve verbindingen atropine, scopolamine, mitragynine en 7-HydroHydroxyMitragynine. 23-24 drie hoofdcomponenten goed voor 75,26% van de variantie en leave-one-out kruis validatie (LOOCV) was 100%. De PSO grafiek toont duidelijk aan dat de Kratom gegevens en Datura data goed worden opgelost van elkaar. PCA analyse onthulde ook dat de afzonderlijke soorten Kratom en de verschillende soorten Datura kunnen worden geïdentificeerd en onderscheiden van elkaar (figuur 6). LOOCV was 94,29% met drie belangrijke componenten die 75,26% van de variantie. De twee varianten van Kratom (Bali in de blauwe cirkels en Rifat in rode vierkantjes) cluster bij elkaar, wat aangeeft dat zij behoren tot de soort M. speciosa, maar worden opgelost van elkaar, waaruit blijkt dat ze vertegenwoordigen verschillende soorten. Bovendien is de Datura species groeperen en gescheiden van de m speciosa data, maar elk van de afzonderlijke soorten Datura (D. inoxia in groene driehoeken, D. stramonium in roze pleinen en D. ferox in turkoois cirkels) zijn duidelijk te onderscheiden. Ondanks een data voor D. stramonium verschijnen om een uitschieter te zijn, wordt het zaad correct geclassificeerd als D. stramonium en niet D. inoxia behulp van PCA. Het belangrijkste is dat het verschil in kleur tussen zaad D. stramonium D. inoxia bevestigt dat ze anders zijn soort en dat de gegevens punt in kwestie niet kan worden D. inoxia.
Hiërarchische clustering (figuur 7) uitgevoerd zonder de a priori selectie van onderdelen massa. In plaats daarvan, de hele groep van de spectrale datasets verspreid over een massabereik van m / z 60-800 werd geïmporteerd in open source genomische clustering software en een dendrogram met deze gegevens werd geproduceerd. De resultaten of HCA bleek ook klasse, soort en ras differentiatie uitsluitend gebaseerd op directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie afgeleide gegevens en bevestigde die van de PCA-analyse. De twee klassen van plantaardige drugs, Kratom en Datura, werden gescheiden in individuele clades van het dendrogram. Bovendien is de Rifat en Bali variëteiten van Kratom werden elk geïsoleerd in individuele sub-clades binnen de Kratom klasse. Evenzo D. inoxia, D. Ferox en D. stramonium werden gesplitst in hun eigen clades per soort binnen de Datura klasse.
Figuur 1. Beelden van M. speciosa (Kratom) producten en Datura spp zaden een: Bali Kratom droog blad; b.. Bali Kratom poeder; c: Rifat Kratom levende planten;
Figuur 2. Direct analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie positief-ion spectra van M. speciosa (Kratom) producten een: Rifat vers blad; b. Bali droog blad; c: Bali poeder; d: Bali poeder extract. De massa meetgegevens in verband met deze spectra worden weergegeven in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie positief-ion spectra van Datura spp. . zaad a: D. Ferox; b: D. inoxia; c: D. stramonium. De massa meetgegevens in verband met deze spectra worden weergegeven in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Heat kaart renderings van de directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie spectra van Kratom en Datura plantaardige materialen. High intensiteit pieken zijn in donkerrood en lagere intensiteit pieken worden aangeduid in lichtere tinten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Principal component analyse (PCA) perceel van Kratom en Datura producten gebouwd met behulp van een directe analyse in real time hoge resolutie massaspectrometrie afgeleide gegevens. Drie belangrijkste componenten (pc's) goed voor 75,26% van de variatie, en het verlof-een- out kruis validatie (LOOCV) was 100%. De functie massa gebruikt voor de PSO zijn opgenomen in Tabel 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Principal component analyse (PCA) perceel van Kratom en Datura producten met behulp van een directe analyse in real-time-high massaspectrometrie data resolutie. Class opdrachten waren gebaseerd op de variëteit (Kratom) of soorten (Datura) van de plantaardige materialen. Drie belangrijkste componenten (pc's) goed voor 75,26% van de variatie en de leave-one-out kruis validatie (LOOCV) was 94,29%. De functie massa's gebruikt voor het PCA zijn opgenomen in Tabel 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Hiërarchische clustering resultaten verkregen met behulp van de directe analyse in real-time-hoge resolutie massaspectrometrie-afgeleide gegevens uit de analyse van Kratom en Datura plantaardige materialen. De twee klassen van planten zijn duidelijk gescheiden in twee verschillende takken in de dendrogram (weergegeven in blauw en rood beugels voor Kratom en Datura, respectievelijk). De Datura zaadsoorten worden ook opgelost van elkaar (in het groen, turkoois en roze gestippelde dozen voor D. inoxia, D. Ferox en D. stramonium respectievelijk). De Kratom plantaardige materialen worden gescheiden door verschillende (weergegeven in rood en blauw gestippelde dozen voor Rifat en Bali, respectievelijk). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. meetgegevens Mass in verband met de zachte ionisatie spectra van Kratom products weergegeven in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Tabel 2. Mass meetgegevens in verband met de zachte ionisatie spectra van Datura zaden weergegeven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Tabel 3. Feature massa gebruikt voor de belangrijkste componenten analyse perceel van Kratom en Datura producten getoond in de figuren 5 en 6.
Discussion
De mogelijkheid om op basis van planten drugs van misbruik te identificeren is van de toenemende noodzaak als gevolg van de dramatische stijging van de marketing, verkoop en consumptie van ongeplande psychoactieve stoffen. 2 Traditionele methoden voor de identificatie van de botanische materiaal meestal sprake karakterisatie van fysische eigenschappen in combinatie met een analyse van de chemische bestanddelen door een koppelteken chromatografische-massaspectrometrische methoden. Echter, beide van deze benaderingen vormen uitdagingen voor de gestroomlijnde analyse. Fysieke eigenschappen van de planten vaak vernietigd wanneer de planten zijn gedroogd, verpulverd of onttrokken tijdens het productieproces en als zodanig, is het vaak moeilijk om een bepaald plantaardig psychotrope product van elkaar onderscheiden op basis van louter fysische eigenschappen. 23 Analyse door chromatografische-massaspectrometrische methoden kan de identificatie van de psychoactieve verbindingen in plantaardige matrices mogelijk te maken, maar de monstervoorbereiding en methode ontwikkeling is tijd eennd arbeidsintensief, en de creatie van nieuwe protocollen voor elke klasse of soort van plantaardige drug is onpraktisch in vele forensische chemie labs.
Directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie omzeilt sommige van deze problemen, zoals complexe matrices zoals bladeren, poeders, extracten en zaden kunnen worden geanalyseerd met weinig monstervoorbereiding. Ondanks de complexe matrices van materialen hier bemonsterd, de psychoactieve bestanddelen waren gemakkelijk te identificeren, zelfs in nanogram concentraties, 21 vanwege de hoge gevoeligheid van de massaspectrometer. Zaden, bladeren en poeders werden aangetoond gemakkelijk worden geanalyseerd door directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie en diverse andere soorten materialen kunnen worden bemonsterd op dezelfde wijze, zoals TLC-platen, munt, tabletten, bloemen, vaste fase micro-extractie (SPME) vezels en zelfs insecten puparial darmen. 21-22 door middel van nauwkeurige massa-analysis, elementaire samenstelling bepalen en isotoop matching, biomarkers en verbindingen van belang kan worden geïdentificeerd, ongeacht of de verbindingen in een blad, gespot op een TLC-plaat of gecoat op een capillaire buis.
Directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie methodologie kan worden gebruikt voor gestroomlijnde analyse omdat er zeer weinig parameters die moeten worden aangepast van experiment tot experiment. Analyse kan worden uitgevoerd in positief-ion of negatieve-ion modus en moleculen tot 3000 amu kan in beide gevallen worden gedetecteerd. Ionisatie in positieve-ion modus gebeurt door proton transfer van geactiveerd water clusters 21 en elke verbinding met een proton affiniteit hoger dan die van water wordt geïoniseerd. Hier werd positief-ion-modus gebruikt vanwege de hoge affiniteit van proton alkaloïden, waardoor ze gemakkelijk worden geïoniseerd door protonering. Analyse negatieve-ion modus kan worden gebruikt voor de succesvolle detectie van Hydrocarbuitbreidingen (zoals O 2 adducten) 21, explosieven 27 en organische zuren zoals artesunaat in malaria medicijnen. 28 Door de ionisatiemethode van proton-overdracht en het onvermogen om meervoudig geladen ionen, directe analyse in realtime hoge resolutie massaproductie spectrometrie is voornamelijk bedoeld voor de analyse van kleine moleculen tot 3000 amu.
Anders dan ionisatie modus, de temperatuur van de ionenbron is een belangrijke parameter en de geschikte temperatuur hangt grotendeels af van het monster dat wordt geanalyseerd. Zo is het belangrijk lagere temperatuur (~ 250 ° C) gebruikt voor SPME vezelanalyse vernietiging van het bekledingsmateriaal op de vezel te voorkomen, terwijl hogere temperaturen (-500 ° C) worden gebruikt voor aminozuuranalyse voor desorptie en verdere ionisatie. Hier werden plantenmateriaal analyses uitgevoerd bij 350 ° C, aangezien dit zorgt voor ionisatie alkaloïden en andere van belang zijnde verbindingen metuit het veroorzaken van pyrolyse van verbindingen in de plant matrix.
Directe analyse realtime-hoge resolutie massaspectrometrie analyse stelt niet alleen de identificatie van de psychoactieve bestanddelen van het plantenmateriaal op basis van nauwkeurige massa, elementaire samenstelling bepalen en isotoop matching, maar levert ook unieke chemische vingerafdrukken kunnen worden benut soortenidentificatie gebruik multivariate statistische analyse met zeer reproduceerbare resultaten, zelfs met kleinere datasets. Multivariate statistische analyse is toegepast op een breed scala van directe analyse in real-time-high massaspectrometrie data resolutie, met inbegrip van die afkomstig is van hout, puparial kozijnen, zaden, bladmateriaal en biodiesel fuelstocks, presentatie van de veelzijdigheid en de reproduceerbaarheid van de methode. 22-26 de high-throughput mogelijkheden van directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie in staat de overname van grote hoeveelheden massa spectral data in een korte tijdsperiode, en het grote aantal herhalingen nodig zijn voor statistische analyse worden gemakkelijk verkregen met deze methode. De directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie massaspectrale dataset van Datura en Kratom bestond uit meer dan 100 individuele spectra die werden verzameld met minder dan een uur van de totale tijdsinvestering. Om hetzelfde aantal spectra middels GC-MS met een oven temperatuurprogramma van 30 minuten zou ongeveer 50 uur te verkrijgen, zonder beschouwing van de extra tijd voor opzuivering, zoals extractie en derivatisering.
Hoofdcomponentenanalyse kan worden gebruikt om verschillen tussen groepen plantenstoffen gebaseerd op de aanwezigheid en de intensiteit van de geselecteerde functie massa markeren. De statistische analyse verwerking verschaft identificatie van soorten, rassen en informatie. Andere werkwijzen voor statistische analyse, zoals hiërarchische clustering analyse (HCA), kan ooktoegepast zonder de a priori selectie van functie massa. De resultaten van HCA van uitgebreide chemische vingerafdrukken laten zien dat zonder toezicht statistische analyse met succes kan worden toegepast voor de identificatie van soorten van plantaardige drugs van misbruik. 25
De soort discriminatie van forensisch botanische materiaal door directe analyse in real time-hoge resolutie massaspectrometrie werd aangetoond met behulp van de identificatie van psychotrope stoffen en andere biomarkers in de soft-ionisatie massaspectra, en de toepassing van multivariate statistische analyse. De toepassing van twee soorten statistische analyses bleek niet alleen dat de klasse van een plantaardig drug kan worden geïdentificeerd, maar dat de variatie en speciës van het geneesmiddel kan worden bepaald op basis van de unieke chemische vingerafdrukken waargenomen door directe analyse real time-hoge resolutie massaspectrometrie. De hier gepresenteerde methode maakt de snelle, snelle identificatie van mind-veranderende substanties op een wijze die uitdagingen in gebruikelijke analytische methoden omzeilt en biedt forensische laboratoria een middel voor het karakteriseren en identificeren van psychoactieve plantmateriaal zonder tijd en arbeidsintensief ontwikkelingsmethode. Dit protocol kan worden uitgebreid tot soorten differentiatie van een verscheidenheid van andere plantaardige materialen. 22-26
Acknowledgments
De auteurs dankbaar erkennen een Universiteit van Albany-SUNY Presidentiële Initiatieven Fonds voor onderzoek en Scholarship in Forensic Science en Cybersecurity subsidie, een National Science Foundation subsidie (Grant # 1310350) en een National Institute of Justice subsidie (Grant # 2015-DN-BX- K057) naar RAM. We erkennen ook Justine E. Giffen voor het nemen van de foto's van de plantaardige materialen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuTOF Mass Spectrometer | JEOL USA, Inc. | ||
| DART-SVP Ion Source | IonSense, Inc. | DART-SVP | |
| Linear Rail System | IonSense, Inc. | HW-10029 | |
| Hole puncher (6 mm) | Swingline | A7074005 | |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner | Cole-Palmer | EQ-08849-00 | |
| 1.5 ml Eppendorf Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| AccuSpin Micro 17R Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100676 | |
| #9 Stainless Steel Razor blade | Stanley | 11-515 | |
| Dip-it Tip Holder | IonSense, Inc. | SCT-70003 | |
| Dip-it Tips | IonSense, Inc. | DPT-110 | |
| Melting Point Capillary | Krackeler Scientific | 1-9530-3 | |
| Polyethylene glycol (600) | Sigma Aldrich | 81180 | |
| Rifat Kratom Live Plant | World Seed Supply Kratom Collection | LIVEKRATOMPLANT | |
| Bali Kratom Dried Leaf | The Kratom King | OZKRAPCOM | |
| Bali Kratom Powder | The Kratom King | OZKRAPCOMPOW | |
| Datura stramonium seeds | Horizon Herbs LLC | PDATUJ | |
| Datura inoxia seeds | Horizon Herbs LLC | PDATUM | |
| Datura ferox seeds | Georgia Vines | 255/737 | |
| Ethanol, anhydrous | Krackeler Scientific | 1328-E402-4L | |
| Mass Mountaineer Spectral Analysis Software | mass-spec-software.com | MM-20030-PCA-DVD | |
| TSSPro3 Data Processing/Data Reduction Software | Shrader Labs | ||
| Cluster 3.0 | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm | Open Source Software | |
| Java Treeview | http://jtreeview.sourceforge.net/ | Open Source Software |
References
- Authority, E.F.S. EFSA Compendium of botanicals that have been reported to contain toxic, addictive, psychotropic or other substances of concern onrequest of EFSA. EFSA Journal. 7, 1-100 (2009).
- The challenge of new psychoactive substances: list of plant-based substances (20 Substances). , UNODC. 101-102 (2013).
- Kratom (Mitragyna speciosa Korth). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/kratom.pdf (2013).
- Jimson Weed (Datura stramonium). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/jimson_w.pdf (2013).
- Jansen, K., Prast, C. Ehtnopharmacology of Kratom and the Mitragyna alkaloids. J. Ethnopharmacol. 23, 115-119 (1988).
- Matsumoto, K. Pharmacological Studies on 7-Hydroxymitragynine, Isolated from the Thai Herbal Medicine Mitragyna speciosa: Discovery of an Orally Active Opioid Analgesic. , Chiba University. (2006).
- Matsumoto, K., et al. Involvement of µ-opioid receptors in antinociception and inhibition of gastrointestinal transit induced by 7-hydroxymitragynine, isolated from Thai herbal medicine Mitragyna speciosa. Eur. J. Pharmacol. 549, (2006).
- Matsumoto, K., et al. Antinociceptive effect of 7-hydroxymitragynine in mice: Discovery of an orally active opioid analgesic from the Thai medicinal herb Mitragyna speciosa. Life Sciences. 74, 2143-2155 (2004).
- El Bazaoui, A., Stambouli, H., Bellimam, M. A., Soulaymani, A. Determination of tropane alkaloids in seeds of Datura stramonium L. by GC/MS and LC/MS. Ann. Toxicol. Anal. 21, 183-188 (2009).
- Friedman, M., Levin, C. E. Composition of Jimson Weed (Datura stramonium) seeds. J. Agr. Food Chem. 37, 998-1005 (1989).
- Philipof, S., Berkhov, S. GC-MS Investigation of tropane alkaloids in Datura stramonium. Z Naturforsch. 57, 559-561 (2002).
- Preissel, U., Preissel, H. -G. Brugmansia and Datura: Angel's Trumpets and Thorn Apples. , Firefly Books. (2002).
- Boumba, V. A., Mitselou, A., Vougiouklakis, T. Fatal poisoning from ingestion of Datura stramonium seeds. Vet. Hum. Toxicol. 46, 81-82 (2004).
- Kronstrand, R., Roman, M., Thelander, G., Eriksson, A. Unintentional Fatal Intoxications with Mitragynine and O-Desmethyltramadol from the Herbal Blend Krypton. J. Anal. Toxicol. 35, 242-247 (2011).
- Neerman, M., Frost, R., Deking, J. A drug fatality involving Kratom. J. Forensic Sci. 58, 278-279 (2013).
- Steenkamp, P. A., Harding, N. M., Van Heerden, F. R., Van Wyk, B. -E. Fatal Datura poisoning: Identification of atropine and scopolamine by high performance liquid chromatography / photodiode array / mass spectrometry. Forensic Sci. Int. 145, 31-39 (2004).
- Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drug Recommendations. , Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs. (2014).
- Kikura-Hanajiri, R., et al. Simultaneous analysis of mitragynine, 7-hydroxymitragynine, and other alkaloids in the psychotropic plant "Kratom" (Mitragyna speciosa) by LC-ESI-MS. Forensic Toxicol. 27, 67-74 (2009).
- Wang, M., et al. Comparison of three chromatographic techniques for the detection of mitragynine and other indole and oxindole alkaloids in Mitragyna speciosa (Kratom) plants. J. Separation Sci. , (2014).
- Cody, R. Observation of molecular ions and analysis of nonpolar compounds with the Direct Analysis in Real Time ion source. Anal. Chem. 81, 1101-1107 (2009).
- Cody, R., Laramee, J., Durst, H. D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions. Anal. Chem. 77, 2297-2302 (2005).
- Musah, R. A., et al. A High Throughput Ambient Mass Spectrometric Approach to Species Identification and Classification from Chemical Fingerprint Signatures. Sci. Rep. 5, (2015).
- Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Rapid detection by direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) of psychoactive plant drugs of abuse: The case of Mitragyna speciosa aka "Kratom". Forensic Sci. Int. 242, 210-218 (2014).
- Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Plant Seed Species Identification from Chemical Fingerprints: A High-Throughput Application of Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry. Anal. Chem. , (2015).
- Espinoza, E. O., et al. Distinguishing wild from cultivated agarwood (Aquilaria spp.) using direct analysis in real time and time of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 281-289 (2014).
- Lancaster, C., Espinoza, E. Evaluating agarwood products for 2-(2-phenylethyl)chromones using direct analysis in real time time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2649-2656 (2012).
- Sisco, E., Dake, J., Bridge, C. "Screening for trace explosives by AccuTOF™-DART®: An in-depth validation study.". Forensic Sci. Int. 232, 160-168 (2013).
- Fernandez, F. M., et al. Characterizatoin of solid counterfeit drug samples by desorption electrospray ionization and direct analysis in real time coupld to time-of-flight mass spectrometry. Chem. Med. Chem. 1, 702-705 (2006).
