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Bioengineering

के लिए हेपरिन बाध्यकारी डोमेन osteogenic विकास फैक्टर प्रसव Polyelectrolyte परिसर

Published: August 22, 2016 doi: 10.3791/54202
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 3,4, 5, 1,4
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

Abstract

पुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी के दौरान वृद्धि कारकों की supraphysiological मात्रा में अनुभव से मचानों पर लोड कर रहे सफल हड्डी संलयन बढ़ावा देने के लिए। अत्यधिक शक्तिशाली जैविक एजेंटों की बड़ी खुराक तेजी से enzymatic गिरावट का एक परिणाम के रूप में वृद्धि कारक अस्थिरता के साथ ही प्रत्यारोपण स्थलों पर विकास का पहलू की पर्याप्त मात्रा में स्थानीयकृत करने में वाहक अक्षमताओं के कारण आवश्यक हैं। इसलिए, रणनीति है कि इस तरह के बीएमपी -2 / नेल-1 के रूप में वृद्धि कारकों की स्थिरता लम्बा, और उनकी रिहाई पर नियंत्रण वास्तव में उनके प्रभावशाली खुराक को कम कर सकता है और इस तरह भविष्य हड्डी पुनर्जनन सर्जरी के दौरान बड़ी मात्रा की आवश्यकता को कम। बदले में यह दुष्प्रभाव और वृद्धि कारक लागत कम हो जाएगा। आत्म इकट्ठे पेक्स में विवो स्थिरता को बढ़ाने के द्वारा हेपरिन बंधन और आगे शक्ति प्रदान वृद्धि कारक bioactivity के माध्यम से बीएमपी -2 / नेल-1 प्रसव के बेहतर नियंत्रण प्रदान करने के लिए निर्मित किया गया है। यहाँ हम पीईसी निर्माण की सादगी जो delive में एड्स को समझानापुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी के दौरान विकास के कारकों की एक किस्म की ry।

Introduction

Pseudoarthrosis की घटनाओं अपक्षयी रीढ़ की हड्डी में फ्यूजन और संशोधन स्पाइनल सर्जरी 1 में 10 से 45% के रूप में उच्च के रूप में होने की सूचना दी गई है। रीढ़ संलयन और अन्य पुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी, ऐसे बीएमपी -2, नेल-1 1 और प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) के रूप में osteogenic वृद्धि कारक नए सिरे से osteogenesis बढ़ावा देने के लिए शुरू किया गया है के दौरान Pseudarthrosis की दर को कम करने के लिए। इन के अलावा, बीएमपी -2 स्पाइनल फ्यूजन 2 के लिए एक शानदार विकल्प है। हालांकि उत्प्रेरण और नई हड्डी गठन को सुविधाजनक बनाने में बीएमपी -2 की शक्ति अच्छी तरह से 3 स्थापित किया गया है; ऐसे Heterotopic हड्डी गठन, seroma और रक्तार्बुद, भड़काऊ प्रतिक्रिया, radiculitis, कशेरुका शरीर osteolysis, और प्रतिगामी स्खलन के रूप में चिकित्सकीय महत्वपूर्ण जटिलताओं supraphysiological 4,5 इस्तेमाल किया मात्रा के कारण चिंता के मुद्दों होना जारी है।

इसलिए, बीएमपी -2 की खुराक कम से कम में एक प्रासंगिक रणनीति बनी हुई हैदुष्प्रभाव को कम करने के लिए tempts। इसके अलावा, कुशल वाहक सिस्टम बीएमपी -2 समकालीन कोलेजन स्पंज वाहक प्रणालियों में मनाया की प्रारंभिक फट रिहाई को दबाने और आगे इस शक्तिशाली साइटोकाइन के लंबे समय तक और स्थानीय प्रसव को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं। परत दर परत cationic और ऋणात्मक polyelectrolytes बारी की आत्म विधानसभा पाड़ matrices या प्रत्यारोपण सामग्री 6 की सतह पर polyelectrolyte परिसरों का निर्माण करने के लिए एक ट्यून करने योग्य पद्धति के रूप में नियोजित किया जा सकता है। इस संबंध में, हेपरिन (सभी जैविक एजेंटों के उच्चतम नकारात्मक चार्ज घनत्व होने के लिए जाना जाता है) उत्सुकतापूर्वक इलेक्ट्रोस्टैटिक और हेपरिन बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से विकास के कारकों की एक किस्म के साथ बाँध के लिए मान्यता दी गई है। दरअसल, हेपरिन आधा जीवन को लम्बा और इस तरह कई वृद्धि कारकों की bioactivity शक्ति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है।

इस के आधार पर, हमारे समूह एक हेपरिन आधारित polyelectrolyte जटिल (पीईसी) है कि निर्माण करने के लिए एक परत दर परत आत्म विधानसभा प्रोटोकॉल अनुकूलित भार और स्थिरीकरण 7.8 दौरान osteogenic वृद्धि कारकों की bioactivities बरकरार रखता है। alginate microbead कोर α एल guluronate (G) द्विसंयोजक केशन कैल्शियम या स्ट्रोंटियम आयनों के साथ alginate के अवशेषों crosslinking द्वारा निर्मित किया गया था। alginate कोर एक biodegradable पाड़ मैट्रिक्स है; जो आरोपण के बाद, यह संलयन बिस्तर बोनी अंतर्वृद्धि के लिए कमरे उपलब्ध कराने में resorbed है। पाली एल लाइसिन (पीएलएल) या protamine cationic परत दोनों पाड़ मैट्रिक्स (इस मामले में, alginate microbead वाहक कोर) और नकारात्मक आरोप लगाया हेपरिन के साथ जिल्द के रूप में प्रयोग किया जाता है; ऋणात्मक हेपरिन परत कार्यों को स्थिर और भरी हुई वृद्धि कारक स्थानीय बनाना है। ट्रिपल परत पीईसी एक सुअर का मॉडल 9 में वृद्धि कारक लदान क्षमता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में, पीईसी वाहक सफलतापूर्वक चूहा 10 और रीढ़ की हड्डी में फ्यूजन 8 की सुअर का मॉडल में कम से कम 20 गुना से बीएमपी -2 के प्रभावी खुराक को कम करने के लिए दिखाया गया है।

ntent "> यहाँ, हम रीढ़ की हड्डी में फ्यूजन में बढ़ाया वृद्धि कारक वितरण और अन्य पुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी के लिए fabricating पेक्स के तरीकों के लिए एक मॉडल osteogenic विकास कारक के रूप में बीएमपी -2 का उपयोग कर रिपोर्ट।

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Protocol

1. Alginate समाधान तैयार

  1. सोडियम alginate (गैर विकिरणित) या 8 mrad के 400 मिलीग्राम से 200 मिलीग्राम भंग 10 मिलीलीटर दोहरा आसुत जल में सोडियम alginate किरणित और 1 गैर निकलने alginate के लिए मानव संसाधन और विकिरणित alginate के लिए 15 मिनट के लिए हिला। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर alginate समाधान स्टोर। alginate microbead निर्माण से पहले एक बाँझ 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ alginate समाधान फ़िल्टर।

2. Alginate Microbead निर्माण

  1. इलेक्ट्रोस्टैटिक मनका जनरेटर और 70% इथेनॉल के साथ सिरिंज पंप शुद्ध करना और उन्हें एक द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा मंत्रिमंडल (चित्रा 1) में जगह है।
  2. मनका जनरेटर के अंदर एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक गिलास बेसिन रखें।
  3. बेसिन के ऊपर 9 सेमी मनका जनरेटर के हाथ इलेक्ट्रोड सेट करें।
  4. हाथ इलेक्ट्रोड के knurled पेंच से 2 मनका जनरेटर के इलेक्ट्रोड केबल कनेक्ट, और में SrCl 2 समाधान के 80 मिलीलीटर डालनाघाटी।
  5. लोड 0.2 माइक्रोन सिरिंज और रबर ट्यूब में फ़िल्टर alginate समाधान के 5 मिलीलीटर। हाथ इलेक्ट्रोड के लिए रबर ट्यूब को जोड़ने के बाद, ट्यूबिंग अंदर हवा निष्कासित और नोजल की नोक से alginate समाधान देने के लिए 2 मिनट के लिए 5 मिलीग्राम / घंटा पर सिरिंज पंप पर स्विच। सिरिंज पंप बंद कर दें।
  6. अगले, encapsulator पर स्विच और फिर, सिरिंज पंप microbead पीढ़ी शुरू करने के लिए। 5 मिलीग्राम / घंटा पर alginate प्रवाह दर और encapsulator पर 5.8 केवी वोल्टेज सेट। पहले दो मिनट (या प्रारंभिक 0.5 मिलीलीटर alginate समाधान सिरिंज से बाहर पंप) के दौरान उत्पन्न microbeads त्यागें, के रूप में इन microbeads अनियमित आकार और आकार का हो जाते हैं।
  7. 0.2 एम स्ट्रोंटियम क्लोराइड समाधान में बाद में microbeads लीजिए। alginate समाधान की पूर्व नियोजित मात्रा पंप करने के बाद दोनों सिरिंज पंप और encapsulator (इसी क्रम में) बंद करें। microbead निर्माण के बाद के बैचों के लिए इस दोहराएँ। पूरा होने पर, की बारीएफ सिरिंज पंप पहला, encapsulator द्वारा पीछा किया।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 एम स्ट्रोंटियम क्लोराइड समाधान के 20 मिलीलीटर में microbeads स्टोर में रात भर जोड़ने पार पूरा करने और जेल को स्थिर करने के लिए।

3. Alginate microbeads का आकार मापन

  1. एक प्लास्टिक विंदुक के साथ alginate microbeads के 0.5 मिलीलीटर लीजिए और एक गिलास स्लाइड पर जगह है। 10X बढ़ाई पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत microbeads देखें। microbeads के दस छवियों को एक माइक्रोस्कोप सीसीडी कैमरा के साथ ले लो। संकल्प 2048 x 1,536 पर झगड़ा प्रारूप में बड़े पैमाने बार (500 माइक्रोन) के साथ छवियों को बचाओ।
  2. ImageJ में लंबाई उपकरणों का उपयोग करना, microbeads और पैमाने पर पट्टी (चित्रा 2) के आकार को मापने। माइक्रोमीटर के लिए पिक्सेल से microbeads लंबाई कन्वर्ट।
    1. लाइन उपकरण पर क्लिक करें और alginate मनका के बीच में एक रेखा खींचना।
    2. मेनू पट्टी पर "विश्लेषण" और "उपाय" पर क्लिक करें। एक पॉप अप विंडो दिखाई देगा।
    3. पैमाने पर पट्टी x 500 माइक्रोन की alginate मनका / लंबाई की लंबाई: सूत्र का उपयोग करके वास्तविक लंबाई को alginate मनका के व्यास कन्वर्ट। उदाहरण के लिए, 1.420 (व्यास ImageJ से मापा) / 2.657 (पैमाने पर पट्टी की लंबाई ImageJ से मापा) * 500 माइक्रोन = 267 माइक्रोन।
  3. 100 microbeads का औसत आकार पर विचार करें (मानक विचलन ± मतलब है) microbeads के प्रत्येक बैच के प्रतिनिधि के रूप में आकार।

4. बंध्याकरण

  1. एक 100 माइक्रोन नायलॉन झरनी का उपयोग कर microbeads लीजिए और दोहरा आसुत जल के साथ मोती धो लें।
  2. एक रंग का प्रयोग, एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सभी 0.1 मिलीलीटर alginate समाधान से बना microbeads हस्तांतरण और सुखाने को रोकने के लिए धुंध के साथ कवर किया।
  3. अंत में, तरल मोड का उपयोग autoclaving द्वारा microbeads बाँझ (115 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) या एम के अनुसारanufacturer की विशेषताओं। आसुत जल के 1.5 एल चैम्बर में जोड़े सूखने से मोती को रोकने के लिए।

5. Protamine और हेपरिन कोटिंग

  1. अंदर बीएसएल -2 डाकू, 2 मिलीग्राम / एमएल protamine समाधान कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग निष्फल) के 1 मिलीलीटर के साथ बाँझ microbeads सेते हैं।
  2. 1 घंटा (5.1 कदम) के लिए microbeads incubating के बाद, सूक्ष्म bicinchoninic एसिड (microBCA) परीक्षण (धारा 6) protamine समाधान के 150 μl इकट्ठा।
  3. protamine लेपित microbeads दोहरा आसुत जल के साथ दो बार धोएं। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 200 XG पर एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर नीचे स्पिन। centrifugation के बाद, पानी एक सिरिंज का उपयोग aspirate।
  4. 0.5 मिलीग्राम के 1 मिलीलीटर के साथ protamine लेपित microbeads सेते / एमएल हेपरिन समाधान polyelectrolyte परिसर बनाने के लिए 30 मिनट (पीईसी) के लिए (एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग निष्फल)।
  5. protamine लेपित microbeads च incubating के बादया 30 मिनट (चरण 5.4), हेपरिन सामग्री (धारा 7) निर्धारित करने के लिए हेपरिन समाधान के 400 μl इकट्ठा।
  6. ऊष्मायन के बाद, डबल आसुत जल के साथ दो बार धोने से पेक्स से अपार हेपरिन से धो लो।

6. Protamine सामग्री

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार microBCA परीक्षण प्रदर्शन। संक्षेप में, एक 96 अच्छी तरह से थाली में 150 μl protamine समाधान (पहले और microbeads के साथ ऊष्मायन के बाद एकत्र) जोड़ें। 150 μl microBCA काम कर समाधान जोड़ें।
  2. अंशांकन मानकों के रूप में एल्बुमिन समाधान (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 और 200 माइक्रोग्राम / एमएल) का प्रयोग करें।
  3. 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं। 562 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ absorbance के उपाय।
  4. प्रत्येक अज्ञात निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूने के protamine एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए मानक वक्र का प्रयोग करें।
  5. में protamine की कुल राशि को घटाकर microbeads की protamine सामग्री का निर्धारणकोटिंग समाधान (microbeads के साथ ऊष्मायन से पहले) कोटिंग समाधान (microbeads के साथ ऊष्मायन के बाद) में शेष protamine की राशि से।

7. हेपरिन सामग्री

  1. 4 मिलीग्राम toluidine नीले और 0.01 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड में 20 मिलीग्राम सोडियम क्लोराइड भंग द्वारा काम कर समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. 3 और 30 सेकंड के लिए भंवर: के 2 के अनुपात में काम कर समाधान करने के लिए नमूना (5.5 कदम से) के 400 μl जोड़ें।
  3. एन-हेक्सेन (काम अभिकर्मक समाधान के बराबर मात्रा) के 600 μl जोड़ें और toluidine नीले हेपरिन जटिल निकालने के लिए मिश्रण भंवर।
  4. महाप्राण चरण जुदाई के बाद सिरिंज से जलीय चरण के 200 μl।
  5. संयुक्त राष्ट्र के निकाले toluidine नीले रंग की राशि 631 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग जलीय चरण में निहित उपाय।
  6. 0-20 माइक्रोग्राम / एमएल के हेपरिन मानक समाधान तैयार करें।
  7. माइक्रोग्राम / मी में प्रत्येक हेपरिन मानक बनाम हेपरिन एकाग्रता की 631 एनएम पढ़ने प्लॉटएल। प्रत्येक नमूने की हेपरिन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए मानक वक्र का प्रयोग करें।

8. परत दर परत संरचना के confocal छवि

  1. बनाना protamine, हेपरिन और नेल-1 / बीएमपी -2 फ्लोरोसेंट अनुरूप CF-405 protamine (नीला), सीएफ 594 हेपरिन (लाल) और FITC नेल-1 / FITC लेबल (हरा) बीएमपी -2 + हेपरिन + protamine के अनुसार निर्माता के लेबल तकनीकी डाटा शीट।
  2. कोट 100 फ्लोरोसेंट एनालॉग के 300 μl के साथ माइक्रोग्राम microbeads (कोटिंग विधि 5.3-5.6 में वर्णित) CF-405 protamine (नीला) (2 मिलीग्राम / एमएल, 1 घंटा ऊष्मायन), सीएफ 594 हेपरिन (लाल) (0.5 मिलीग्राम / एमएल, 30 मिनट) और FITC लेबल नेल-1 / FITC लेबल (हरा) बीएमपी -2 (1.5 मिलीग्राम / एमएल, रातोंरात)। अपार फ्लोरोसेंट protamine, हेपरिन और नेल-1 / बीएमपी -2 समाप्त करने के लिए आसुत जल के साथ दो बार microbeads धो लें।
  3. 10X बढ़ाई पर एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करके परत दर परत संरचना (चित्रा 3) का निरीक्षण करें। 7

9. बीएमपी -2और नेल-1 तेज और रिलीज

  1. लोड पीईसी के 100 माइक्रोग्राम पर बीएमपी -2 या नेल -1 समाधान के 1.5 मिलीग्राम / एमएल के 13.3 μl। 30 10 घंटे के लिए मिलाते हुए आरपीएम के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर पीईसी सेते हैं।
  2. लगातार झटकों (30 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर में microbeads विसर्जित कर दिया।
  3. सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर लीजिए और 1, 3, 6, 10 और 14 दिनों के बाद 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ बदलें।
  4. तेज मूल्यांकन और बीएमपी -2 की दक्षता में रिलीज निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एलिसा विधि का उपयोग कर। तेज मूल्यांकन करें और नेल-1 की दक्षता को रिहा निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार carboxybenzoyl क्विनोलिन-2-carboxaldehyde (CBQCA) प्रोटीन परख विधि के प्रयोग से।
  5. समय (टी) में संचयी रिहाई का निर्धारण करते हैं:
    समय समय (टी) + पिछले रिलीज में समय (टी) = रिहाई पर संचयी रिलीज (टी -1)।
  6. समय के खिलाफ बीएमपी -2 और नेल-1 की संचयी रिहाई प्लॉट।

10 में इन विट्रो bioactivityनेल-1 की

नोट: नेल-1 पीईसी से जारी की bioactivity खरगोश अस्थि मज्जा स्टेम सेल (rBMSC) में alkaline फॉस्फेट (एएलपी) की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए अपनी क्षमता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था।

  1. बीज 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 20,000 rBMSCs और उन्हें भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% के 1 मिलीलीटर के साथ एक दिन के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. 24 घंटे के बाद, एक osteogenic मध्यम (DMEM के 1 मिलीलीटर 10% FBS, 2% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड, 10 mmol / एल बीटा glycerophosphate के साथ पूरक के साथ मध्यम जगह है, और 10 -8 मोल / एल dexamethasone ) 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिन और 5% सीओ 2 के लिए।
  3. 300 माइक्रोग्राम पीईसी-नेल-1 (टीसी डालने) और पीईसी सेल संस्कृति आवेषण के अंदर (कदम 8.2 से) की जगह पेक्स कोशिकाओं (इस osteogenic मध्यम परिवर्तन के दौरान पीईसी microbeads की वार्शआउट से बचा जाता है) से अलग रखने के लिए। प्लेस टीसी अच्छी तरह से 24 में सम्मिलित पीएल14 दिनों के लिए खा लिया।
  4. एक बार हर तीन दिन, महाप्राण टीसी डालने के बाहर एक सुई रखकर osteogenic माध्यम के 1 मिलीलीटर, और ताजा osteogenic माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  5. ऊष्मायन के 7 और 14 दिनों के बाद, किट निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक एएलपी परख किट के साथ एएलपी गतिविधि का निर्धारण।
    1. परख 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% TritonX -100 युक्त बफर के साथ कोशिकाओं lyse। एक सेल खुरचनी का उपयोग पालन कोशिकाओं परिमार्जन। कम से कम 60 मिनट के लिए आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेते हैं।
    2. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2500 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। एएलपी परख के लिए सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    3. 200 से 0 एनजी / एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए मिलीलीटर क्रमानुसार पतला alkaline फॉस्फेट मानक समाधान के 50 μl जोड़ें। alkaline फॉस्फेट मानक के अंतिम मात्रा में 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15, और 0 एनजी अच्छी तरह से कर रहे हैं /।
    4. कदम 10.5.2 से सतह पर तैरनेवाला जोड़ें (50 μl / अच्छी तरह से) और कमजोर पड़ने बी के साथ पतलाuffer।
    5. प्रत्येक कुएं में पी -nitrophenyl फॉस्फेट (pNPP) सब्सट्रेट समाधान के 50 μl जोड़ें। धीरे 30 सेकंड के लिए थाली झटकों से अभिकर्मकों मिक्स। अंधेरे में 30 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं। प्लेट रीडर द्वारा 405 एनएम पर absorbance के उपाय।
    6. अंशांकन वक्र का उपयोग एएलपी गतिविधि की गणना।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार microBCA प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन सामग्री का निर्धारण। प्रोटीन सामग्री से एएलपी गतिविधि को विभाजित करके एएलपी गतिविधि मानक के अनुसार।

11. सेल व्यवहार्यता

  1. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) के लिए 24 घंटा -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DMEM + 10% FBS के 1 मिलीलीटर के साथ पीईसी-नेल-1 की 200 मिलीग्राम सेते परख।
  2. बीज 2,000 rBMSCs प्रति अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में (100 10% FBS के साथ DMEM के μl में) और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 1 दिन के लिए सेते हैं।
  3. पीईसी-नेल-1 / पीईसी निकालने के 100 μl के साथ DMEM + 10% FBS बदलें और सेते37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2।
  4. 1 दिन या ऊष्मायन के 3 दिन बाद, 5 मिलीग्राम / एमएल MTT समाधान के 10 μl जोड़ें और आगे अंधेरे में 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl DMSO समाधान जोड़ें formazan क्रिस्टल भंग करने के लिए।
  6. 570 एक microplate रीडर का उपयोग कर एनएम पर absorbance निर्धारित करते हैं।
  7. गणना के सापेक्ष विकास दर:
    1 समीकरण

12. पाड़ और बीएमपी -2 और नेल -1 लोड हो रहा है में पैकेजिंग

  1. एक bioresorbable चिकित्सा ग्रेड पॉलिकैप्रोलैक्टोन के छिद्रों में पेक्स पैक - त्रिकोणीय कैल्शियम फास्फेट (एमपीसीएल-टीसीपी) पाड़ एक बीएसएल -2 कक्ष के अंदर एक निष्फल रंग का उपयोग।
  2. 1.5 मिलीग्राम / बीएमपी -2 या नेल-1 मिलीलीटर समाधान एमपीसीएल-टीसीपी पाड़ पीईसी के साथ पैक पर जोड़ें और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

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Representative Results

हमारे वाहक में, protamine के रूप में यह समान रासायनिक गुण है पाली एल लाइसिन की एक विकल्प के रूप में चुना गया था और यह एफडीए हेपरिन की एक दवा के रूप में मंजूरी दे दी है। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप नतीजे बताते हैं कि गैर विकिरणित microbeads 267 ± 14 माइक्रोन की एक व्यास के साथ आकार में गोलाकार थे। (0.35 मिमी की नोक, 5 मिलीलीटर / घंटा और 5.8 केवी के प्रवाह की दर)। विकिरणित microbeads के बहुमत अश्रु आकार के हैं। व्यास विकिरणित microbeads का दौर हिस्से पर मापा 212 ± 30 माइक्रोन (0.35 मिमी नोक, प्रवाह 4 मिलीलीटर / घंटा और 6 केवी की दर) था। (चित्रा 4)।

पीईसी microbeads के Confocal छवियों CF-405 लेबल protamine (नीला), CF594 लेबल हेपरिन (लाल) और FITC-बीएमपी -2 / FITC-नेल-1 (हरा) की कोटिंग परत दर परत प्रकट करते हैं। परिणामों से संकेत मिलता है कि पेक्स के साथ बाध्य कर सकते हैं सकारात्मक बीएमपी -2 का आरोप लगाया और नकारात्मक हेपरिन बिंदी के माध्यम से नेल-1 का आरोप लगायाएनजी डोमेन (चित्रा 5)। यह पता चलता है कि पेक्स और osteogenic में वृद्धि कारकों के बीच बातचीत निर्भर चार्ज नहीं है।

साबित करने के लिए पेक्स तेज और रिलीज बीएमपी -2 कर सकते हैं कि, हम बीएमपी -2 ऊष्मायन के बाद शेष की राशि और दिन 1, 3, 6, 10 और 14 पर पीबीएस में बीएमपी -2 की राशि निर्धारित करने के लिए एक एलिसा परख इस्तेमाल । हालांकि, एक समान दृष्टिकोण नेल -1 प्रोटीन के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करता है, ब्लॉक एंटीबॉडी बाध्यकारी साइट हेपरिन, काफी संकेत को कम करने के बाद से। इसलिए, CBQCA प्रोटीन परख पीईसी-नेल -1 और पीईसी के बीच अंतर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। संचयी रिहाई की अवस्था से, पेक्स न केवल बीएमपी -2 की तुलना में एक उच्च नेल -1 तेज दक्षता दिखाने पर भी यह बहुत बीएमपी -2 की तुलना में धीमी रिहाई (चित्रा (नेल-1: 25%: 20 बनाम बीएमपी 2%) 6)। यह पता चलता है कि पेक्स बीएमपी -2 से नेल-1 के साथ और अधिक मजबूती से बाँध।

फादरओम MTT परख, पीईसी-नेल-1 साइटोटोक्सिक नहीं है (चित्रा 7)। परिणाम पिछले एक अध्ययन में 7 Alamar ब्लू परख परिणाम के साथ मेल खाता है। हेपरिन जो पीईसी के biocompatibility बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है protamine के सकारात्मक प्रभारी बेअसर।

कि क्या पीईसी से नेल-1 रिहाई के लिए लंबी अवधि के osteogenic भेदभाव, एक osteogenic मार्कर की अभिव्यक्ति के स्तर, क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) को प्रभावित करता है निर्धारित करने के लिए, एक वर्णमिति परख द्वारा जांच की गई। पीईसी से नेल -1 रिलीज के दिन 14 पीईसी नियंत्रण समूह (8 चित्रा) की तुलना में 2.2 गुना से खरगोश अस्थि मज्जा स्टेम सेल के एएलपी गतिविधि बढ़ जाती है। बीएमपी -2 अधिकतम दिन 7. दोनों पीईसी-बीएमपी -2 और पीईसी-बीएमपी -2 + अतिरिक्त बीएमपी -2 शो गतिविधि के 9 दिन में कमी पर एएलपी गतिविधि की वृद्धि (3.75 गुना) से पता चलता है।

पीईसी के बिना माध्यम में बीएमपी-2 के साथ एएलपी गतिविधि में दिखाया गया है विवो में, वृद्धि कारक वाहक द्वारा दिया जाना चाहिए वार्शआउट से बचने के लिए। हमारे कृंतक और सुअर का मॉडल से, हम 20 गुना और 6 गुना क्रमश: बीएमपी -2 की खुराक कम कर सकते हैं। की कमी न केवल अवांछित दुष्प्रभावों को कम करता है, लेकिन यह भी नीचे वृद्धि कारक के उपयोग की लागत में कटौती।

आकृति 1
चित्रा 1: इलेक्ट्रोस्टैटिक मनका जनरेटर और सिरिंज पंप बीएसएल -2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में (ए) नोक नोक धारक पर सुरक्षित की स्थापना की।। (बी) स्ट्रोंटियम क्लोराइड समाधान के लिए बिग बेसिन। (सी) इलेक्ट्रोड केबल। (डी) नली alginate समाधान देता है। (ई) नोक धारक और बांह। (एफ) इलेक्ट्रोड की आपूर्ति टीवह संभावित अंतर मनका आकार को विनियमित करने के लिए। (G) चुंबकीय उत्तेजक। (एच) 5 मिलीलीटर सिरिंज। (मैं) सिरिंज पंप alginate प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए। (जे) आंदोलनकारी नियंत्रण घुंडी सरगर्मी गति को नियंत्रित करने के लिए। (कश्मीर) वोल्टेज नियंत्रण घुंडी 0-10 केवी के बीच संभावित अंतर को विनियमित करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: माप ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ alginate microbeads → ओपन फाइल पर क्लिक करके छवि फ़ाइल खोलने के बाद, का पालन करें चरण 1:। लाइन उपकरण क्लिक करें और alginate microbeads पर एक रेखा खींचना। चरण 2 में, मेनू पट्टी और एक पॉप-अप विंडो दिखाई देगा पर विश्लेषण क्लिक करें। दोहराएँ चरण 1 और चरण 2 जब तक सभी microbeads विदेश मंत्रालय हैंआश्वस्त। चरण 3 में, लाइन टूल क्लिक करें पैमाने पर पट्टी भर में एक रेखा खींचना और पैमाने पर पट्टी की लंबाई को मापने। सूत्र का उपयोग करके माइक्रोन कन्वर्ट करने के लिए microbeads लंबाई:। स्केल बार की alginate / लंबाई की लंबाई x 500 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सबसे बाहरी परत पर Polyelectrolyte परिसर की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व Alginate कोर (गहरे हरे रंग) सकारात्मक चार्ज protamine परत (हरे रंग पीला), नकारात्मक चार्ज हेपरिन परत (लाल), osteogenic वृद्धि कारक, जैसे, बीएमपी -2 / नेल-1 (पीला नीला)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4:। Alginate microbeads के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (ए) गैर किरणित। (बी) 8M रेड किरणित। गैर-विकिरणित alginate microbeads गोलाकार होते हैं और 8M रेड किरणित समकक्ष अश्रु के आकार का है। बढ़ाई 100X। (स्केल बार = 500 माइक्रोन।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:।, Protamine, हेपरिन के फ्लोरोसेंट analogues के साथ incubated नेल -1 और बीएमपी -2 alginate microbeads के Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी छवियों (ए) CF 405 Protamine (नीला), (बी) CF 594 हेपरिन (लाल), (ग ) FITC नेल-1 (हरा), और (डी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। तेज और बीएमपी -2 और नेल-1 की रिहाई (ए) नेल -1 प्रोटीन (काला) की तेज बीएमपी -2 (लाल), (बी) बीएमपी -2 (लाल) और NELL- का संचयी रिहाई वक्र 1 (काला) पीईसी वाहक से। परिणाम मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7 <br /> चित्रा 7:। cytotoxicity परख (ए) खरगोश अस्थि मज्जा का MTT परख तनों पर protamine आधारित पीईसी नेल-1 200 मिलीग्राम / एमएल (काला) निकाल, पीईसी-नेल-1 100 मिलीग्राम / एमएल निकालने (सफेद) के साथ सेल दिन 1 और 3 (बी) खरगोश अस्थि मज्जा का Alamar ब्लू परख उपजा पीईसी बीएमपी -2 (नीला) के साथ सेल, पीईसी (हरा) प्रयोगों तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया और परिणाम मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यहाँ देखने के लिए क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: बीएमपी -2 और पीईसी वाहक से नेल-1 रिहाई के लिए bioactivity परख (ए) खरगोश अस्थि मज्जा स्टेम सेल पीईसी-नेल-1 (काला), पीईसी (लाल) के साथ incubated के एएलपी गतिविधि।। एएलपी गतिविधि 405 एनएम पर absorbance के रूप में मापा गया था। 2.2गुना एएलपी गतिविधि में वृद्धि पीईसी-नेल-1 दिन 14. (बी) खरगोश अस्थि मज्जा स्टेम सेल पीईसी-बीएमपी -2 (लाल) पीईसी-बीएमपी -2 + BMP- के अलावा के साथ incubated के एएलपी गतिविधि पर साथ ऊष्मायन के बाद मनाया गया 2 (हरा) और पीईसी (नीला)। पीईसी-बीएमपी -2 और पीईसी-बीएमपी 2 दिन 7 पर बीएमपी -2 के + अलावा के साथ ऊष्मायन के बाद एएलपी गतिविधि में वृद्धि, एएलपी गतिविधि दिन 9. पर चला जाता है (सी) एएलपी खरगोश अस्थि मज्जा स्टेम सेल की गतिविधि PEC- साथ incubated बीएमपी -2 (लाल) बीएमपी -2 (नीला) और मध्यम (हरा)। परिणाम मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9: पॉलिकैप्रोलैक्टोन त्रिकोणीय कैल्शियम फॉस्फेट (पीसीएल-टीसीपी) पाड़ पीईसी वाहक के साथ पैक (ए) Polycaprola।ctone त्रिकोणीय कैल्शियम फॉस्फेट (पीसीएल-टीसीपी) पाड़ (ताकना आकार 1,300 माइक्रोन) पीईसी वाहक के साथ पैक किया। (बी) पीसीएल-टीसीपी पाड़। (ग) उच्च बढ़ाई: पीईसी पैकिंग के बाद अपने आकार को बनाए रखता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल परत दर परत आत्म विधानसभा के माध्यम से पेक्स की तैयारी के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। परत दर परत संरचना protamine, हेपरिन, बीएमपी -2 और नेल -1 और confocal माइक्रोस्कोपी के फ्लोरोसेंट analogues का उपयोग करते हुए कल्पना की है। तेज और रिलीज परीक्षण बताते हैं कि पीईसी पर हेपरिन मध्यस्थता osteogenic वृद्धि कारक तेज और रिहाई। पीईसी विधि के तेज दक्षता है: नेल-1: 86.7 ± 2.7%, बीएमपी -2: 70.5 ± 3.1%। पीईसी वाहक जैसे कैल्शियम एपेटाइट कणों (40-80%) 11 के रूप में एक शुद्ध सतह सोखना वाहक की तुलना में नेल-1 (20%) रिहाई के लिए एक बेहतर मॉडुलन है।

रिहाई के नियमन इसके अलावा, हेपरिन ऐसे protamine रूप polycations के अत्यधिक सकारात्मक चार्ज अवांछित cytotoxicity संबंधित मुद्दों से बचने के लिए 12 neutralizes। के रूप में MTT परख और Alamar ब्लू परख 7 द्वारा निर्धारित पेक्स, cytotoxicity के कोई लक्षण नहीं दिखा है। एएलपी परख चलता पीईसी वाहक bioact बनाए रख सकते हैंदोनों नेल -1 और बीएमपी -2 के ivity। हालांकि osteogenic वृद्धि कारक स्पाइनल फ्यूजन सर्जरी में बीएमपी -2 उपचार के लिए विकसित की है, पीईसी को भी अन्य विकास कारकों जैसे नेल -1 और PDGF-बी बी के रूप में हेपरिन बाध्यकारी डोमेन के साथ ले सकते हैं। ऐसे polyglycolic एसिड microspheres में वृद्धि कारकों की encapsulation के रूप में अन्य प्रसव के तरीके की तुलना में, पेक्स कार्बनिक सॉल्वैंट्स कि विकास के कारकों 13 को निष्क्रिय करने के लिए करते हैं की आवश्यकता नहीं है।

पीईसी निर्माण प्रक्रिया में कारकों की एक संख्या वाहक प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है। सबसे पहले, microbead आकार सतह क्षेत्र / मात्रा के अनुपात को प्रभावित करता है। उच्चतर osteogenic वृद्धि कारक लोड हो रहा है छोटे microbeads के साथ प्राप्त किया जा सकता है। दूसरे, alginate एकाग्रता microbead संरचना की स्थिरता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। Microbead स्थिरता alginate प्रकार, श्रृंखला लंबाई (गामा विकिरण से प्रभावित) और द्विसंयोजक आयन इस्तेमाल किया (बेरियम> स्ट्रोंटियम> कैल्शियम) पर निर्भर करता है। जबकि 2% alginate समाधान manufactu के लिए पर्याप्त हैस्थिर microbead संरचनाओं के साथ पेक्स फिर, 4% alginate 8 mrad गामा विकिरण के बाद विकिरण के दौरान alginate श्रृंखला छोटा करने के प्रभाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए आवश्यक है। तीसरा, alginate microbeads के vivo गिरावट की दर जोरदार alginate श्रृंखला लंबाई से प्रभावित है। चूहा और सुअर का मॉडल से हमारे अनुभव के आधार पर, पीईसी का उपयोग करते हुए 8 mrad किरणित alginate alginate कोर (अप्रकाशित डेटा) की तेजी (28 दिन) और पूर्ण गिरावट से पता चलता गढ़े। alginate कोर की गिरावट बोनी अंतर्वृद्धि के लिए कमरे में आवश्यक है। चौथे, लगातार झटकों (जैसे, 30 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर बीएमपी -2 और नेल-1 की रात ऊष्मायन तेज दक्षता में सुधार कर सकते हैं। अन्त में, protamine कोटिंग मोटाई समय निर्भर है। चूंकि protamine-हेपरिन बातचीत की हद तक इस तरह के बीएमपी -2 या नेल-1 के रूप में osteogenic वृद्धि कारकों की रिहाई को निर्धारित करता है, protamine ऊष्मायन के 1 घंटा पीईसी संरचना की स्थिरता में सुधार करने के लिए अपनाया है।

इन विवो bioactivity में समय को बढ़ाने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है। हेपरिन शामिल है और मारक के विकल्प के साथ मिलकर की बहुत ही सीमित मात्रा को देखते हुए यानी, protamine, decorticated हड्डी में लंबे समय तक रक्तस्राव समय (हेपरिन के विरोधी कौयगुलांट गतिविधियों को निष्क्रिय करने में एक अत्यंत प्रभावी दवा) बड़े पैमाने पर सैद्धांतिक और व्यावहारिक रूप से अप्रासंगिक है।

पीसीएल-टीसीपी पाड़ में पेक्स लोडिंग इम्प्लांट स्थलों पर मोती के स्थानीयकरण को बढ़ाता है। Scaffolds आवश्यक यांत्रिक समर्थन है कि रीढ़ संलयन के लिए महत्वपूर्ण है प्रदान करते हैं। वर्तमान अध्ययन में, हम उचित पैकिंग (9 चित्रा) की सुविधा के लिए 1300 माइक्रोन pores के साथ पीसीएल-टीसीपी scaffolds इस्तेमाल किया। हालांकि वर्तमान उदाहरण पीसीएल-टीसीपी पाड़ के साथ पीईसी osteogenic वृद्धि कारक वितरण पता चलता है, हमारे समूह में भी एक polyetherketoneketone साथ वाहक प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया है (PEKK) समान प्रभावकारिता के साथ एक खरगोश अध्ययन में हड्डी चैंबर।

इस अध्ययन में, rhBMP-2 और नेल-1 के अन्य पहले से मूल्यांकन वाहकों के साथ तुलना की कमी एक सीमा का प्रतिनिधित्व करेगा।

अंत में, प्रस्तुत की प्रक्रिया ऐसी बीएमपी -2 और नेल-1 के रूप में हेपरिन डोमेन के साथ osteogenic विकास के कारकों की रिहाई को नियंत्रित करने के लिए एक उपयोगी वाहक प्रदान करता है। वर्णित रणनीति कई लाभों को जोड़ती है: यह बीएमपी -2 तक ही सीमित है और इस तरह नेल-1 के रूप में हेपरिन बाध्यकारी डोमेन के साथ अन्य विकास कारकों पर लागू नहीं है। osteogenic वृद्धि कारक पर खुराक में कमी ऐसे seroma, परपोषी हड्डी गठन के रूप में अवांछनीय दुष्प्रभाव को कम करने और उपचार की कुल लागत को कम कर सकते हैं।

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Disclosures

हम ब्याज का कोई विवाद नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane PALL  PN4612 Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration
24 well plate Cell Star  662160
96 well plate Nuclon Delta Surface Thermo Fisher Scientific 167008
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT Sigma Aldrich M5655 Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1
Acetone Fisher Scientific A/0600/17 Precipitate CF-405
Labeled protamine
Alamar Blue Invitrogen, Life Technologies DAL 1025 Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit Anaspec AS-72146
Ammonium Chloride Merck Art 1145 Stop reagent in FITC labeling
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Invitrogen, Life Technologies D12345 Solvent for fluorescent isothiocyanate I
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich Dissolve  formazan 
Autoclave Hirayama HU-110 Sterilize alginate beads by steam
Beta-glycerophosphate Sigma Aldrich G9422
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit)  Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA 7510800 Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA)  Thermo Fisher Scientific A-6222 To quantify NELL-1 protein
Cell Strainer (100 µm) BD Science 352360 Hold PEC for ALP assay
Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm SPL Life Science 90030 Detach the cell from 24 well plate
CF 405S, Succinimidyl Ester Sigma Aldrich SCJ4600013 Blue fluorescent dye for protamine labeling
CF 594, Hydrazide Sigma Aldrich SCJ4600031 Deep red fluorescent dye for heparin labeling
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Confocal Microscope Olympus  FV1000
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Component of osteogenic growth medium
Dextran Desalting Columns Pierce (Thermo Scientific)  43230
DMEM Gibco  12320
BMP-2 Quantikine ELISA Kit R&D System DBP200 Determine BMP-2 release
Fetal Bovine Serum FBS Hyclone SV30160.03
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I Sigma Aldrich F7250 Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling
ThinCert Cell Culture Inserts,
For 24 Well plates, Sterile		 Greiner  662630 Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) Havard Apparatus 70-2208
n-Hexane (>99%) Sigma Aldrich 139386
Heparin Sigma Aldrich H3149 Binds with osteogenic
growth factor with heparin binding domain
Hydrochloric acid (37%) Merck 100317 Highly Corrosive
Incubator Binder C8150
MicroBCA Protein Assay kit Thermoscientific 23235
Microplate Reader Tecan Infinite M200 For ALP and microBCA assays
Nisco cell encapsulator Nisco Engineering Inc Encapsulation unit VAR V1
Fluorescent Microscope Olympus IX71
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) Osteopore PCL-TCP 0/90 Hold PEC for in vivo study
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml Hyclone Cell Culture SV30010 Antibiotic
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) Vivantis PB0344-1L 10x Solution, Ultra Pure Grade
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 Sigma Aldrich P2568 Polycation
Protamine Sulfate salt, from Salmon Sigma Aldrich P4020 Polycation
Shaker Labnet S2025
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet Thermo Fisher Scientific 68035 Remove unreacted FITC by dialysis
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Sodium Hydroxide Qrec S5158
Sodium Bicarbonate US Biological S4000 Buffer
Sodium carbonate Sigma Aldrich S7795-500G Buffer
Strontium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich 255521 Crosslinker for alginate
Spatula 3dia
5 ml syringe Terumo 140425R Diameter of syringe affects the flow rate
75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck Corning 730720
Toluidine Blue Sigma Aldrich 52040 Heparin assay
Trypsin 1x Hyclone Cell Culture SH30042.01
Sodium alginate Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) Pronova UPMVG Core material of microbeads

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 114 Polyelectrolyte परिसर वाहक हेपरिन बाध्यकारी डोमेन protamine हड्डी morphogenic प्रोटीन 2 (बीएमपी -2) प्रोटीन काइनेज सी-बाध्यकारी प्रोटीन (नेल -1)
के लिए हेपरिन बाध्यकारी डोमेन osteogenic विकास फैक्टर प्रसव Polyelectrolyte परिसर
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Wing Moon Lam, R., Abbah, S. A., Ming, W., Naidu, M., Ng, F., Tao, H., Goh Cho Hong, J., Ting, K., Hee Kit, W. Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery. J. Vis. Exp. (114), e54202, doi:10.3791/54202 (2016).

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