Abstract
Under rekonstruktiv ben operationer, är suprafysiologiska mängder av tillväxtfaktorer empiriskt lastas på ställningar för att främja framgångsrika ben fusion. Stora doser av mycket potenta biologiska medel krävs på grund av tillväxtfaktor instabilitet till följd av snabb nedbrytning enzymatisk liksom bärare ineffektivitet i att lokalisera tillräckliga mängder av tillväxtfaktor på implantatställen. Därför strategier som förlänger stabiliteten av tillväxtfaktorer såsom BMP-2 / NELL-1, och kontrollera deras frigivning kan faktiskt sänka sina effektiva dos och därmed minska behovet av större doser under kommande benersättningsmaterial operationer. Detta i sin tur kommer att minska biverkningar och tillväxtfaktorkostnader. Själv monterade PEC har tillverkats för att ge bättre kontroll av BMP-2 / NELL-en leverans via heparinbindning och ytterligare GÖRA MÖJLIGT tillväxtfaktor bioaktivitet genom att öka in vivo-stabilitet. Här visar vi enkelheten PEC tillverkning som stöd i delivery av en mängd olika tillväxtfaktorer under rekonstruktiv ben operationer.
Introduction
Förekomsten av pseudoartros har rapporterats vara så hög som 10 till 45% i degenerativ ryggradsfusions och revisions spinal operationer 1. För att minska graden av pseudartros under ryggraden fusion och andra rekonstruktiv ben operationer, osteogena tillväxtfaktorer såsom BMP-2, Nell-1 1 och blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF) har införts för att främja de novo osteogenes. Bland dessa är BMP-2 ett populärt val för ryggradsfusion 2. Även om styrkan av BMP-2 i att inducera och underlätta ny benbildning har varit väl etablerat 3; kliniskt signifikanta komplikationer såsom heterotopisk benbildning, serom och hematom, inflammatoriskt svar, radikulit, kotkroppen osteolys, och retrograd ejakulation fortsätter att vara angelägna frågor på grund av de suprafysiologiska mängder som används 4,5.
Därför att sänka dosen av BMP-2 är fortfarande en relevant strategi i åtminfrestar att minimera biverkningar. Dessutom är effektiva bärarsystem som krävs för att undertrycka den initiala utbrottet frisättning av BMP-2 observerades i samtida kollagensvamp bärarsystem och ytterligare stärka förlängd och lokal administrering av denna potenta cytokin. Den lager-för-lager självsammansättning av alternerande katjoniska och anjoniska polyelektrolyter kan användas som en avstämbar metod för att bygga upp polyelektrolytkomplex på ytan av byggnadsställnings matriser eller implanterbara material 6. I detta avseende, har heparin (känd för att ha den högsta negativa laddningstätheten för alla biologiska medel) varit känt att avidly binda med en mängd olika tillväxtfaktorer via elektrostatiska och heparinbindande domäner. I själva verket har heparin visats förlänga halveringstiden och därmed potentiera bioaktiviteten av flera tillväxtfaktorer.
Baserat på detta, vår grupp anpassat ett skikt-vid-skikt självsammansättning protokoll för att tillverka en heparin-baserat polyelektrolytkomplex (PEC) som laster och bevarar bioaktiviteten av osteogena tillväxtfaktorer under immobilisering 7,8. Alginat mikrokorn kärna tillverkades genom tvärbindning av α-L-guluronat (G) rester av alginat med tvåvärd katjon kalcium- eller strontiumjoner. Alginat kärnan är en biologiskt nedbrytbar scaffold matris; som efter implantation, är det resorberas i fusions säng ger utrymme för benig inväxt. Poly-L-lysin (PLL) eller protamin användes som katjoniska skiktet till interlace med både byggnadsställningsmatrisen (i detta fall, alginat microbead bäraren kärna) och den negativt laddade heparin; medan de anjoniska heparinskiktet funktioner för att stabilisera och lokalisera laddade tillväxtfaktorer. Den tredubbla lager PEC har visat sig öka tillväxtfaktorlastförmåga på en grismodell 9. Nyligen har PEC bärare visats att framgångsrikt minska den effektiva dosen av BMP-2 med åtminstone 20-faldigt i råtta 10 och svin modeller av ryggradsfusion 8.
ntent "> Här rapporterar vi de metoder för att tillverka PEC för förbättrad tillväxtfaktor leverans i spinal fusion och andra rekonstruktiv ben operationer med hjälp av BMP-2 som en modell osteogen tillväxtfaktor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. alginatlösningen Förberedelse
- Lös 200 mg natriumalginat (icke-bestrålade) eller 400 mg av 8 Mrad bestrålad natriumalginat i 10 ml dubbeldestillerat vatten och skaka i en timme för icke-utstrålade alginat och 15 minuter för bestrålat alginat. Lagra alginatlösningen vid 4 ° C över natten. Filtrera alginatlösningen med en steril 0,2 um sprutfilter innan alginat mikrokornet tillverkning.
2. Alginat mikrokorn Fabrication
- Desinficera elektro pärla generator och sprutpump med 70% etanol och placera dem i en klass II biologiskt säkerhetsskåp (Figur 1).
- Placera ett glas bassäng med en magnetisk omrörarstav inuti pärlan generator.
- Ställa in armen elektroden på pärlan generatorn 9 cm ovanför bassängen.
- Anslut elektrodkabeln av vulsten generator för att den räfflade skruven 2 av armen elektroden, och häll 80 ml SrCl2 lösning ihandfat.
- Belastning 5 ml 0,2 pm filtrerad alginatlösningen i sprutan och gummiröret. Efter anslutning av gummislang till armen elektroden, slå på sprutpumpen vid 5 ml / h under 2 min för att driva ut luften inuti slangen och leverera alginatlösningen till spetsen på munstycket. Stänga sprutpumpen.
- Därefter slår på encapsulator och sedan till sprutpumpen börja mikrokornet generation. Ställa in alginat flödeshastigheten vid 5 ml / h och spänningen vid 5,8 kV på encapsulator. Kasta mikropärlorna som genereras under de första två minuter (eller första 0,5 ml alginat lösning pumpas ut ur sprutan), eftersom dessa mikrokulor tenderar att vara oregelbundet storlek och form.
- Samla in efterföljande mikropärlor i 0,2 M strontiumkloridlösningen. Stäng av både sprutpumpen och encapsulator (i den ordningen) efter att pumpa före planerad volym alginat lösning. Upprepa detta för efterföljande satser av mikrokornet tillverkning. Efter avslutad, slå avf sprutpumpen först, följt av encapsulator.
- Lagra mikropärlorna i 20 ml 0,2 M strontiumklorid lösning vid 4 ° C över natten för att fullborda tvärbindning och stabilisera gelén.
3. Storlek Mätning av alginat mikropärlor
- Samla 0,5 ml alginat mikropärlor med en plastpipett och placera den på en glasskiva. Visa mikropärlorna i ett optiskt mikroskop vid 10X förstoring. Ta tio bilder av mikropärlor med ett mikroskop CCD-kamera. Spara bilderna med skala bar (500 nm) i TIFF-format med upplösning 2048 x 1536.
- Använda längd verktyg i ImageJ, mäta storleken på mikropärlorna och skala bar (Figur 2). Konvertera den mikropärlor längd från pixel till mikrometer.
- Klicka på linjeverktyg och rita en linje tvärs över mitten av alginat pärla.
- Klicka på "Analysera" i menyraden och välj "Åtgärd". Ett popup-fönster visas.
- Konvertera diametern på alginatpärla till den faktiska längd genom användning av formeln: längd alginatpärla / längd skala bar x 500 | j, m. Till exempel, 1,420 (diameter mätt med ImageJ) / 2,657 (skala bar längd mätt med ImageJ) * 500 pm = 267 nm.
- Överväga den genomsnittliga storleken på 100 mikropärlor (medelvärde ± standardavvikelse) som representant storleken på varje sats av mikropärlor.
4. Sterilisering
- Samla in mikropärlorna med hjälp av en 100 ^ m nylon sil och tvätta pärlorna med dubbeldestillerat vatten.
- Användning av en spatel, överföra alla mikropärlorna som framställts av 0,1 ml alginat lösningen i en 2 ml mikrocentrifugrör och täck med gasväv för att förhindra uttorkning.
- Slutligen sterilisera mikropärlorna genom autoklavering med hjälp av flytande läge (115 ° C, 15 min) eller i enlighet med manufacturer specifikationer. Lägg 1,5 L av destillerat vatten till kammaren för att förhindra att pärlor från torkning.
5. Protamin och Heparin Coating
- Inne i BSL-2 huva, inkubera de sterila mikropärlor med en ml av 2 mg / ml protaminlösning (steriliserades med användning av ett 0,2 | im sprutfilter) under 1 timme vid rumstemperatur.
- Efter inkubering av mikropärlor under 1 timme (steg 5,1), samla in 150 | il av protaminlösning för mikro bicinkoninsyra (microBCA) testet (avsnitt 6).
- Tvätta protaminbelagda mikrokulor två gånger med dubbeldestillerat vatten. Centrifugera ner under användning av en bänkcentrifug vid 200 xg under 3 min vid rumstemperatur. Efter centrifugering, aspirera vattnet med hjälp av en spruta.
- Inkubera protamin belagda mikrokulor med 1 ml av 0,5 mg / ml heparinlösning (steriliserades med användning av ett 0,2 | im sprutfilter) under 30 min för att skapa polyelektrolytkomplex (PEC).
- Efter inkubation av protaminbelagda mikrokulor feller 30 min (steg 5,4), samla 400 pl av heparinlösningen för att bestämma heparin innehåll (avsnitt 7).
- Efter inkubation, tvätta bort obundet heparin från de PEC genom tvättning två gånger med dubbeldestillerat vatten.
6. Protamininnehåll
- Utför microBCA test i enlighet med tillverkarens anvisningar. I korthet, tillsätt 150 | il protaminlösning (uppsamlades före och efter inkubation med mikrokulor) i en 96 brunnars platta. Lägg 150 pl microBCA arbetslösning.
- Använda albuminlösning (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 och 200 | j, g / ml) som kalibreringsstandarder.
- Inkubera blandningen under 60 min vid 60 ° C. Mät absorbansen med en spektrofotometer vid 562 nm.
- Använd standardkurvan för att bestämma den protaminkoncentration av varje okänt prov i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Fastställa innehållet i de mikropärlor protamin genom att subtrahera den totala mängden protamin ibeläggningslösning (före inkubation med mikrokulor) från den mängd protamin som finns kvar i beläggningslösningen (efter inkubation med mikrokulor).
7. Heparin Innehåll
- Framställa de 10 ml arbetslösning genom att lösa 4 mg toluidinblått och 20 mg natriumklorid i 0,01 N saltsyra.
- Tillsätt 400 | il av prov (från steg 5,5) och den verksamma lösningen i ett förhållande av 2: 3 och vortexblanda i 30 sek.
- Tillsätt 600 pl av n-hexan (ekvivalent volym till arbetsreagenslösningen) och vortexblanda blandningen för att extrahera toluidinblå heparinkomplex.
- Aspirera 200 | il av den vattenhaltiga fasen med spruta efter fasseparation.
- Mäta mängden icke-extraherade toluidinblått ingår i vattenfasen med hjälp av en spektrofotometer vid 631 nm.
- Förbereda heparinstandardlösningar av 0-20 pg / ml.
- Rita 631 nm avläsning av varje heparinstandard mot heparinkoncentration i mikrogram / ml. Använd standardkurvan för att bestämma den heparinkoncentrationen i varje prov.
8. Confocal Bild av Layer-by-skiktsstruktur
- Fabricera protamin, heparin och NELL-1 / BMP-2 fluorescerande analog CF-405 protamin (blå), CF 594 heparin (röd) och FITC-märkt NELL-1 / FITC-märkt (grön) BMP-2 + heparin + protamin enligt tillverkarens tekniskt datablad.
- Coat 100 ^ g mikropärlor med 300 ul av fluorescerande analog (beläggningsmetod som beskrivs i 5,3-5,6) CF-405 protamin (blå) (2 mg / ml, 1 h inkubation), CF 594 heparin (röd) (0,5 mg / ml, 30 min) och FITC-märkt NELL-1 / FITC-märkt (grön) BMP-2 (1,5 mg / ml, över natten). Tvätta mikropärlorna två gånger med destillerat vatten för att eliminera det obundna fluorescerande protamin, heparin och NELL-1 / BMP-2.
- Observera lager-för-lager struktur (Figur 3) med användning av ett konfokalt mikroskop vid 10X förstoring. 7
9. BMP-2och NELL-1 upptag och Release
- Belastning 13,3 pl av 1,5 mg / ml av BMP-2 eller NELL-en lösningen på 100 | ig av PEC. Inkubera PEC vid 4 ° C under 30 rpm skakning under 10 h.
- Doppa mikropärlorna i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C med konstant skakning (30 rpm).
- Samla 1 ml av supernatanten och ersätta den med en ml PBS efter en, tre, sex, 10 och 14 dagar.
- Utvärdera användningen och släpp effektiviteten av BMP-2 med användning av ELISA-metoden enligt tillverkarens protokoll. Utvärdera användningen och släpp effektivitet NELL-1 med användning av karboxibensoyl kinolin-2-karboxaldehyd (CBQCA) proteinanalysförfarande i enlighet med tillverkarens protokoll.
- Bestäm kumulativ frisättning vid tiden (t):
Kumulativ frisättning vid tiden (t) = Release vid tiden (t) + tidigare utgåvan vid tidpunkten (t-1). - Plotta kumulativ frisättning av BMP-2 och NELL-1 mot tiden.
10. In vitro-Bioaktivitetav NELL-1
Notera: Bioaktiviteten hos NELL-1 frisatt från PEC bedömdes genom mätning av dess förmåga att öka uttrycket av alkaliskt fosfatas (ALP) i kanin-benmärgsstamceller (rBMSC).
- Frö 20.000 rBMSCs per brunn i en 24-brunnars platta och låta dem växa under en dag med 1 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 24 timmar, byt medium med 1 ml av en osteogen medium (DMEM kompletterat med 10% FBS, 2% penicillin streptomycin, 50 mikrogram / ml askorbinsyra, 10 mmol / L beta-glycerofosfat och 10 -8 mol / L dexametason ) under 7 dagar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Placera 300 mikrogram PEC-NELL-1 (från steg 8,2) och PEC i cellodlingsinsatser (TC insats) för att hålla PEC separat från cellerna (detta undviker washout av PEC mikrokulor under osteogena mediumbyte). Placera TC sätter in 24 väl plåt i 14 dagar.
- När alla tre dagar, aspirera 1 ml av osteogena mediet genom att placera en nål utanför TC insatsen och ersätta med 1 ml färskt osteogena medium.
- Efter 7 och 14 dagars inkubering, fastställa ALP-aktivitet med en ALP analyskit i enlighet med kitet tillverkarens protokoll.
- Lyserar celler med analysbuffert innehållande 0,1% TritonX-100 vid 4 ° C under 10 min. Skrapa bort vidhäftade celler med hjälp av en cell skrapa. Inkubera cellsuspensionen vid 4 ° C under omrörning under minst 60 min.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 2500 xg vid 4 ° C under 10 min. Samla in supernatanten för ALP-analysen.
- Tillsätt 50 pl av serieutspädd alkaliskt fosfatas standardlösning 200-0 ng / ml till brunnarna i en platta med 96 brunnar. De slutliga mängderna av alkaliskt fosfatas standard är 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15, och 0 ng / brunn.
- Lägga supernatanten från steg 10.5.2 (50 | j, l / brunn) och späd med utspädnings bUffer.
- Tillsätt 50 pl p-nitrofenylfosfat-substrat (pNPP) lösning i varje brunn. Blanda reagensen genom att försiktigt skaka plattan i 30 sek. Inkubera blandningen i 30 min i mörker. Mät absorbansen vid 405 nm genom plattläsare.
- Beräkna ALP-aktivitet med användning av kalibreringskurvan.
- Bestämma proteinhalten med hjälp av microBCA proteinanalyskitet enligt tillverkarens instruktioner. Normalisera ALP aktivitet genom att dividera ALP-aktivitet av proteininnehåll.
11. Cell Viability
- Inkubera 200 mg PEC-NELL-en med 1 ml DMEM + 10% FBS vid 37 ° C under 24 h för 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analysera.
- Seed 2.000 rBMSCs per brunn (i 100 pl DMEM med 10% FBS) i en 96 brunnars platta och inkubera under 1 dag vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ersätta DMEM + 10% FBS med 100 pl av PEC-NELL-1 / PEC-extrakt och inkuberavid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter en dag eller 3 dagars inkubation, tillsätt 10 pl av 5 mg / ml MTT-lösning och ytterligare inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 4 h i mörker.
- Tillsätt 100 ^ il DMSO-lösning till varje brunn för att lösa upp formazankristaller.
- Bestämma absorbansen vid 570 nm med användning av en mikroplattläsare.
- Beräkna den relativa tillväxttakten:
12. Förpackning i Scaffold och BMP-2 & NELL-1 Loading
- Packa korridorerna i de porer ett bioresorberbart medicinsk kvalitet Polykaprolakton - tri-kalciumfosfat (mPCL-TCP) byggnadsställning med användning av en steriliserad spatel inuti en BSL-2 kammaren.
- Tillsätt 1,5 mg / ml lösning av BMP-2 eller NELL-1 på mPCL-TCP byggnadsställning packad med PEC och inkubera över natten vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår bärare, var protamin valts som ett substitut för poly-L-lysin som har liknande kemiska egenskaper och det är FDA godkänt som ett motgift av heparin. mikroskop resultat optiska visade att de icke-bestrålade mikropärlor var sfäriska till sin form med en diameter på 267 ± 14 ^ m. (0,35 mm munstycke, flödeshastighet av 5 ml / h & 5,8 kV). Majoriteten av de bestrålade mikropärlorna är av droppform. Diametern mäts på den runda delen av de bestrålade mikropärlorna var 212 ± 30 ^ m (0,35 mm munstycke, flödeshastighet av 4 ml / h & 6 kV). (Figur 4).
Konfokala bilder av PEC mikropärlor avslöjar skikt-för-skikt beläggning av CF-405 märkt protamin (blå), CF594-märkt heparin (röd) och FITC-BMP-2 / FITC-NELL-1 (grön). Resultaten indikerar att de PEC kan binda med positivt laddade BMP-2 och laddade NELL-1 negativt via heparin Binding domän (Figur 5). Detta tyder på att interaktionen mellan PEC och osteogena tillväxtfaktorer inte ut beroende.
För att bevisa att de PEC kan upptag och frigöra BMP-2, använde vi en ELISA-analys för att bestämma mängden av BMP-2 som kvarstår efter inkubering och mängden BMP-2 i PBS på dag 1, 3, 6, 10 och 14 . Men en liknande metod inte fungerar bra med NELL-1-proteinet, eftersom heparin blockerar antikroppsbindningsställe, vilket avsevärt minskar signalen. Därför var proteinanalysen CBQCA användes för att bestämma skillnaden mellan PEC-NELL-1 och PEC. Från släpp kurvan kumulativa, PEC visar inte bara en högre NELL-1 upptag verkningsgrad jämfört med BMP-2, men också släppa det mycket långsammare än BMP-2 (NELL-1: 20% vs. BMP-2: 25%) (Figur 6). Detta tyder på att PEC binder tätare med NELL-1 än BMP-2.
FrOm MTT-analysen, PEC-NELL-1 är inte cytotoxisk (Figur 7). Resultatet matchar med den Alamar Blue-analys resulterar i en tidigare studie 7. Heparin neutraliserar den positiva laddningen av protamin som spelar en viktig roll för att upprätthålla biokompatibilitet PEC.
För att bestämma huruvida NELL-1-frisättning från PEC påverkar långsiktig osteogen differentiering, uttrycksnivån för ett osteogent markör, alkaliskt fosfatas (ALP), undersöktes genom en kolorimetrisk analys. NELL-1-frisättning från PEC ökar ALP-aktivitet av kanin benmärgsstamceller med 2,2-faldigt vid dag 14 jämfört med kontrollgruppen PEC (Figur 8). BMP-2 visar maximal ökning av ALP-aktiviteten (3,75 gånger) på dag 7. Båda PEC-BMP-2 och PEC-BMP-2 + extra BMP-2 visar minskad aktivitet på dag nio.
ALP-aktivitet med BMP-2 i mediet utan PEC visas i
Figur 1: Elektro pärla generator och sprutpump inrättades BSL-2 biosäkerhet skåp (A) munstycke fäst på munstyckshållaren.. (B) Stora bassängen för strontiumkloridlösningen. (C) Elektrod kabel. (D) Slang levererar alginat lösning. (E) Dyshållare och arm. (F) Elektroder försörjnings than potentialskillnad att reglera pärla storlek. (G) Magnetomrörare. (H) 5 ml spruta. (I) Sprutpump att reglera alginat flöde. (J) Omrörare reglaget för att styra omrörningshastigheten. (K) Spänningsreglaget för att reglera potentialskillnad mellan 0-10 kV. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mätning av alginat mikropärlor med ImageJ programvara Efter att ha öppnat bildfilen genom att välja Arkiv → Öppna, följ Steg 1:. Klicka på linjeverktyget och dra en linje på alginat mikropärlor. I steg två klickar Analysera på menyraden och en pop-up-fönster visas. Upprepa steg 1 och steg 2 tills alla mikrokulor är meauppmätts. I steg tre, klicka på linjeverktyget, rita en linje tvärs över skal och mäta längden på skalfältet. Konvertera mikrokulor längd im med formel:. Längd av alginat / längd Skala bar x 500 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Schematisk återgivning av polyelektrolytkomplex Alginat kärna (mörkgrön) positiv laddning protaminskiktet (blekt grön), negativ laddning heparinskikt (röd), osteogen tillväxtfaktor, t.ex. BMP-2 / NELL-1 på yttersta skiktet (blek blå). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Ljusa fält bilder av alginat mikropärlor (A) icke-bestrålade. (B) 8M Rad bestrålas. Icke-bestrålade alginat mikrokulor är sfärisk och 8M Rad bestrålade motsvarighet är droppformad. Förstoring 100X. (Skala bar = 500 nm.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Konfokal laserscanningsmikroskopi bilder av alginat mikropärlor som inkuberats med fluorescerande analoger av protamin, heparin, NELL-1 och BMP-2 (A) CF 405 Protamin (blå), (B) CF 594 Heparin (röd), (C ) FITC NELL-1 (grön), och (D Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Upptag och frisättning av BMP-2 och NELL-1 (A) Upptag av NELL-1-proteinet (svart) BMP-2 (röd), (B) frisättning kurvan för BMP-2 (röd) och NELL- Kumulativ 1 (svart) från PEC bärare. Resultaten presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
<br /> Figur 7:. cytotoxicitetsanalys (A) MTT-analys av kanin benmärg stjälkar cell med protamin baserad PEC NELL-1 200 mg / ml extrakt (svart), PEC-NELL-1 100 mg / ml extrakt (vit) vid dag 1 och 3. (B) Alamar Blue-analys av kanin benmärg stjälkar cell med PEC BMP-2 (blå), PEC (grön) Experiment utfördes i tre exemplar och resultaten presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Bioaktivitet analys för BMP-2 och NELL-1-frisättning från PEC bäraren (A) ALP-aktivitet av kanin benmärgsstamcell inkuberades med PEC-NELL-1 (svart), PEC (röd).. ALP-aktivitet mättes som absorbans vid 405 nm. 2,2faldig ökning i ALP-aktivitet observerades efter inkubering med PEC-NELL-en vid dag 14. (B) ALP-aktivitet av kanin benmärgsstamcell inkuberades med PEC-BMP-2 (röd) PEC-BMP-2 + tillsats av BMP- 2 (grön) och PEC (blå). Ökning av ALP aktivitet efter inkubation med PEC-BMP-2 och PEC-BMP-2 + tillsats av BMP-2 på dag 7, ALP aktivitet droppar på dag 9. (C) ALP aktivitet kanin benmärgsstamcell inkuberas med PEC- BMP-2 (röd) BMP-2 (blå) och medium (grön). Resultaten presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Polykaprolakton Tri-kalciumfosfat (PCL-TCP) scaffold packad med PEC bärare (A) Polycaprola.ctone Tri-kalciumfosfat (PCL-TCP) byggnadsställning (porstorlek 1300 pm) packad med PEC bärare. (B) PCL-TCP byggnadsställning. (C) Hög förstoring: PEC behåller sin form efter packning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenterar en metod för framställning av PEC genom skikt-vid-skikt självmontering. Den lager-för-lager struktur visualiseras med användning av fluorescerande analoger av protamin, heparin, BMP-2 och NELL-1 och konfokalmikroskopi. Upptag och släppa tester visar att heparin på PEC förmedlar osteogen tillväxtfaktor upptag och utsläpp. Upptagnings effektivitet PEC-metoden är: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. PEC bäraren har en bättre modulering av NELL-1 (20%) frisättning jämfört med en ren ytadsorption bärare såsom kalcium apatit partiklar (40-80%) 11.
Förutom att modulera frisättning, heparin neutraliserar alltför positiv laddning av polykatjoner såsom protamin att undvika oönskad cytotoxicitet frågor 12. De PEC inte visar några tecken på cytotoxicitet, som bestäms av MTT-analysen och Alamar Blue-analys 7. ALP-analysen visar PEC bäraren kan upprätthålla Bioactivity av både NELL-1 och BMP-2. Även utvecklad för osteogen tillväxtfaktor BMP-2 terapi i ryggradsfusions operationer kan PEC också ta upp andra tillväxtfaktorer med heparinbindande domäner såsom NELL-1 och PDGF-BB. Jämfört med andra tillförselmetoder, såsom inkapsling av tillväxtfaktorer i polyglykolsyra mikrosfärerna, behöver PEC inte kräva organiska lösningsmedel som tenderar att inaktivera tillväxtfaktorerna 13.
Ett antal faktorer i PEC tillverkningsproceduren kan påverka bärare prestanda. För det första påverkar mikropärlor storlek yta / volymförhållande. Högre osteogen tillväxtfaktor lastning kan uppnås med mindre mikropärlor. För det andra bör alginat koncentrationen vara tillräcklig för att upprätthålla stabiliteten hos mikrokornet strukturen. Mikrokornet stabilitet beror på alginat typ, kedjelängd (påverkas av gammastrålning) och divalenta jon används (barium> strontium> kalcium). Medan 2% alginat lösning är tillräcklig för att fabrikationsfelre PEC med stabila mikrokorn strukturer, är 4% alginat krävs efter 8 Mrad gammastrålning för att kompensera för effekterna av alginat kedja förkortning under bestrålning. För det tredje, är graden av nedbrytning in vivo av alginat mikrokorn starkt influerad av alginat kedjelängd. Baserat på vår erfarenhet från råtta och svin modeller, PEC tillverkas med användning av 8 Mrad bestrålad alginat visar snabb (28 dagar) och fullständig nedbrytning av alginat kärnan (opublicerade data). Nedbrytning av alginat kärnan erbjuder rums väsentlig för benig inväxt. För det fjärde kan den inkubering över natten av BMP-2 och NELL-1 vid 4 ° C med konstant skakning (t.ex., 30 rpm) förbättra upptag effektivitet. Slutligen är tidsberoende protaminskikttjocklek. Eftersom omfattningen av protamin-heparin interaktion bestämmer frisättningen av osteogena tillväxtfaktorer såsom BMP-2 eller NELL-1, är en timme av protamin inkubation antagits för att förbättra stabiliteten hos PEC strukturen.
in vivo bioaktivitet. Med tanke på den mycket begränsade mängden heparin inblandade och i kombination med valet av motgift, dvs är protamin (ett mycket effektivt läkemedel neutralisera de antikoagulerande aktiviteter heparin), förlängda blödningstiden i skalade ben i hög grad teoretisk och praktiskt oviktiga.
Laddar korridorerna i PCL-TCP byggnadsställning ökar lokalisering av pärlor på implantatställen. Ställningar ge nödvändig mekaniskt stöd som är avgörande för ryggrad fusion. I föreliggande studier använde vi PCL-TCP ställningar med 1300 um porer för att underlätta ordentlig packning (Figur 9). Även om den nuvarande bilden visar PEC osteogen tillväxtfaktor leverans med PCL-TCP byggnadsställning, har vår grupp utvärderades också bärare prestanda med en polyetherketoneketone (PEKK) Ben kammare i en kanin studie med liknande effekt.
I denna studie, kunde bristen på jämförelse med andra tidigare utvärderade bärare av rhBMP-2 och NELL-1 representerar en begränsning.
Sammanfattningsvis ger den presenterade proceduren en användbar bärare för att kontrollera frisättning av osteogena tillväxtfaktorer med heparin områden som BMP-2 och NELL-1. Den beskrivna strategin kombinerar många fördelar: det är inte begränsad till BMP-2 och som gäller för andra tillväxtfaktorer med heparinbindande domäner såsom NELL-1. Dosreduktion på osteogen tillväxtfaktor kan minska oönskade biverkningar såsom seroma, heterotrofa benbildning och sänka den totala kostnaden för behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen intressekonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
