Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

Abstract

Während der rekonstruktiven Knochenoperationen werden supraphysiologischen Mengen von Wachstumsfaktoren empirisch auf Gerüsten geladen erfolgreiche Knochenfusion zu fördern. Große Dosen von hochpotenten biologischen Agenzien werden als Ergebnis der raschen enzymatischen Abbau durch Wachstumsfaktor-Instabilität erforderlich sowie Träger Ineffizienzen in ausreichenden Mengen des Wachstumsfaktors an Implantatstellen zu lokalisieren. Daher Strategien, die die Stabilität von Wachstumsfaktoren wie BMP-2 / NELL-1 und steuern ihre Freilassung zu verlängern könnte tatsächlich ihre wirksame Dosis zu senken und damit die Notwendigkeit für größere Dosen bei zukünftigen Knochenregeneration Operationen reduzieren. Dies wiederum wird Nebenwirkungen und Wachstumsfaktor-Kosten zu reduzieren. Selbstorganisierende PECs wurden hergestellt , eine bessere Kontrolle der BMP-2 / NELL-1 Lieferung über Heparinbindung bereitzustellen , und weiter potenzieren Wachstumsfaktor - Bioaktivität durch Verbesserung in vivo Stabilität. Hier zeigen wir die Einfachheit der PEC Fertigung, die in der delive hilftry einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren während der rekonstruktiven Knochen Operationen.

Introduction

Die Inzidenz von Pseudoarthrosen wurde berichtet , so hoch wie 10 bis 45% in degenerative Spondylodese und Revisionswirbelsäulenchirurgie ¹ sein. Um die Rate der Pseudoarthrose während Wirbelsäulenfusion und andere rekonstruktive Knochenoperationen, osteogenen Wachstumsfaktoren wie BMP-2, Nell-1 ¹ und von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) reduzieren wurden eingeführt , um de novo Osteogenese fördern. Unter diesen ist BMP-2 eine beliebte Wahl für Spondylodese ^2. Obwohl die Wirksamkeit von BMP-2 bei der Induktion und neue Knochenbildung zu erleichtern wurde gut etabliert ^3; klinisch signifikanten Komplikationen wie heterotope Knochenbildung, seroma und Hämatome, Entzündungsreaktion, Radikulitis, Wirbelkörper Osteolyse und rückläufige Ejakulation weiterhin aufgrund der supraphysiologischen Mengen ^4,5 Anliegen zu sein.

Daher bleibt die Dosis von BMP-2 Absenken einer entsprechenden Strategie in zuminverleitet Nebenwirkungen zu minimieren. Außerdem sind effiziente Trägersysteme erforderlich, um den ersten Ausbruch Freisetzung von BMP-2 beobachtet in der zeitgenössischen Kollagenschwamm Trägersysteme und weiter zu verbessern verlängerte und lokalisierte Abgabe dieses potenten Zytokin zu unterdrücken. Die Schicht- für -Schicht - Selbstorganisation von kationischen und anionischen Polyelektrolyten alternierende kann als abstimmbarer Verfahren eingesetzt werden ⁶ Polyelektrolytkomplexe zum Aufbau auf der Oberfläche des Gerüsts Matrices oder implantierbare Materialien. In dieser Hinsicht, Heparin (bekannt für die höchste negative Ladungsdichte aller biologischen Agenzien haben) erkannt wurde, mit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren über elektrostatische und Heparin-Bindungsdomänen avidly zu binden. Tatsächlich wurde Heparin gezeigt, um die Halbwertszeit zu verlängern und damit die Bioaktivität von verschiedenen Wachstumsfaktoren zu potenzieren.

Auf dieser Basis angepasst unserer Gruppe eine Schicht-für-Schicht self-assembly-Protokoll ein auf Heparin-Basis Polyelektrolytkomplex (PEC) herzustellen, die Lasten und bewahrt die Bioaktivitäten von osteogenen Wachstumsfaktoren während der Immobilisierung ^7,8. Die Alginat-Mikrokügelchens Kern wurde durch vernetzende α-L-Guluronat (G) -Resten von Alginat mit zweiwertiges Kation Calcium- oder Strontiumionen hergestellt. Die Alginat-Kern ist ein biologisch abbaubares Gerüst Matrix; die nach der Implantation wird in dem Fusionsbett bietet Raum für das Einwachsen des Knochens resorbiert. Poly-L-Lysin (PLL) oder Protamin als kationische Schicht verwendet mit Interlace sowohl die Gerüstmatrix (in diesem Fall das Alginat Mikrokügelchens Trägerkern) und dem negativ geladenen Heparin; während die anionische Funktionen Heparin Schicht zu stabilisieren und belastet Wachstumsfaktoren zu lokalisieren. Die dreilagige PEC wurde in einem Schweinemodell ⁹ gezeigt Wachstumsfaktor Belastbarkeit zu erhöhen. Vor kurzem haben PEC Träger wurden in Ratten ¹⁰ und Schweinemodellen Spondylodese ⁸ gezeigt , um erfolgreich die wirksame Dosis von BMP-2 um mindestens das 20-fache zu verringern.

ntent "> Hier berichten wir über die Verfahren zur Herstellung von PEC für verbesserte Wachstumsfaktor Lieferung in Spondylodese und den anderen rekonstruktiven Knochenoperationen unter Verwendung von BMP-2 als osteogenen Wachstumsfaktor-Modell.

Protocol

1. Alginatlösung Vorbereitung

1. Man löst 200 mg Natriumalginat (nicht bestrahlten) oder 400 mg 8 MRad bestrahlt Natriumalginat in 10 ml doppelt destilliertem Wasser und Schütteln für 1 Stunde für nicht abgestrahlte Alginat und 15 min für bestrahlte Alginat. Lagern Sie die Alginat-Lösung bei 4 ° C über Nacht. Filtern Sie die Alginat-Lösung mit einem sterilen 0,2 um Spritzenfilter vor Alginat Mikrobead Fertigung.

2. Alginate Microbead Fabrication

1. Desinfizieren Sie die elektrostatische Wulst Generator und Spritzenpumpe mit 70% Ethanol und legen Sie sie in der Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank (Abbildung 1).
2. Ein Glastisch mit einem magnetischen Rührstab im Inneren des Wulst-Generator.
3. Stellen Sie den Arm-Elektrode des Wulst-Generator 9 cm über dem Becken.
4. Schließen Sie das Elektrodenkabel des Wulstes Generators an die Rändelschraube 2 des Arm - Elektrode und schütten 80 ml ​​SrCl ₂ -Lösung in dieBecken.
5. Last 5 ml von 0,2 um filtriert Alginat-Lösung in die Spritze und Gummischlauch. Nach dem Verbinden der Gummischlauch auf den Arm Elektrode, einschalten der Spritzenpumpe bei 5 ml / h für 2 min die Luft innerhalb des Schlauchs zu vertreiben und die Alginatlösung in die Spitze der Düse zu liefern. Drehen Sie die Spritzenpumpe ab.
6. Als nächstes schalten Sie den encapsulator und dann auf die Spritzenpumpe Mikrobead Generation beginnen. Stellen Sie die Alginat-Strömungsgeschwindigkeit bei 5 ml / h und die Spannung bei 5,8 kV an der encapsulator. Verwerfen, die während der ersten zwei Minuten erzeugt Mikrokügelchen (oder die anfängliche 0,5 ml Alginatlösung aus der Spritze gepumpt), da diese Mikrokügelchen neigen unregelmäßig dimensioniert und geformt sein.
7. Sammeln nachfolgende Mikrobeads in 0,2 M Strontiumchloridlösung. Schalten Sie sowohl die Spritzenpumpe und die encapsulator (in dieser Reihenfolge) nach der im voraus geplanten Volumen von Alginat-Lösung zu pumpen. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Chargen von Mikrobead Fertigung. Nach Abschluss der Wendef der Spritzenpumpe zunächst durch die encapsulator gefolgt.
8. Speichern der Mikrokugeln in 20 ml 0,2 M Strontiumchloridlösung bei 4 ° C über Nacht Vernetzung zu vervollständigen und um das Gel zu stabilisieren.

3. Größe Messung der Alginate Microbeads

1. Sammeln Sie 0,5 ml Alginat-Mikrokügelchen mit einer Plastikpipette und legen Sie es auf einem Glasträger. Sehen Sie sich die Mikrokügelchen unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Nehmen zehn Bilder der Mikrokügelchen mit einem Mikroskop-CCD-Kamera. Speichern Sie die Bilder mit Skala bar (500 & mgr; m) im TIFF-Format bei einer Auflösung von 2.048 x 1.536.
2. Unter Verwendung der Länge Werkzeuge in ImageJ, messen Sie die Größe der Mikrokügelchen und Maßstabsleiste (Abbildung 2). Konvertieren Sie die Mikrokügelchen Länge von Pixel zu Mikrometer.
   1. Klicken Sie auf die Zeilentools und eine Linie in der Mitte des Alginatkugel ziehen.
   2. Klicken Sie auf "Analysieren" auf der Menüleiste und wählen Sie "Messen". Ein Pop-up-Fenster erscheint.
   3. Konvertieren den Durchmesser des Alginatkugel der tatsächlichen Länge unter Verwendung der Formel: Länge der Alginatkugel / Länge von Maßstabsleiste x 500 um. Zum Beispiel, 1,420 (Durchmesser gemessen von ImageJ) / 2,657 (Maßstab Länge von ImageJ gemessen) * 500 & mgr; m = 267 & mgr; m.
3. Betrachten Sie die durchschnittliche Größe von 100 Mikrokugeln (Mittelwert ± Standardabweichung) als Vertreter Größe jeder Charge von Mikrokügelchen.

4. Sterilisation

1. Sammeln Sie die Mikrokügelchen eine 100 & mgr; m Nylon-Sieb verwenden und die Perlen mit doppelt destilliertem Wasser waschen.
2. Mit einem Spatel, übertragen alle aus Mikrokügelchen von 0,1 ml Alginatlösung in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit Gaze Austrocknen zu verhindern.
3. Schließlich sterilisieren die Mikrokügelchen durch Flüssigmodus Autoklavenbehandlung unter Verwendung von (115 ° C, 15 min) oder in Übereinstimmung mit mersteller Angaben. Hinzufügen 1,5 L destilliertem Wasser in die Kammer aus Trockenperlen zu verhindern.

5. Protamin und Heparin-Beschichtung

1. Im Inneren der BSL-2 hood inkubieren die sterile Mikrokügelchen mit 1 ml von 2 mg / ml Protamin Lösung (sterilisiert, um eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter) für 1 h bei Raumtemperatur.
2. Nach Inkubation der Mikrokugeln für 1 Stunde (Schritt 5.1), sammeln 150 ul der Protaminlösung für die Mikro Bicinchoninsäure (microBCA) Test (Abschnitt 6).
3. Waschen Sie die Protamin beschichteten Mikrokügelchen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Spin down mit einer Tischzentrifuge bei 200 × g für 3 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation absaugen Wasser unter Verwendung einer Spritze.
4. Inkubieren Protamin beschichteten Mikrobeads mit 1 ml von 0,5 mg / ml Heparinlösung (sterilisiert, um eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter) für 30 min Polyelektrolytkomplex (PEC) zu erstellen.
5. Nach dem Protamin beschichteten Mikrokügelchen f Inkubationoder 30 min (Schritt 5.4), sammeln 400 ul der Heparin-Lösung Heparingehalt (Abschnitt 7) zu bestimmen.
6. Nach der Inkubation waschen das ungebundene Heparin aus den BBW durch zweimaliges Waschen mit doppelt destilliertem Wasser ab.

6. Protamin Inhalt

1. Führen Sie die microBCA Prüfung nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, mit 150 & mgr; l Protaminlösung (vor und nach der Inkubation mit Mikrokugeln gesammelt) in eine 96-Well-Platte. In 150 ul microBCA Arbeitslösung.
2. Verwenden Albuminlösung (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 und 200 ug / ml) als Kalibrierungsstandards.
3. Inkubieren der Mischung für 60 min bei 60 ° C. Messen der Extinktion mit einem Spektrophotometer bei 562 nm.
4. Verwenden der Standardkurve, die Protamin-Konzentration von jeder unbekannten Probe zu bestimmen, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Bestimmen die Protamin-Gehalt der Mikrokügelchen durch die Gesamtmenge von Protamin in der SubtrahierenBeschichtungslösung (vor der Inkubation mit Microbeads) aus der Menge an Protamin in der Beschichtungslösung verbleibende (nach Inkubation mit Microbeads).

7. Heparin Inhalt

1. Bereiten Sie die 10 ml der Arbeitslösung durch Auflösen von 4 mg Toluidinblau und 20 mg Natriumchlorid in 0,01 N Salzsäure.
2. Werden 400 ul Probe (aus Schritt 5.5) in die Arbeitslösung in einem Verhältnis von 2: 3 und Vortex für 30 sec.
3. Hinzufügen, 600 & mgr; l n-Hexan (äquivalentes Volumen an die Arbeits Reagenslösung) und die Mischung vortexen die Toluidinblau Heparinkomplex zu extrahieren.
4. Aspirat 200 & mgr; l der wässrigen Phase durch eine Spritze nach der Phasentrennung.
5. Messen der Menge an nicht-extrahierten Toluidinblau in der wässrigen Phase enthielt ein Spektrophotometer bei 631 nm verwendet wird.
6. Bereiten Sie Heparin Standardlösungen von 0-20 & mgr; g / ml.
7. Zeichnen Sie die 631 nm Lesen jedes Heparin-Standard gegen Heparinkonzentration in g / ml. Verwenden, um die Standardkurve der Heparinkonzentration jeder Probe zu bestimmen.

8. Die konfokale Bild von Schicht-für-Schicht-Struktur

1. Fabrizieren Protamin, Heparin und Nell-1 / BMP-2 Fluoreszenz analog CF-405 Protamin (blau), CF 594 Heparin (rot) und FITC markiertem NELL-1 / FITC markiert (grün) BMP-2 + Heparin + Protamin nach Hersteller technisches Datenblatt.
2. Coat 100 & mgr; g Mikrokügelchen mit 300 ul Fluoreszenz analog (Beschichtungsverfahren wie in 5,3-5,6 beschrieben) CF-405 Protamin (blau) (2 mg / ml, 1 h Inkubation), CF 594 Heparin (rot) (0,5 mg / ml, 30 min) und FITC markiert NELL-1 / FITC markiert (grün) BMP-2 (1,5 mg / ml, über Nacht). Waschen der Mikrokügelchen zweimal mit destilliertem Wasser, um die ungebundenen Fluoreszenz Protamin, Heparin und Nell-1 / BMP-2 zu beseitigen.
3. Beachten Sie die Schicht- für -Schicht - Struktur (Abbildung 3) durch ein konfokales Mikroskop mit 10 - facher Vergrößerung verwendet wird . ⁷

9. BMP-2und Nell-1 Aufnahme und -abgabe

1. Last 13,3 & mgr; l von 1,5 mg / ml BMP-2 oder NELL-1-Lösung auf 100 & mgr; g PEC. Inkubieren PEC bei 4 ° C unter 30 Umdrehungen pro Minute für 10 Stunden Schütteln.
2. Tauchen Sie die Mikrokügelchen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C unter konstantem Schütteln (30 rpm).
3. Sammeln Sie 1 ml des Überstandes und ersetzen Sie es mit 1 ml PBS nach 1, 3, 6, 10 und 14 Tage.
4. Bewerten die Aufnahme und Abgabe Effizienz der BMP-2, um die ELISA-Methode unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. Bewerten die Aufnahme und Abgabe Effizienz NELL-1 die carboxybenzoyl Chinolin-2-carboxaldehyd (CBQCA) Protein-Assay-Verfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers.
5. Bestimmen Sie kumulative Freisetzung zur Zeit (t):
   Kumulative Freisetzung zum Zeitpunkt (t) = Freigabe zum Zeitpunkt (t) + vorherige Freigabe zum Zeitpunkt (t-1).
6. Plot kumulative Freisetzung von BMP-2 und Nell-1 gegen die Zeit.

10. In - vitro - Bioaktivitätvon Nell-1

Anmerkung: Die Bioaktivität Nell-1 von PEC veröffentlicht wurde durch Messen seiner Fähigkeit bewertet, die Expression von alkalischer Phosphatase (ALP) in Kaninchen-Knochenmark-Stammzellen (rBMSC) zu erhöhen.

1. Seed 20.000 rBMSCs pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen und erlauben ihnen ₂ einen Tag lang mit 1 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C und 5% CO zu wachsen.
2. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit 1 ml eines osteogenen Medium (DMEM mit 10% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 10 mmol / L beta-Glycerophosphat und 10 ^-8 mol / L Dexamethason for) 7 Tage bei 37 ° C und 5% CO _2.
3. Legen 300 & mgr; g PEC-Nell-1 (aus Schritt 8.2) und PEC Inneren Zellkultur-Einsätze (TC Insert), um die PEC halten getrennt von den Zellen (dies vermeidet die Auswaschung von PEC-Mikrokügelchen während der osteogenen Mediumwechsel). Platz TC führen, in den 24-Well-plaß für 14 Tage.
4. Sobald alle drei Tage, aspirieren 1 ml des osteogenen Medium durch eine Nadel außerhalb des TC Einsatz platzieren und ersetzen mit 1 ml frischem osteogenen Medium.
5. Nach 7 und 14 Tagen Inkubation bestimmen ALP-Aktivität mit einem ALP-Testkit in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Kit-Herstellers.
   1. Lysieren Zellen mit Assay-Puffer, enthaltend 0,1% Triton X-100 bei 4 ° C für 10 min. Scrape anhaftenden Zellen mit einem Zellschaber aus. Inkubieren bei 4 ° C unter Rühren Zellsuspension für 60 min zumindest.
   2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 2.500 × g bei 4 ° C für 10 min. Sammeln Sie den Überstand für die ALP-Test.
   3. Zugabe von 50 & mgr; l seriell verdünnte alkalische Phosphatase-Standardlösung 200-0 ng / ml zu den Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Die endgültigen Mengen an alkalischer Phosphatase-Standard sind 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 und 0 ng / Vertiefung.
   4. Fügen Sie den Überstand von Schritt 10.5.2 (50 & mgr; l / Vertiefung) und verdünnt mit Verdünnung bUffer.
   5. In 50 ul p - Nitrophenylphosphat (pNPP) Substratlösung in jede Vertiefung. Mischen Sie die Reagenzien durch leichtes Schütteln der Platte für 30 Sekunden. Inkubieren der Mischung für 30 min im Dunkeln. Messen Sie die Absorption bei 405 nm von Plattenleser.
   6. Berechnen ALP-Aktivität der Kalibrierungskurve.
6. Bestimmen Proteingehalt des microBCA Protein-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Normalisieren der ALP-Aktivität durch Dividieren ALP-Aktivität von Eiweißgehalt.

11. Zelllebensfähigkeit

1. Inkubieren 200 mg der PEC-NELL-1 mit 1 ml DMEM + 10% FBS bei 37 ° C für 24 Stunden für den 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Test.
2. Seed 2,000 rBMSCs pro Vertiefung (in 100 & mgr; l DMEM mit 10% FBS) in eine 96 - Well - Platte und Inkubation für 1 Tag bei 37 ° C, 5% CO _2.
3. Ersetzen DMEM + 10% FBS mit 100 ul PEC-Nell-1 / PEC-Extrakt und Inkubationbei 37 ° C, 5% CO _2.
4. Nach 1 Tag oder 3 Tagen Inkubation wurden 10 ul von 5 mg / ml MTT - Lösung hinzufügen und weiter bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 4 Stunden im Dunkeln inkubieren.
5. Füge 100 & mgr; l DMSO-Lösung zu jeder Vertiefung Formazankristalle zu lösen.
6. Bestimmen Sie die Absorption bei 570 nm im Mikrotiterplatten-Reader.
7. Berechnen Sie die relative Wachstumsrate:
   

12. Verpackung in Scaffold und BMP-2 & Nell-1 Loading

1. Packen die PECs in die Poren eines bioresorbierbaren medizinischen Grades Polycaprolacton - Tricalciumphosphat (MPCL-TCP) Gerüst eines sterilisierten Spatel in einem BSL-2-Kammer verwendet wird.
2. In 1,5 mg / ml Lösung von BMP-2 oder NELL-1 auf den MPCL-TCP Gerüst mit PEC gepackt und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.

Representative Results

In unserem Träger wurde als Ersatz von Poly-L-Lysin-Protamin gewählt, da sie ähnliche chemische Eigenschaften hat, und es ist von der FDA als Antidot von Heparin zugelassen. Lichtmikroskop zeigte sich, dass die nicht bestrahlten Mikrobeads mit einem Durchmesser von 267 ± 14 & mgr; m in Form sphärisch waren. (0,35 mm Düse, Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / h und 5,8 kV). Die Mehrzahl der bestrahlten Mikrokugeln sind von Tropfenform. Der Durchmesser auf der runden Abschnitt der bestrahlten Microbeads gemessen betrug 212 ± 30 & mgr; m (0,35 mm-Düse, Rate von 4 ml strömen / h und 6 kV). (Abbildung 4).

Die konfokale Bilder der PEC Microbeads offenbaren Schicht-für-Schicht-Beschichtung von CF-405 markierten Protamin (blau), CF594-markiertem Heparin (rot) und FITC-BMP-2 / FITC-Nell-1 (grün). Die Ergebnisse zeigen, dass die PEC mit positiv binden kann BMP-2 geladenen und negativ geladenen NELL-1 über die Heparin Binding Domain (Abbildung 5). Dies legt nahe, dass die Wechselwirkung zwischen den PECs und den osteogenen Wachstumsfaktoren abhängt berechnen.

Um zu beweisen, dass die PECs können Aufnahme und Freisetzung von BMP-2, haben wir einen ELISA-Assay der Menge an BMP-2, die nach der Inkubation und die Menge von BMP-2 in PBS am Tag 1, 3, 6, 10 und 14 zu bestimmen, . Allerdings ist ein ähnlicher Ansatz funktioniert nicht gut mit dem Nell-1-Protein, da blockiert die Antikörper-Bindungsstelle Heparin deutlich das Signal zu reduzieren. Daher wurde die CBQCA Protein-Assay verwendet, um die Differenz zwischen PEC-NELL-1 und PEC zu bestimmen. Aus der kumulativen Freisetzungskurve zeigen BBW nicht nur eine höhere NELL-1 Aufnahmeeffizienz im Vergleich zu BMP-2 , sondern auch loslassen viel langsamer als BMP-2 (NELL-1: 20% vs. BMP-2: 25%) (Abbildung 6). Dies deutet darauf hin, dass PEC fester binden mit Nell-1 als BMP-2.

From der MTT - Test, PEC-Nell-1 ist nicht zytotoxisch (Abbildung 7). Das Ergebnis entspricht dem Alamar - Blue - Assay - Ergebnis in einer früheren Studie ^7. Heparin neutralisiert die positive Ladung von Protamin, die bei der Aufrechterhaltung der Biokompatibilität von PEC eine wichtige Rolle spielt.

Um festzustellen, ob Nell-1-Freisetzung aus PEC langfristigen osteogene Differenzierung beeinflusst, das Expressionsniveau eines osteogenen Marker, alkalische Phosphatase (ALP), wurde durch einen kolorimetrischen Test untersucht. NELL-1 - Freisetzung aus PEC erhöht die ALP - Aktivität von Kaninchen Knochenmarkstammzellen um 2,2 - fach am Tag 14 im Vergleich zu der PEC Kontrollgruppe (Abbildung 8). BMP-2 zeigt maximale Erhöhung der ALP-Aktivität (3,75-fach) am 7. Tag Sowohl PEC-BMP-2 und PEC-BMP-2 + extra BMP-2 zeigen Abnahme der Aktivität am Tag 9.

ALP-Aktivität mit BMP-2 in dem Medium ohne PEC gezeigt in In vivo - Wachstumsfaktor durch den Träger geliefert werden müssen Auswaschen zu vermeiden. Aus unserer Nagetier und Schweinemodell, können wir die Dosis von BMP-2 um 20-fach und 6-fach bzw. abzusenken. Die Reduktion der nicht nur unerwünschte Nebenwirkungen zu verringern, sondern auch die Kosten für die Wachstumsfaktor-Verwendungs ​​verkürzt sich.

Abbildung 1: Elektrostatische Perle Generator und Spritzenpumpe in BSL-2 Biosicherheitsschrank eingerichtet (A) Düse gesichert am Düsenhalter.. (B) Große Becken für Strontiumchloridlösung. (C) Elektrodenkabel. (D) Schlauch liefert Alginatlösung. (E) Düsenhalter und Arm. (F) Elektroden Versorgung ter Potentialdifferenz die Perlengröße zu regulieren. (G) Magnetrührer. (H) 5 ml Spritze. (I) Eine Spritzenpumpe Alginat Fluss zu regulieren. (J) Agitator Steuerknopf Rührgeschwindigkeit zu steuern. (K) Spannungsregelung Regler , um die Potentialdifferenz zwischen 0-10 kV zu regulieren. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Mess Alginat - Mikrokügelchen mit ImageJ Software Nachdem Sie die Image - Datei zu öffnen , indem Sie Datei → Öffnen klicken, folgen Schritt 1:. Das Linienwerkzeug klicken und eine Linie auf den Alginat - Mikrokügelchen zeichnen. Analysieren Sie in der Menüleiste in Schritt 2 klicken und ein Pop-up-Fenster erscheint. Wiederholen Sie Schritt 1 und 2, bis alle Mikrokügelchen mea sindversicherten. In Schritt 3, klicken Sie auf das Linienwerkzeug, eine Linie über die Maßstabsleiste ziehen und die Länge der Skala bar messen. Konvertieren Sie die Mikrokügelchen Länge um unter Verwendung von Formel:. Länge von Alginat / Länge von Maßstabsbalken x 500 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3:. Schematische Darstellung der Polyelektrolytkomplex Alginate Kern (dunkelgrün) positive Ladung Protamin Schicht (hellgrün), negative Ladung Heparin Schicht (rot), osteogene Wachstumsfaktor, zB BMP-2 / NELL-1 auf äußerste Schicht (pale blau). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4:. Hellfeldbilder von Alginat - Mikrokügelchen (A) Nicht-bestrahlt. (B) 8M Rad bestrahlt. Nicht bestrahlte Alginat-Mikrokügelchen sind kugelig und die 8M Rad bestrahlten Gegenstück ist Tropfenform. Vergrößerung 100X. (Maßstabsbalken = 500 & mgr; m.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5:. Konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie - Aufnahmen von Alginat - Mikrokügelchen mit fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin inkubiert, Nell-1 und BMP-2 (A) CF 405 Protamin (blau), (B) CF 594 Heparin (rot), (C ) FITC NELL-1 (grün) und (D Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6:. Aufnahme und Freisetzung von BMP-2 und Nell-1 (A) Die Aufnahme von Nell-1 - Protein (schwarz) BMP-2 (rot), (B) Kumulierter Freisetzungskurve von BMP-2 (rot) und NELL- 1 (schwarz) aus PEC Träger. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<br /> Fig . 7: Cytotoxicity Assay (A) MTT - Assay von Kaninchen - Knochenmark stammt Zelle mit Protamin basierend PEC NELL-1 200 mg / ml (schwarz) zu extrahieren, PEC-NELL-1 100 mg / ml Extrakt (weiß) an Tag 1 und 3 (B) Alamar - Blue - Assay von Kaninchen Knochenmark stammt Zelle mit PEC BMP-2 (blau), PEC (grün) Die Versuche wurden dreifach durchgeführt und die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8: Bioaktivität Assay für BMP-2 und Nell-1 - Freisetzung aus PEC Träger (A) ALP - Aktivität von Kaninchen Knochenzelle mit PEC-Nell-1 (schwarz), PEC (rot) inkubiert Stammmark.. ALP-Aktivität wurde als Extinktion bei 405 nm gemessen. 2.2fachen Anstieg der ALP - Aktivität wurde nach der Inkubation mit PEC-Nell-1 am 14. Tag (B) ALP - Aktivität von Kaninchen Knochenmarkstammzellen mit PEC-BMP-2 (rot) PEC-BMP-2 + Zugabe von BMP- inkubiert beobachtet 2 (grün) und PEC (blau). In ALP - Aktivität erhöhen nach der Inkubation mit PEC-BMP-2 und PEC-BMP-2 + Zugabe von BMP-2 an Tag 7, ALP - Aktivität fällt auf 9. Tag (C) ALP - Aktivität von Kaninchen Knochenmarkstammzellen mit PEC- inkubiert BMP-2 (rot) BMP-2 (blau) und Medium (grün). Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9: Polycaprolacton Tri-Calciumphosphat (PCL-TCP) Gerüst mit PEC Träger verpackt (A) Polycaprola.ctone Tri-Calciumphosphat (PCL-TCP) Gerüst (Porengröße 1300 & mgr; m) mit PEC Träger verpackt. (B) PCL-TCP Gerüst. (C) Hohe Vergrößerung: PEC behält seine Form nach der Verpackung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von PECs durch die Schicht-für-Schicht self-assembly. Der Schicht-für-Schicht-Struktur wird unter Verwendung von fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin visualisiert, BMP-2 und Nell-1 und der konfokalen Mikroskopie. Uptake und Release-Tests zeigen, dass auf PEC Heparin osteogenen Wachstumsfaktor Aufnahme und Freisetzung vermittelt. Die Aufnahme Effizienz des PEC Methode ist: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Der PEC Träger hat eine bessere Modulation Nell-1 (20%) Freisetzung im Vergleich zu einer reinen Oberflächenadsorption Träger wie Calcium Apatit - Teilchen (40-80%) ^11.

Neben modulierende Freisetzung, neutralisiert Heparin die übermäßige positive Ladung von Polykationen wie Protamin ¹² unerwünschte Zytotoxizität Fragen zu vermeiden. Die PECs zeigen keine Anzeichen von Zytotoxizität, wie ⁷ durch den MTT - Assay und der Alamar - Blau - Assay bestimmt. Die ALP-Test zeigt die PEC Träger die Bioact halten kannivity sowohl NELL-1 und BMP-2. Obwohl osteogenen Wachstumsfaktor BMP-2-Therapie in Spondylodese Operationen entwickelt, lässt sich PEC auch andere Wachstumsfaktoren mit Heparin-Bindungsdomänen wie Nell-1 und PDGF-BB in Anspruch nehmen. Im Vergleich zu anderen Versandmethoden wie Kapselung von Wachstumsfaktoren in Polyglykolsäure Mikrokugeln, BBW erfordern keine organischen Lösungsmittel, die das Wachstum ¹³ Faktoren zu inaktivieren neigen.

Eine Anzahl von Faktoren in der PEC Herstellungsverfahren kann Trägerleistung beeinträchtigen. Erstens wirkt Mikrobead Größe der Oberfläche / Volumen-Verhältnis. Höhere osteogenen Wachstumsfaktor Belastung kann mit kleineren Mikrokügelchen erreicht werden. Zweitens sollte die Alginatkonzentration ausreicht, um die Stabilität des Mikrokügelchens Struktur beizubehalten. Microbead Stabilität hängt von Alginat-Typ, Kettenlänge (durch Gamma-Bestrahlung betroffen sind) und das zweiwertige Ion verwendet (Barium> Strontium> Calcium). Während 2% Alginat-Lösung ist ausreichend, um manufacture PECs mit stabilen Mikrokügelchens Strukturen, 4% Alginat erforderlich folgenden 8 MRad Gammabestrahlung für die Effekte von Alginat Kettenverkürzung während der Bestrahlung zu kompensieren. Drittens ist die Rate der in vivo - Abbau von Alginat - Mikrokügelchen stark von Alginat Kettenlänge beeinflusst. Basierend auf unserer Erfahrung aus Ratten und Schweinen Modelle, hergestellt PEC unter Verwendung von 8 Mrad bestrahlt Alginat schnelle zeigt (28 Tage) und den vollständigen Abbau des Alginat-Kern (nicht veröffentlichte Daten). Der Abbau des Alginat-Kern bietet Raum wesentlich für das Einwachsen des Knochens. Viertens kann die Inkubation über Nacht von BMP-2 und Nell-1 bei 4 ° C unter konstantem Schütteln (beispielsweise 30 rpm) Aufnahmeeffizienz verbessern. Schließlich ist die Beschichtungsdicke Protamin zeitabhängig. Da das Ausmaß der Protamin-Heparin-Wechselwirkung die Freisetzung von osteogenen Wachstumsfaktoren wie BMP-2 bestimmt oder NELL-1, 1 Std Protamin Inkubation nimmt die Stabilität der PEC-Struktur zu verbessern.

in vivo - Bioaktivität zu verlängern. In Anbetracht der sehr begrenzten Menge an Heparin beteiligt und in Verbindung mit der Wahl des Antidot, dh Protamin (ein hochwirksames Medikament in der gerinnungshemmenden Aktivitäten von Heparin zu neutralisieren), verlängerte Blutungszeit in geschälten Knochen ist weitgehend theoretisch und praktisch belanglos.

die PEC in den PCL-TCP Gerüst Laden verbessert bei Implantatstellen Lokalisierung von Perlen. Scaffolds bieten notwendige mechanische Unterstützung, die für die Wirbelsäulenfusion von entscheidender Bedeutung ist. In den vorliegenden Untersuchungen verwendeten wir PCL-TCP - Gerüste mit 1300 & mgr; m Poren richtige Verpackung (Abbildung 9) zu erleichtern. Obwohl die aktuelle Darstellung Lieferung osteogenen Wachstumsfaktor zeigt PEC mit dem PCL-TCP Gerüst hat unsere Gruppe auch Trägerleistung mit einem Polyetherketonketon (PEKK ausgewertet) Knochenkammer in einer Studie an Kaninchen mit ähnlicher Wirksamkeit.

In dieser Studie konnte das Fehlen Vergleich mit anderen zuvor bewerteten Träger von rhBMP-2 und Nell-1 eine Einschränkung darstellen.

Abschließend stellt das vorgestellte Verfahren einen nützlichen Träger zu steuern Freisetzung von osteogenen Wachstumsfaktoren mit Heparin-Domänen wie BMP-2 und Nell-1. Die beschriebene Strategie kombiniert viele Vorteile: Es ist nicht auf BMP-2 beschränkt und anwendbar auf andere Wachstumsfaktoren mit Heparin-Bindungsdomänen wie Nell-1. Eine Dosisreduktion auf osteogene Wachstumsfaktor kann unerwünschte Nebenwirkungen zu verringern, wie seroma, heterotrophen Knochenbildung und senken die Gesamtkosten der Behandlung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane	PALL	PN4612	Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration
24 well plate	Cell Star	662160
96 well plate Nuclon Delta Surface	Thermo Fisher Scientific	167008
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT	Sigma Aldrich	M5655	Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1
Acetone	Fisher Scientific	A/0600/17	Precipitate CF-405 Labeled protamine
Alamar Blue	Invitrogen, Life Technologies	DAL 1025	Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit	Anaspec	AS-72146
Ammonium Chloride	Merck	Art 1145	Stop reagent in FITC labeling
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Invitrogen, Life Technologies	D12345	Solvent for fluorescent isothiocyanate I
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich		Dissolve  formazan
Autoclave	Hirayama	HU-110	Sterilize alginate beads by steam
Beta-glycerophosphate	Sigma Aldrich	G9422
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit)	Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA	7510800	Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA)	Thermo Fisher Scientific	A-6222	To quantify NELL-1 protein
Cell Strainer (100 µm)	BD Science	352360	Hold PEC for ALP assay
Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm	SPL Life Science	90030	Detach the cell from 24 well plate
CF 405S, Succinimidyl Ester	Sigma Aldrich	SCJ4600013	Blue fluorescent dye for protamine labeling
CF 594, Hydrazide	Sigma Aldrich	SCJ4600031	Deep red fluorescent dye for heparin labeling
Centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Confocal Microscope	Olympus	FV1000
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Component of osteogenic growth medium
Dextran Desalting Columns	Pierce (Thermo Scientific)	43230
DMEM	Gibco	12320
BMP-2 Quantikine ELISA Kit	R&D System	DBP200	Determine BMP-2 release
Fetal Bovine Serum FBS	Hyclone	SV30160.03
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I	Sigma Aldrich	F7250	Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling
ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile	Greiner	662630	Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus)	Havard Apparatus	70-2208
n-Hexane (>99%)	Sigma Aldrich	139386
Heparin	Sigma Aldrich	H3149	Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain
Hydrochloric acid (37%)	Merck	100317	Highly Corrosive
Incubator	Binder	C8150
MicroBCA Protein Assay kit	Thermoscientific	23235
Microplate Reader	Tecan	Infinite M200	For ALP and microBCA assays
Nisco cell encapsulator	Nisco Engineering Inc	Encapsulation unit VAR V1
Fluorescent Microscope	Olympus	IX71
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm)	Osteopore	PCL-TCP 0/90	Hold PEC for in vivo study
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml	Hyclone Cell Culture	SV30010	Antibiotic
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Vivantis	PB0344-1L	10x Solution, Ultra Pure Grade
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000	Sigma Aldrich	P2568	Polycation
Protamine Sulfate salt, from Salmon	Sigma Aldrich	P4020	Polycation
Shaker	Labnet	S2025
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet	Thermo Fisher Scientific	68035	Remove unreacted FITC by dialysis
Sodium Chloride	Merck	1.06404.1000
Sodium Hydroxide	Qrec	S5158
Sodium Bicarbonate	US Biological	S4000	Buffer
Sodium carbonate	Sigma Aldrich	S7795-500G	Buffer
Strontium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	255521	Crosslinker for alginate
Spatula	3dia
5 ml syringe	Terumo	140425R	Diameter of syringe affects the flow rate
75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck	Corning	730720
Toluidine Blue	Sigma Aldrich	52040	Heparin assay
Trypsin 1x	Hyclone Cell Culture	SH30042.01
Sodium alginate	Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)	Pronova UPMVG	Core material of microbeads