Abstract
rekonstrüktif kemik ameliyatlarında sırasında, büyüme faktörleri suprafizyolojik miktarda ampirik başarılı kemik füzyonu teşvik etmek iskelelerinin üzerine yüklenir. yüksek ölçüde güçlü bir biyolojik maddelerin büyük dozlar nedeniyle, hızlı enzimatik bozulmaya sonucu büyüme faktörü instabilitesi gibi yerleştirme alanında büyüme faktörü yeterli miktarda lokalize taşıyıcı verimsizliklere yol gerekmektedir. Bu nedenle, onların serbest bırakılmasını BMP-2 / NELL-1 gibi büyüme faktörlerinin istikrarını uzatmak ve kontrol stratejileri aslında onların etkili doz düşük olabilir ve bu nedenle gelecekteki kemik rejenerasyonu ameliyatları sırasında büyük dozlarda ihtiyacını azaltır. sırayla Bu yan etkiler ve büyüme faktörü maliyetlerini azaltacaktır. Kendinden monte PECS in vivo istikrarı artırarak bağlama heparin ve daha fazla güçlendirebilir büyüme faktörü biyoaktivite aracılığıyla BMP-2 / NELL-1 teslimat daha iyi kontrol sağlamak için imal edilmiştir. Burada delive yardımcıları PEC üretim sadeliği göstermektedirrekonstrüktif kemik ameliyatlar sırasında büyüme faktörleri, çeşitli Ry.
Introduction
Psödoartroza sıklığı dejeneratif omurga kaynaştırma ve revizyon omurga cerrahisinde 1 içinde% 10 ila 45 kadar yüksek olduğu rapor edilmiştir. BMP-2, Nell-1 1 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) olarak osteojenik büyüme faktörleri de novo osteogenesisi teşvik etmek getirilmiştir omurga füzyon ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları sırasında psödoartrozu oranını azaltmak için. Bunlar arasında, BMP-2 spinal füzyon 2 için popüler bir seçimdir. Uyarılması ve yeni kemik oluşumunu kolaylaştırmak BMP-2 gücü de 3 kanıtlanmış olmasına rağmen, Böyle heterotopik kemik oluşumu, seroma ve hematom oluşumu, inflamatuvar yanıt, radikülit, vertebral gövde osteoliz ve retrograd ejakülasyon olarak klinik olarak anlamlı komplikasyonlar nedeniyle 4,5 kullanılan suprafizyolojik miktarlarda endişe konusu olmaya devam etmektedir.
Bu nedenle, BMP-2 dozunun düşürülmesi de bir ilgili bir strateji kalıryan etkileri en aza indirmek için cezbeder. Ayrıca, verimli taşıyıcı sistemleri BMP-2, çağdaş kollajen sünger taşıyıcı sistemlerinde gözlenen ilk patlama salınımını baskılamak ve daha fazla bu güçlü sitokinin uzun süreli ve yerel teslim geliştirmek için gereklidir. Katyonik ve anyonik polielektrolit alternatif katman-katman montajı çok iskele matrisleri veya implante edilebilir malzemelerin 6 yüzeyinde polielektrolit kompleksleri oluşturmak için ayarlanabilir bir yöntem olarak da kullanılabilir. Bu açıdan, (bütün biyolojik maddelerin en yüksek negatif yük yoğunluğuna sahip olan bilinen) heparin yakından takip ettiği, elektrostatik ve heparin bağlayıcı alan ile büyüme faktörleri, çeşitli bağlandığı bilinmektedir. Gerçekten de, heparin yarı ömrünü uzatmak ve dolayısıyla çeşitli büyüme faktörleri biyo-aktivitesini güçlendirdiği gösterilmiştir.
Buna dayanarak, bizim grup heparin tabanlı polielektrolit kompleksi (PEC) olduğunu imal etmek için bir katman-katman öz-montaj protokolü adapte yükler ve immobilizasyon 7,8 sırasında osteojenik büyüme faktörlerinin biyoetkinlikleri korur. Aljinat mikroboncuk çekirdek α-L-guluronat (G) iki değerlikli katyon kalsiyum ya da stronsiyum iyonlarıyla aljinat artıkları çapraz bağlanması ile imal edilmiştir. Aljinat damarın en az bir biyolojik olarak parçalanabilir bir iskele matrisidir; hangi implantasyon sonra, kemikli büyümesi için oda sağlayan füzyon yatakta emilir. Poli-L-lisin (PLL) ya da protamin (bu durumda, alginat mikroboncuk, taşıyıcı çekirdek) iskele matris ve negatif yüklü heparin hem ile bir araya katyonik bir tabaka olarak kullanılmaktadır; anyonik heparin tabakası fonksiyonları stabilize etmek ve yüklenen büyüme faktörleri lokalize iken. Üçlü tabaka PEC bir domuz modelinde 9 büyüme faktörü yükleme kapasitesini artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, PEC taşıyıcılar başarılı bir şekilde sıçan 10 ve spinal füzyon 8 domuz modellerinde en az 20-kat BMP-2 etkin dozunu azaltmak için gösterilmiştir.
ntent "> Burada bir örnek osteojenik büyüme faktörü olarak BMP-2 kullanılarak spinal füzyon gelişmiş büyüme faktörü teslimat ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları için imalatı Halk yöntemlerini rapor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. aljinat çözeltisi hazırlanması
- sodyum alginat (ışınlanmamış) ya da 8 Mrad 400 mg, 200 mg çözülür iki defa destillenmiş su, 10 ml sodyum alginat ışınlanmış ve yayılan alginat 1 saat ve ışınlanmış alginat 15 dakika boyunca çalkalanır. gece boyunca 4 ° C 'de aljinat çözeltisi saklayın. aljinat microbead fabrikasyon önce steril 0.2 mikron şırınga filtresi ile aljinat çözüm Filtre.
2. Aljinat microbead İmalatı
- % 70 etanol ile elektrostatik boncuk jeneratör ve şırınga pompası dezenfekte edin ve bir Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini (Şekil 1) koyun.
- Boncuk jeneratör içinde bir manyetik karıştırma çubuğu ile bir cam lavabo yerleştirin.
- 9 cm havzası üzerinde boncuk jeneratör kol elektrodu ayarlayın.
- Kol elektrodun tırtıklı vida 2 boncuk jeneratör elektrod kablosunu ve içine SRCL 2 solüsyon 80 ml dökünhavza.
- Yük şırınga ve kauçuk tüpe 0.2 um filtre edildi aljinat çözeltisi 5 mi. kol elektrot kauçuk tüp bağladıktan sonra, boru içindeki havayı dışarı atmak ve meme ucu aljinat çözüm sunmak için 2 dakika süreyle 5 ml / saatte bir şırınga pompası açın. şırınga pompası kapatın.
- Sonraki, kapsülleyicide geçin ve sonra, şırınga pompası microbead nesil başlaması. 5 ml / saatlik bir aljinat akış hızı kullanıldı ve kapsülleyici 5.8 kV voltaj ayarlayın. Bu mikro-düzensiz boyutlu ve şekilli olması eğilimi, ilk iki dakika (veya şırınga pompalanan ilk 0.5 mi aljinat çözeltisi) esnasında üretilen mikroboncukları atın.
- 0.2 M stronsiyum klorür çözeltisi içinde daha sonra, mikro-boncuklar toplayın. aljinat çözeltisi önceden planlanmış hacmini pompalama sonra şırınga pompası ve (bu sırayla) kapsülatör hem kapatın. microbead imalat sonraki partiler için bu işlemi tekrarlayın. Tamamlandığında, çevirmekİlk şırınga pompası f kapsülleyicide izledi.
- Çapraz bağlama doldurun ve jeli stabilize etmek için gece boyunca 4 ° C 'de 0.2 M, stronsiyum klorür solüsyonu, 20 ml mikro-boncuklar saklayın.
Aljinat mikro boncuklar 3. Ölçü
- plastik bir pipet ile aljinat mikroboncuk 0.5 ml toplar ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. 10X büyütmede bir optik mikroskop altında, mikro-boncuklar gör. Bir mikroskop CCD kamera ile mikro-on görüntüleri çekmek. çözünürlüğü 2048 x 1536 TIFF formatında ölçek çubuğu (500 mikron) ile görüntüleri kaydedin.
- ImageJ uzunluk araçlarını kullanarak, mikro boncuklar ve ölçek çubuğu (Şekil 2) boyutunu ölçmek. mikrometre piksel microbeads uzunluğu dönüştürün.
- satırı araçları üzerine tıklayın ve aljinat boncuk ortasında bir çizgi çizin.
- "Tedbir" menü çubuğunda "Analiz" ve seçin tıklayın. Bir pop-up penceresi açılacaktır.
- ölçek çubuğu x 500 um aljinat boncuk / uzunluğu uzunluğu: formül kullanılarak gerçek uzunluğu aljinat boncuk çapı dönüştürün. Örneğin, 1.420 (ImageJ ile ölçülen çap) / 2,657 (ImageJ ile ölçülen ölçek çubuğu uzunluğu) * 500 mikron = 267 mm.
- mikro-her parti temsilcisi boyutu olarak (ortalama ± standart sapma) 100 mikro boncuklar ortalama büyüklüğü göz önünde bulundurun.
4. Sterilizasyon
- 100 mikron naylon süzgeç kullanarak mikrobilyeleri toplayın ve çift distile su ile boncuk yıkayın.
- Bir spatula ile, 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.1 ml aljinat solüsyondan yapılan tüm mikroboncukları transferi ve kurumasını önlemek için bir gazlı bez ile kaplayın.
- Son olarak, bir sıvı modunu kullanarak otoklav ile sterilize mikroboncukları (115 ° C, 15 dakika) ya da m uygun olarakanufacturer spesifikasyonları. Kurutma boncuk önlemek için bölmeye damıtılmış su, 1.5 L ilave edin.
5. Protamin ve Heparin Kaplama
- BSL-2 başlık içinde, 2 mg / oda sıcaklığında 1 saat boyunca (0.2 um'lik bir şırınga filtresi kullanılarak sterilize edilmiş) mi protamin çözeltisi, 1 ml steril mikroboncukları inkübe edin.
- 1 saat (Basamak 5.1) mikroboncuklar inkübe edildikten sonra, mikro bisinkoninik asit (MicroBAC) testi (bölüm 6) için protamin çözeltisi 150 ul toplar.
- çift distile su ile iki kez protamin kaplı mikroboncuklarm yıkayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'de bir masa üstü santrifüj kullanılarak dönerler. Santrifüj işleminden sonra, bir şırınga kullanılarak su aspire.
- 0.5 mg, 1 ml protamin kaplanmış olan mikro inkübe / polielektrolit kompleksi oluşturmak için 30 dakika (PEC) (a 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak sterilize edilmiş) ml heparin solüsyonu.
- protamin kaplanmış mikro-f inkübe edildikten sonraya da 30 dakika (Adım 5.4), heparin içeriği (bölüm 7) belirlemek için heparin solüsyonu 400 ul toplamak.
- İnkübasyondan sonra, iki kez distile su ile iki kez yıkayarak Halk Bağlanmamış heparin yıkayın.
6. Protamin İçeriği
- üretici talimatlarına göre MicroBAC testi yapın. Kısaca, 96 gözlü bir plaka 150 ul protamin çözeltisi (önce ve mikro-ile inkübasyondan sonra toplanmıştır) ekleyin. 150 ul MicroBAC çalışma çözeltisi ekleyin.
- Kalibrasyon standartları, albümin çözeltisi (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ve 200 ug / ml) kullanın.
- 60 ° C'de 60 dakika süreyle inkübe karışımı. 562 nm'de bir spektrofotometre ile absorbansı ölçülür.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bilinmeyen numune protamin konsantrasyonunu belirlemek için standart bir eğri kullanın.
- içinde protamin toplam miktarını çıkartarak mikro-protamin içeriğini belirlemek(Mikrotaneciklerin ile inkübasyondan sonra) kaplama çözeltisi içinde kalan protaminin miktarından (mikrotaneciklerin ile inkübasyondan önce) kaplama solüsyonu.
7. Heparin İçerik
- Mavi 4 mg toluidin ve 0.01 N hidroklorik asit içinde 20 mg sodyum klorür çözülmesiyle çalışma çözeltisinin 10 ml hazırlayın.
- 30 sn 3 ve vorteks: 2 oranında çalışma çözeltisine (adım 5.5) örnek 400 ul ekleyin.
- n-heksan (çalışma reaktifi çözeltisine, eşdeğer hacimde) 600 ul ilave edin ve toluidin mavisi heparin kompleksi elde etmek için karışımın girdap.
- Aspire Faz ayrılmasından sonra şırıngayla sulu faz 200 ul.
- 631 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak sulu faz içinde ihtiva un ekstre toluidin mavisi miktarını ölçün.
- 0-20 ug / ml heparin standart çözümler hazırlayın.
- ug / m heparin konsantrasyonuna karşı her heparin standardının 631 nm okuma arsal. Her numunenin heparin konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri kullanın.
Katman-katman Yapının 8. Konfokal görüntü
- protamin, Heparin ve NELL-1 / BMP-2 floresan analog CF-405 protamin (mavi), CF 594 heparin (kırmızı) imal ve FITC NELL-1 / FITC etiketli göre olan (yeşil) BMP-2 + heparin + protamin üreticinin etiketli Teknik veri sayfası.
- Kat 100 fluoresan analog 300 ul ug mikro-(5.3-5.6 tarif edildiği gibi kaplama yöntemi) CF-405, protamin (mavi) (2 mg / ml, 1 saat inkübasyon), CF 594 heparin (kırmızı) (0.5 mg / ml 30 dakika) ve FITC etiketli NELL-1 / FITC etiketli (yeşil) BMP-2 (1.5 mg / ml, gece boyunca). Bağlanmamış flüoresan protamin, heparin ve NELL-1 / BMP-2 ortadan kaldırmak için damıtılmış su ile iki kez, mikro-boncuklar yıkayın.
- 10X büyütmede bir konfokal mikroskop kullanılarak katman-katman yapısı (Şekil 3) uyun. 7
9. BMP-2NELL-1 Alımı ve Yayın ve
- Yük PEC 100 ug BMP-2 veya NELL-1 çözeltisi 1.5 mg / ml 13.3 ul. 10 saat çalkalanarak 30 rpm altında 4 ° C'de inkübe edin PEC.
- Sabit çalkalama (30 rpm) ile 37 ° C'de fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml mikroboncukları bırakın.
- 1 mL süpernatan toplamak ve 1, 3, 6, 10 ve 14 gün sonra, 1 ml PBS ile değiştirin.
- alımını değerlendirmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak ELISA yöntemi ile BMP-2 etkinliğinin bırakın. alımını değerlendirmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak karboksibenzoil kinolin-2-karboksaldehit (CBQCA) proteini deneyi yöntemi kullanılarak nell-1 etkinliğini bırakın.
- zaman (t) kümülatif serbest belirleyin:
zaman zaman (t) + Önceki bırakmada zaman (t) = Release kümülatif salım (t-1). - zamana karşı BMP-2 ve Nell-1 kümülatif salınımını çizilir.
10. İn Vitro BiyoaktiviteNELL-1
Not: Nell'ın-1 PEC serbest biyo-tavşan kemik iliği kök hücreleri (rBMSC) alkalin fosfataz (ALP) ekspresyonunu artırmak için kabiliyeti ölçülerek değerlendirildi.
- Tohum 20,000 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına rBMSCs ve bunları fetal sığır serumu (FBS) CO2, 37 ° C'de ve% 5 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 1 ml bir gün için büyümeye olanak sağlar.
- 24 saat sonra, 10 -8 mol / L deksametazon,% 10 FBS,% 2 penisilin streptomisin, 50 mg / ml, askorbik asit, 10 mg / L, beta-gliserofosfat ile takviye edilmiş bir osteojenik ortamında (DMEM, 1 ml orta yerine ve ) 37 ° C'de 7 gün ve% 5 CO2 için.
- hücreler (bu osteojenik orta değişim sırasında PEC mikro-boncuk arınma önler) ayrı PECleri tutmak için 300 mikrogram PEC-NELL-1 hücre kültürü ekler içinde ve PEC (adım 8.2 dan itibaren) (TC insert) yerleştirin. Yeri TC pl iyi 24 takın14 gün boyunca yedi.
- Bir kez her üç günde bir, aspirat 1 TC insert dışında bir iğne koyarak osteojenik orta ml ve taze osteojenik ortamın 1 ml ile değiştirin.
- İnkübasyondan 7 ve 14 gün sonra, kit, üreticinin protokolüne uygun olarak ALP deney kiti ile ALP aktivitesi belirlenir.
- 10 dakika boyunca 4 ° C 'de,% 0.1 Triton X-100 içeren deney tamponu ile lizleyin hücreleri. Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapıştırılır hücreleri kazımak. en az 60 dakika boyunca karıştırılarak 4 ° C'de bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 4 ° C'de 2,500 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. ALP tahlil için süpernatant toplayın.
- 200, 96 gözlü bir levhanın gözleri ml 0 ng / seri olarak seyreltilmiş alkalin fosfataz standart solüsyon 50 ul ekle. alkalin fosfataz standart nihai miktarlar / 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 ve 0 ng.
- Seyreltme b aşama 10.5.2 süpernatant ekleyin (50 ul / oyuk) ve seyreltilmişUffer.
- Her kuyuya p-nitrofenil fosfat (pNPP) alt-tabaka çözeltisi 50 ul ekle. yavaşça 30 saniye boyunca plaka sallayarak reaktifleri karıştırın. Karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe karışımı. plaka okuyucusu ile 405 nm'de absorbansı ölçülür.
- kalibrasyon eğrisi kullanılarak ALP aktivitesinin hesaplanması.
- üreticinin talimatlarına göre MicroBAC protein tahlil kiti kullanılarak protein içeriği belirlenir. Protein içeriği ALP aktivitesini bölerek ALP aktivitesini normalleştirmek.
11. Hücre Canlılık
- 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 24 saat -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) 37 ° C'de DMEM +% 10 FBS, 1 ml PEC-nell-1 200 mg inkübe deneyi.
- Tohum 2.000 rBMSCs oyuk başına ve 96 oyuklu bir plaka içerisinde (% 10 FBS DMEM 100 ul) 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 1 gün süreyle inkübe edilir.
- PEC-NELL-1 / PEC ekstresi 100 ul DMEM +% 10 FBS yerine yerleştirin ve inkübe37 ° C'de,% 5 CO2.
- 1 gün ya da 3 gün inkübasyondan sonra, 5 mg / ml MTT solüsyonu 10 ul ve daha fazla karanlıkta 4 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir.
- Formazan kristalleri çözmek üzere, her bir oyuğa 100 ul DMSO çözeltisi ekleyin.
- Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 570 nm'de absorbans belirler.
- göreceli büyüme oranını hesaplayın:
İskele ve BMP-2 ve NELL-1 Yükleniyor içine 12. Ambalaj
- BSL-2 odasının içinde sterilize edilmiş bir spatula kullanılarak tri-kalsiyum fosfat (mPCL-TCP) iskele - Bir biyoçözünür tıbbi dereceli polikaprolakton gözeneklerine PECleri paketleyin.
- PEC dolu mPCL-TCP yapı iskelesi üzerinde 1.5 mg / BMP-2 veya nell-1 ml solüsyonu eklenir ve gece boyunca 4 ° C enkübe edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim bir taşıyıcı olarak, protamin benzer kimyasal özelliklere sahip olarak poli-L-lisin yerine seçilmiş ve FDA heparin antidot olarak onaylanmıştır. Optik mikroskop sonuçlar ışınlanmamış mikro-267 ± 14 um'lik bir çapa sahip küre şekilli olduğunu göstermiştir. (0.35 mm meme, 5 ml / saat ve 5.8 kV akış oranı). Işınlanmış mikro-çoğunluğu gözyaşı şeklindedir. Işınlanmış mikro-yuvarlak bölümü üzerinde ölçülen çap (4 ml / sa ve 6 kV akış oranı, 0.35 mm meme) 212 ± 30 um idi. (Şekil 4).
PEC mikro-Konfokal görüntüler CF-405 etiketli protamin (mavi), CF594 etiketli heparin (kırmızı) ve FITC-BMP-2 / FITC NELL-1 (yeşil) katman-katman kaplama ortaya koymaktadır. Sonuçlar PEC ile bağlanabildiği göstermektedir pozitif BMP-2 şarj negatif heparin bindinin ile NELL-1 yüklüng alanı (Şekil 5). Bu Halk Eğitim ve osteojenik büyüme faktörleri arasındaki etkileşim bağımlı şarj olmadığını göstermektedir.
PEC 'alımı ve BMP-2 serbest kanıtlamak için, BMP-2 inkübasyondan sonra kalan miktarı ve gün 1, 3, 6, 10 ve 14 PBS BMP-2 miktarını belirlemek için bir ELISA tahlili kullanılan . Ancak, benzer bir yaklaşım önemli ölçüde sinyalini azaltarak, bloklar antikor bağlanma yeri heparin beri, NELL-1 proteini ile iyi çalışmaz. Bu nedenle, CBQCA protein tahlili PEC-Nell-1 ve PEC arasındaki farkı belirlemek için kullanılmıştır. Toplam serbest bırakılma grafiğinden de, Halk sadece BMP-2 ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir NELL-1 alım verimi gösterir ama aynı zamanda BMP-2'den çok daha yavaş serbest bırakın (Şekil (Nell-1:% 25: BMP-2 genel% 20) 6). Bu Halk BMP-2'den nell-1 daha sıkı bir şekilde bağlanan göstermektedir.
From MTT deneyi, PEC-NELL-1 (Şekil 7) sitotoksik değildir. Sonuç önceki çalışmada 7 Alamar Mavisi tahlil sonucu eşleşir. Heparin PEC biyouyumluluk korumada önemli bir rol oynar protamin 'nin pozitif yükünü nötralize eder.
PEC NELL-1 salım, uzun süreli osteojenik farklılaşma, bir osteojenik markör ekspresyon seviyesini, alkalin fosfataz (ALP) etkileyip etkilemediğini belirlemek için, bir kolorimetrik deney ile araştırılmıştır. PEC NELL-1 sürümü PEC kontrol grubuna (Şekil 8) göre 14. günde 2.2 kat tavşan kemik iliği kök hücrelerinin ALP aktivitesini artırır. BMP-2 günden 7. güne 9 faaliyet Her iki PEC-BMP-2 ve PEC-BMP-2 + ekstra BMP-2 gösteri azalma üzerinde ALP aktivitesinin maksimum artış (3.75 kat) göstermektedir.
PEC olmayan ortam BMP-2, ALP aktivitesi gösterilmiştir
Şekil 1: Elektrostatik boncuk jeneratör ve şırınga pompası BSL-2 biyogüvenlik kabini kurmak meme tutucu güvenli (A) Memesi.. (B) stronsiyum klorür solüsyonu için büyük havza. (C) Elektrot kablo. (D) Hortum aljinat çözüm sunuyor. (E) Meme tutucu ve kol. (F) elektrotlar tedarik to potansiyel farkı boncuk boyutunu düzenler. (G) Manyetik karıştırıcı ile donatıldı. (H) 5 ml şırınga. (I) Şırınga pompası aljinat akışını düzenlemek için. (J) Karıştırma kontrol düğmesi karıştırma hızını kontrol etmek için. (K) Gerilim kontrol düğmesi 0-10 kV arasındaki potansiyel farkı düzenler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: ImageJ yazılım ile aljinat mikroboncuklarm Ölçme Dosya → Aç tıklayarak görüntü dosyası açtıktan sonra, Adım 1 izleyin. Satırı aracını tıklayın ve aljinat mikro boncuklar üzerine bir çizgi çizin. 2. Adımda, menü çubuğunda görünecektir bir pop-up pencerede analiz tıklayın. Tekrarlayın Adım 1 ve Adım 2 Tüm microbeads mea kadarölçüldü. 3. Adımda, çizgi aracını tıklatın ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizin ve ölçek çubuğunun uzunluğunu ölçmek. Kullanarak formülü ile um microbeads uzunluğu dönüştürmek. Ölçek çubuğu aljinat / uzunluğu uzunluğu x 500 mm Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. En dış katmanda Polielektrolit Kompleksinin şematik gösterimi Aljinat kısım (koyu yeşil) pozitif yük protamin tabakası (soluk yeşil), negatif yük heparin tabakası (kırmızı), osteojenik büyüme faktörü, örneğin BMP-2 / NELL-1 (soluk mavi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Aljinat mikro-Parlak alan görüntüleri (A) Sigara ışınlanmış. (B) 8M Rad ışınlanmış. Sigara ışınlanmış aljinat mikro boncuk küresel ve 8M Rad meslektaşı gözyaşı şeklindedir ışınlanmış. Büyütme 100X. (Ölçek çubuğu = 500 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. NELL-1 ve BMP-2, protamin, heparin flüoresan analogları ile inkübe alginat mikro-Konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleri (A) CF 405 Protamin (mavi), (B), CF 594 heparin (kırmızı), (Cı ) FITC NELL-1 (yeşil) ve (D Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:. NELL-1 proteini (siyah) alımından ve BMP-2 ve nell-1 salınımı (A) Alım BMP-2 (kırmızı), (B), BMP-2 (kırmızı) ve NELL- Kümülatif serbest eğrisi PEC taşıyıcıdan 1 (siyah). Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
<Br /> Şekil 7:. Sitotoksisite Deneyi tavşan, kemik iliği (A) MTT deneyi kaynaklanmaktadır protamin göre PEC NELL-1, 200 mg / (siyah) elde mi, PEC-NELL-1 100 mg / özü mL (beyaz) hücre gün 1 ve 3 (B) tavşan kemik iliği Alamar mavisi tahlil PEC BMP-2 (mavi) ile hücre kaynaklanıyor, PEC (yeşil) Deneyler üç kopya halinde yapıldı ve sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 8: BMP-2 ve PEC taşıyıcıdan NELL-1 sürümü için Biyoaktivite Deneyi (A) PEC-NELL-1 (siyah), PEC (kırmızı) ile inkübe tavşan kemik iliği kök hücre ALP aktivitesi.. ALP aktivitesi 405 nm'de absorbans ölçüldü. 2.2ALP aktivitesinde artış PEC-Nell-1 Gün 14. (B) PEC-BMP-2 (kırmızı) BMP- PEC-BMP-2 + ilavesi ile kuluçkaya tavşan kemik iliği kök hücre ALP aktivitesinde ile inkübasyondan sonra gözlenmiştir kat 2 (yeşil) ve PEC (mavi). PEC-BMP-2 ve PEC-BMP-2 Gün 7 de BMP-2 + eklenmesi ile inkübasyon sonrası ALP aktivitesinin artması, ALP aktivitesi Günü 9. damla tavşan kemik iliği kök hücre (C) ALP aktivitesi PEC- ile inkübe BMP-2 (kırmızı) BMP-2 (mavi) ve Orta (yeşil). Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 9: PEC taşıyıcı ile dolu Polikaprolakton Tri-kalsiyum fosfat (PCL-TCP) iskele (A) Polycaprola.PEC taşıyıcı ile dolu ctone Tri-kalsiyum fosfat (PCL-TCP) iskele (gözenek boyutu 1.300 mikron). (B) PCL-TCP iskele. (C) Yüksek büyütme: PEC ambalaj sonra şeklini muhafaza eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, katman-katman kendinden montaj yoluyla Halk hazırlanması için bir yöntem sunmaktadır. katman-katman yapısı protamin, heparin, BMP-2 ve NELL-1 ve konfokal mikroskopi floresan analogları kullanılarak görüntülenmiştir. Alımı ve serbest testler PEC üzerinde heparin osteojenik büyüme faktörü alımı ve serbest aracılık ettiğini göstermektedir. PEC yönteminin alımı verimliliği: NELL-1: 86.7 ± 2.7%, BMP-2: 70.5 ± 3.1%. PEC, taşıyıcı, örneğin kalsiyum apatit parçacıklar (% 40-80), 11 olarak saf bir adsorpsiyon taşıyıcıya göre NELL-1 (% 20) serbest bırakılması daha iyi bir modülasyon sahiptir.
Serbest modüle yanı sıra, heparin istenmeyen sitotoksisite ile ilgili konularda 12 kaçınmak için böyle protamin olarak polikatyon aşırı pozitif yükü nötralize eder. MTT deneyi ve Alamar Mavisi tahlilinde 7 ile belirlenen PEC, sitotoksisite herhangi bir belirti göstermez. ALP tahlil PEC taşıyıcı bioact koruyabilirsiniz gösterirNell-1 ve BMP-2 hem ivity. Spinal füzyon ameliyatları osteojenik büyüme faktörü BMP-2 terapisi için geliştirilmiş olsa da, aynı zamanda, PEC nell-1 ve PDGF-BB heparin bağlayıcı alan diğer büyüme faktörleri kadar sürebilir. Bu poliglikolik asit mikrosferleri büyüme faktörlerinin kapsülleme gibi diğer uygulama yöntemlerine kıyasla, Halk büyümesi 13 faktör inaktive eğilimi organik çözücüleri gerektirmemektedir.
PEC imalat prosedüründe bir dizi faktör taşıyıcı performansını etkileyebilir. Birincisi, microbead boyutu yüzey alanı / hacim oranını etkiler. Yüksek osteojenik büyüme faktörü yükleme küçük mikro-ile elde edilebilir. İkinci olarak, alginat konsantrasyonu mikroküre yapısının stabilitesini sağlamak için yeterli olmalıdır. Microbead istikrar aljinat tipi, (gama ışınlaması etkilenen) zincir uzunluğu ve kullanılan iki değerlikli iyon (baryum> stronsiyum> kalsiyum) bağlıdır. % 2 aljinat çözeltisi iken üreticilerinin için yeterlidirstabil mikroboncuk yapılarla Halk Re,% 4 alginat uygulama sırasında alginat zincirli katı etkilerini telafi etmek için 8 Mrad gama ışıması aşağıdakiler gereklidir. Üçüncü olarak, aljinat mikro-in vivo degradasyon oranı güçlü alginat zincir uzunluğu etkilenir. Sıçan ve domuz modellerden tecrübelerimize dayanarak, PEC 8 Mrad aljinat aljinat çekirdek (yayınlanmamış veri) (28 gün) hızlı ve tam bozulmasını gösterir ışınlanmış kullanılarak imal. aljinat çekirdeğin Parçalanma kemik büyümesi için oda olmazsa olmaz olan sağlar. Dördüncü olarak, sabit şekilde çalkalanarak (örneğin 30 rpm) ile, 4 ° C'de, BMP-2 ve nell-1 gece boyunca inkübasyon alım verimliliğini artırabilir. Son olarak, protamin kaplama kalınlığı bağımlı zamanıdır. protamin heparin etkileşimini ne ölçüde BMP-2 veya nell-1 gibi osteojenik büyüme faktörleri serbest belirlediği için, protamin inkübasyondan 1 saat PEC yapının kararlılığını artırmak için benimsenmiştir.
in vivo biyolojik aktivitesi uzatmak için oldukça önemlidir. Heparin, katılan ve antidot bir seçim ile birlikte çok sınırlı bir miktarda verilen örneğin, protamin, dekortike kemikte kanama zaman (heparin anti-koagulan aktivitelerini nötralize son derece etkili bir ilaç) büyük ölçüde teorik ve pratik önemi yoktur.
PCL-TCP iskelesi içine PECleri yükleniyor implant sitelerinde boncuk lokalizasyonu artırır. Yapı iskeleleri omurga füzyon için çok önemlidir gerekli mekanik destek sağlar. Mevcut çalışmalarda, biz doğru ambalaj (Şekil 9) kolaylaştırmak için 1.300 mikron gözenekleri ile PCL-TCP iskeleleri kullanılır. Geçerli illüstrasyon PCL-TCP iskele ile PEC osteojenik büyüme faktörü teslim göstermesine rağmen, bizim grup da PEKK (bir polyetherketoneketone taşıyıcı performansını değerlendirdibenzer etkinlik ile bir tavşan çalışmasında) kemik odası.
Bu çalışmada, rhBMP-2 ve nell-1 ve diğer daha önce değerlendirilen taşıyıcılar ile karşılaştırıldığında olmaması bir sınırlama teşkil edebilir.
Sonuç olarak, sunulan prosedür, BMP-2 ve nell-1 gibi heparin etki alanları ile osteojenik büyüme faktörlerinin salımını kontrol etmek için faydalı bir taşıyıcı içerir. tarif edilen strateji, bir çok avantajı vardır: bu BMP-2 sınırlıdır ve nell-1 gibi heparin bağlayıcı alan diğer büyüme faktörleri için geçerli değildir. osteojenik büyüme faktörü dozun azaltılması gibi seroma, heterotrofik kemik formasyonu gibi istenmeyen yan etkileri azaltmak ve tedavi maliyetini düşürebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz herhangi bir çıkar çatışması var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
