Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

Published: August 22, 2016 doi: 10.3791/54202
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 3,4, 5, 1,4
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

Abstract

במהלך ניתוחי עצם שיקומיים, כמויות supraphysiological של גורמי גדילה נטענות באופן אמפירי על פיגומים לקדם ואיחוי העצמה מוצלח. מינונים גבוהים של חומרים ביולוגיים חזקים מאוד נדרשים בשל חוסר יציבות גורמת גדילה כתוצאת שפלת אנזימטית מהירה כמו גם חוסר יעילות המוביל לאיתור כמויות מספיקות של גורם גדילה באתרי שתל. לפיכך, אסטרטגיות להאריך את היציבות של גורמי גדילה כגון BMP-2 / נל-1, ולשלוט שחרורם באמת יכול להפחית את המינון שלהם יעיל ובכך להפחית את הצורך במינונים גדולים יותר במהלך ניתוחים התחדשות העצם בעתיד. זה בתורו יפחית תופעות לוואי ועלויות גורם גדילה. פץ עצמית התאסף כבר מפוברקת כדי לספק שליטה טובה יותר של BMP-2 / נל-1 משלוח באמצעות הפרין פעילות ביולוגי גורם גדילה להגביר עוד יותר מחייב על ידי שיפור יציבות vivo. כאן אנו מדגימים את הפשטות של ייצור PEC אשר מסייעת deliveר"י של מגוון של גורמי גדילה במהלך ניתוחי עצם שיקומיים.

Introduction

תחולת pseudoarthrosis דווחה להיות גבוה ככל 10 עד 45% בניתוחים בעמוד השדרה היתוך השדרה ניווניות ותיקון 1. כדי להפחית את שיעור pseudarthrosis במהלך היתוך שדרה וניתוחי עצם שיקומיים אחרים, גורמי גדילת osteogenic כגון BMP-2, נל-1 1 ו גורם גדילה טסיות נגזר (PDGF) הוכנסו לקדם דה נובו osteogenesis. בין אלה, BMP-2 היא בחירה פופולרית עבור היתוך השדרה 2. למרות העוצמה של BMP-2 בזירוז והקלה היווצרות העצם החדש כבר מבוססת היטב 3; סיבוכים משמעותיים קליני כגון היווצרות עצם heterotopic, seroma היווצרות שטף דם, תגובה דלקתית, radiculitis, osteolysis גוף שדרה, שפיכה מדרדרת ממשיכים להיות בעיות של דאגה בשל כמויות supraphysiological בשימוש 4,5.

לכן, הוריד המינון של BMP-2 נשאר אסטרטגיה רלוונטית בביתמפתה כדי למזער תופעות לוואי. חוץ מזה, מערכות הספק יעילות נדרשות לדכא את שחרור הפרץ הראשוני של BMP-2 שנצפה מערכות ספק ספוג עכשווי קולגן נוסף לשיפור שירות ממושך המקומי של ציטוקינים זה חזק. השכבה-ידי שכבתי הרכבה העצמית לסירוגין polyelectrolytes קטיוני anionic יכולה להיות מועסקת כשיטה מתכוננת להקים מתחמי polyelectrolyte על פני השטח של מטריצות פיגום או חומרים מושתלים 6. מבחינה זו, הפרין (ידוע שיש צפיפות המטען השלילית הגבוהה ביותר של כל הגורמים הביולוגיים) הוכר לאגד בשקיקה עם מגוון רחב של גורמי גדילה באמצעות תחומים מחייבים אלקטרוסטטי הפרין. ואכן, הפרין הוכח להאריך את זמן מחצית החיים ובכך להגביר את הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה אחדים.

על בסיס זה, הקבוצה שלנו מותאמת פרוטוקול שכבה אחר שכבה הרכבה עצמית לפברק קומפלקס polyelectrolyte מבוסס הפרין (PEC) כי המון ומשמר את bioactivities של גורמי גדילה osteogenic במהלך קיבוע 7,8. ליבת microbead אלגינט היה מפוברק על ידי crosslinking α-L-guluronate (G) שאריות של אלגינט עם divalent קטיון יוני סידן או סטרונציום. ליבת אלגינט היא מטריצת פיגום מתכלה; אשר לאחר ההשתלה, הוא resorbed במיטה היתוך מתן מקום ingrowth הגרמי. פולי- L- ליזין (PLL) או protamine משמש כשכבת קטיוני כדי לשזור בשתי המטריצה ​​הפיגום (במקרה זה, ליבת המוביל microbead אלגינט) ואת הפרין טעונים שלילית; בעוד שכבת פונקציות הפרין anionic לייצב בתרגום גורמי גדילה טעון. השכבה המשולשת PEC הוכחה להגדיל את קיבולת טעינה גורם גדילה במודל חזירי 9. לאחרונה, ספקי PEC הוכחו להפחית את המינון האפקטיבי בהצלחה של BMP-2 על ידי לפחות פי 20 חולדה 10 ומודלים חזיריים של היתוך שדרת 8.

ntent "> כאן אנו מדווחים שיטות פץ בודה למסירת גורם גדילה מוגברת היתוך שדרה ואת ניתוחי עצם שיקומיים האחרים באמצעות BMP-2 כגורם צמיחת osteogenic מודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פתרון אלגינט

  1. ממיסים 200 מ"ג של אלגינט נתרן (לא מוקרן) או 400 מ"ג של 8 MRad מוקרן אלגינט נתרן ב 10 מ"ל מים מזוקקים פעמיים ולנער עבור שעה 1 עבור אלגינט הלא הקרין ו -15 דקות עבור אלגינט מוקרן. אחסן את הפתרון אלגינט על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. סנן הפתרון אלגינט עם מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק סטרילי לפני ייצור microbead אלגינט.

2. ייצור אלגינט Microbead

  1. לחטא את הגנרטור חרוז אלקטרוסטטי משאבת מזרק עם 70% אתנול ו למקם אותם Class II הקבינט בטיחות ביולוגית (איור 1).
  2. מניח כיור זכוכית עם בר ומערבבים מגנטי בתוך גנרטור החרוז.
  3. הגדר את האלקטרודה הזרוע של הגנרטור החרוז 9 סנטימטרים מעל הכיור.
  4. חברו את כבל האלקטרודה של הגנרטור חרוז אל בורג המחורצים 2 של האלקטרודה הזרוע, ויוצקים 80 מ"ל של תמיסת 2 SrCl לתוךאַגָן.
  5. טען 5 מ"ל של 0.2 מיקרומטר פתרון אלגינט מסונן לתוך הצינור מזרק וגומי. לאחר חיבור צינור גומי אל האלקטרודה הזרוע, לעבור על משאבת מזרק 5 מ"ל / שעה למשך 2 דקות כדי לגרש את האוויר בתוך צינורות ולספק הפתרון אלגינט אל קצה הזרבובית. כבה את משאבת מזרק.
  6. לאחר מכן, לעבור על encapsulator ולאחר מכן, משאבת מזרק כדי להתחיל דור microbead. הגדר את קצב הזרימה אלגינט ב 5 מ"ל / שעה ואת המתח 5.8 kV על encapsulator. מחק את microbeads שנוצר במהלך בשתי הדקות הראשונות (או פתרון 0.5 מיליליטר אלגינט הראשוני שאוב מן המזרק), כמו microbeads אלה נוטה להיות בגודל לא סדיר בצורה.
  7. אסוף microbeads לאחר בתמיסה כלוריד 0.2 M סטרונציום. כבה את משאבת מזרק ואת encapsulator (בסדר הזה) לאחר שאיבה בהיקף מתוכנן מראש של פתרון אלגינט. חזור על פעולה זו עבור קבוצות עוקבות של ייצור microbead. בסיום, להפוך שלf משאבת מזרק הראשון, ואחריו encapsulator.
  8. אחסן את microbeads ב 20 מ"ל של תמיסת כלוריד 0.2 M סטרונציום ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים לחצות קישור ולייצב את הג'ל.

3. מדידת גודל של microbeads אלגינט

  1. אסוף 0.5 מ"ל של microbeads אלגינט עם טפטפת פלסטיק ומניחים אותו בשקופית זכוכית. הצג את microbeads תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10X. קח עשר תמונות של microbeads עם מצלמת CCD מיקרוסקופ. שמור את התמונות עם סרגל מידה (500 מיקרומטר) בפורמט TIFF ברזולוציה 2,048 x 1,536.
  2. שימוש בכלים בהרחבה ImageJ, למדוד את גודל microbeads וגמא בר (איור 2). המרת אורך microbeads מן פיקסל מיקרומטר.
    1. הקש על כלי השורה למתוח קו על פני באמצע חרוז אלגינט.
    2. לחץ על "נתח" על שורת התפריטים ובחר "מדוד". חלון מוקפץ יופיע.
    3. המרת בקוטר של חרוז אלגינט אורך בפועל באמצעות הנוסחה: אורך של חרוז אלגינט / אורך של סרגל מידה x 500 מיקרומטר. לדוגמה, 1.420 (קוטר נמדד על ידי ImageJ) / 2.657 (אורך סרגל קנה המידה שהיא נמדדת על ידי ImageJ) * 500 מיקרומטר = 267 מיקרומטר.
  3. קח למשל את הגודל הממוצע של 100 microbeads (ממוצע ± סטיית תקן) כמו גודל הנציג של כל מנה של microbeads.

עיקור 4.

  1. אסוף את microbeads באמצעות מסננת ניילון 100 מיקרומטר ולשטוף את החרוזים עם מים מזוקקים פעמיים.
  2. בעזרת מרית, להעביר את כל microbeads עשוי פתרון אלגינט 0.1 מ"ל לתוך צינור 2 מ"ל microcentrifuge ומכסים גזה כדי למנוע התייבשות.
  3. לבסוף, לחטא את microbeads ידי מעוקר באמצעות מצב נוזלי (115 ° C, 15 דקות) או בהתאם מטרהמפרטים של anufacturer. להוסיף 1.5 ליטר של מים מזוקקים לתא למנוע חרוזים מהתייבשות.

5. protamine ציפוי הפרין

  1. בתוך מכסה המנוע BSL-2, דגירה microbeads סטרילי עם 1 מ"ל של 2 מ"ג / פתרון protamine מ"ל (עיקור באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר דוגרים microbeads עבור שעה 1 (שלב 5.1), לאסוף 150 μl של פתרון protamine עבור חומצה bicinchoninic מיקרו (microBCA) מבחן (סעיף 6).
  3. שטפו את microbeads מצופה protamine פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. ספין למטה באמצעות צנטריפוגות העליון הספסל ב XG 200 במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, לשאוב מים באמצעות מזרק.
  4. דגירה microbeads מצופה protamine עם 1 מ"ל של 0.5 מ"ג / פתרון הפרין מ"ל (עיקור באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר) למשך 30 דקות כדי ליצור מורכבות polyelectrolyte (PEC).
  5. לאחר דוגרי f microbeads מצופה protamineאו 30 דקות (שלב 5.4), לאסוף 400 μl של פתרון הפרין כדי לקבוע את תוכן הפרין (סעיף 7).
  6. לאחר דגירה, לשטוף את הפרין מאוגד מן פץ על ידי שטיפה פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים.

תוכן protamine 6.

  1. בצע את בדיקת microBCA לפי הוראות יצרן. בקצרה, להוסיף 150 פתרון protamine μl (לפני ואחרי הדגירה עם microbeads) לתוך צלחת 96 באר. להוסיף 150 פתרון עובד μl microBCA.
  2. השתמש פתרון אלבומין (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ו -200 מיקרוגרם / מ"ל) כסטנדרט כיול.
  3. דגירה את התערובת למשך 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. מדוד את הספיגה עם ספקטרופוטומטר ב 562 ננומטר.
  4. השתמש עקומת התקן כדי לקבוע את ריכוז protamine של כל מדגם לא ידוע על פי הוראות היצרן.
  5. קבע את התוכן protamine של microbeads ידי קיזוז הסכום הכולל של protamine בפתרון הציפוי (לפני הדגירה עם microbeads) מהסכום של protamine שנותרו פתרון הציפוי (לאחר דגירה עם microbeads).

7. תוכן הפרין

  1. הכן את 10 מ"ל של הפתרון עובד על ידי המסת 4 toluidine מ"ג נתרן כלורי כחול 20 מ"ג 0.01 N חומצה הידרוכלורית.
  2. להוסיף 400 μl של מדגם (משלב 5.5) כדי הפתרון עובד לפי יחס של 2: 3 ו מערבולת למשך 30 שניות.
  3. להוסיף 600 μl של n-הקסאן (בהיקף שווה ערך ל הפתרון מגיב עבודה) ו מערבולת את התערובת כדי לחלץ את מורכבות הפרין toluidine הכחולות.
  4. לשאוב 200 μl של השלב המימי על ידי מזרק לאחר הפרדת פאזות.
  5. מדוד את כמות toluidine הכחולה-חילוץ בלתי כלולה בשלב המימי באמצעות ספקטרופוטומטר ב 631 ננומטר.
  6. הכינו פתרונות סטנדרטיים הפרין של 0-20 מיקרוגרם / מ"ל.
  7. מגרש את הקריאה 631 ננומטר של כל תקן הפרין לעומת ריכוז הפרין מיקרוגרם / מ 'l. השתמש עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז הפרין של כל דגימה.

8. תמונה Confocal של מבנה שכבה אחר שכבה

  1. לפברק protamine, הפרין ונל-1 / BMP-2 אנלוגי פלורסנט CF-405 protamine (כחולה), CF 594 הפרין (אדום) ואת FITC שכותרתו נל-1 / FITC שכותרתו (ירוק) BMP-2 + הפרין + protamine פי יצרן גיליון נתונים טכני.
  2. מעיל 100 מיקרוגרם microbeads עם 300 μl של אנלוגי ניאון (שיטת ציפוי כמתואר 5.3-5.6) CF-405 protamine (כחול) (2 מ"ג / מ"ל, 1 hr הדגירה), CF 594 הפרין (אדום) (0.5 מ"ג / מ"ל, 30 דקות) ו FITC שכותרתו נל-1 / FITC שכותרתו (ירוק) BMP-2 (1.5 מ"ג / מ"ל, לילה). שטפו את microbeads פעמיים עם מים מזוקקים כדי לחסל את protamine, הפרין ניאון מאוגד ונל-1 / BMP-2.
  3. שימו לב למבנה שכבה אחר שכבה (איור 3) באמצעות מיקרוסקופ confocal בהגדלה 10X. 7

9. BMP-2ונל-1 ספיגת שחרור

  1. טען 13.3 μl של 1.5 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת BMP-2 או נל-1 על 100 מיקרוגרם של PEC. דגירת PEC על 4 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 30 סל"ד רעדו במשך 10 שעות.
  2. לטבול את microbeads ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) בשעה 37 ° C עם רעד קבוע (30 סל"ד).
  3. אסוף 1 מ"ל של supernatant ולהחליפה 1 מ"ל PBS לאחר 1, 3, 6, 10 ו -14 ימים.
  4. להעריך את הספיגה ולשחרר יעילות של BMP-2 בשיטת ELISA פי הפרוטוקול של היצרן. להעריך את הספיגה ולשחרר יעילות של נל-1 בשיטת assay חלבון carboxybenzoyl quinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) על פי הפרוטוקול של היצרן.
  5. לקבוע שחרור מצטבר בשלב (t):
    שחרור מצטבר זמן (t) = שחרור בשלב (t) + השחרור קודם בשלב (t-1).
  6. מגרש שחרור מצטבר של BMP-2 ו נל-1 נגד הזמן.

10. במבחנת פעילות ביולוגיתשל-1 נל

הערה: הפעילות הביולוגית של נל-1 שוחררה מבית PEC הוערכה על ידי מדידת יכולתה להגדיל את הביטוי של phosphatase אלקליין (ALP) בתאי גזע ארנב מח עצם (rBMSC).

  1. זרע 20,000 rBMSCs לכל היטב צלחת 24 גם ולאפשר להם לגדול במשך יום אחד עם 1 מיליליטר של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) + 10% בסרום שור עוברי (FBS) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לאחר 24 שעות, להחליף בינוני עם 1 מ"ל של מדיום osteogenic (DMEM בתוספת 10% FBS, סטרפטומיצין פניצילין 2%, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 מילימול / ליטר בטא glycerophosphate, ו -10 -8 mol / L dexamethasone ) למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. מניח 300 מיקרוגרם PEC-נל-1 (משלב 8.2) ו PEC בתוך מוסיף תרבית תאים (להוסיף TC) כדי לשמור על שרירי החזה נפרדים מן התאים (זה ימנע את הכישלון של microbeads PEC במהלך השינוי הבינוני osteogenic). TC מקום להכניס לתוך 24 גם plאכלו במשך 14 ימים.
  4. אחת לשלושה ימים, לשאוב 1 מ"ל של המדיום osteogenic ידי הצבת מחט מחוץ הכנס TC, ולהחליף עם 1 מ"ל של מדיום osteogenic טריים.
  5. לאחר 7 ו -14 ימים של דגירה, לקבוע פעילות ALP עם ערכת assay ALP בהתאם הפרוטוקול של יצרן הערכה.
    1. Lyse תאים עם חיץ assay המכיל 0.1% TritonX-100 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אל תגרד את תאים דבקים באמצעות מגרד תא. דגירת השעית תא ב 4 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה במשך דקות 60 לפחות.
    2. צנטריפוגה השעית התא ב 2500 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אסוף את supernatant עבור assay ALP.
    3. הוסף 50 μl של פתרון סטנדרטי phosphatase אלקליין בדילול סדרתי מן 200 עד 0 ng / ml אל הבארות של צלחת 96 באר. הסכומים הסופיים לסטנדרטי phosphatase אלקליין 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15, ו -0 ng / טוב.
    4. מוסיפים את supernatant משלב 10.5.2 (50 μl / טוב) ו לדלל עם ב דילולuffer.
    5. הוסף 50 μl של פוספט p -nitrophenyl (pNPP) פתרון המצע לבאר כל אחד. מערבבים את ריאגנטים ידי טלטול הצלחת בעדינות למשך 30 שניות. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בחושך. מדוד את הספיגה ב 405 ננומטר על ידי קורא צלחת.
    6. חישוב פעילות ALP באמצעות עקומת כיול.
  6. לקבוע תכולת החלבון באמצעות ערכת assay חלבון microBCA פי הוראות היצרן. לנרמל את פעילות ALP ידי חלוקת פעילות ALP ידי תכולת החלבון.

כדאיות התא 11.

  1. דגירה 200 מ"ג של PEC-נל-1 עם 1 מ"ל של FBS DMEM + 10% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עבור 3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) assay.
  2. זרע 2,000 rBMSCs לכל טוב (100 μl של DMEM עם 10% FBS) בצלחת 96 היטב דגירה במשך 1 יום ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. החלף DMEM + 10% FBS עם 100 μl של תמצית PEC-נל-1 / PEC דגירהב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. לאחר יום 1 או 3 ימים של דגירה, להוסיף 10 μl של 5 מ"ג / פתרון MTT מ"ל דגירה נוספת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 4 שעות בחושך.
  5. הוספת 100 פתרון DMSO μl היטב כל להמיס את הגבישים formazan.
  6. קבע את הספיגה ב 570 ננומטר באמצעות קורא microplate.
  7. לחשב את שיעור הצמיחה היחסית:
    משוואה 1

אריזה 12. לתוך הפיגום ו- BMP-2 & נל-1 Loading

  1. ארוז את שרירי החזה לתוך הנקבוביות של Polycaprolactone כיתה רפואית bioresorbable - פוספט תלת-סידן (mPCL-TCP) פיגום בעזרת מרית מעוקרת בתוך חדר BSL-2.
  2. הוסף 1.5 מ"ג / מיליליטר פתרון של BMP-2 או נל-1 על פיגום mPCL-TCP העמוס PEC דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במנשא שלנו, protamine נבחר כתחליף של פולי- L- ליזין שכן יש תכונות כימיות דומות וזה FDA אישר כנוגדן של הפרין. תוצאות מיקרוסקופ אופטיות הראו כי microbeads הלא המוקרן היו בעלי צורה כדורית בקוטר של 267 ± 14 מיקרומטר. (0.35 זרבובית מ"מ, קצב הזרימה של 5 מ"ל / hr & 5.8 קילו וולט). רוב microbeads המוקרן הם בצורת דמעה. הקוטר נמדד על החלק העגול של microbeads מוקרן היה 212 ± 30 מיקרומטר (0.35 זרבובית מ"מ, קצב הזרימה של 4 מ"ל / hr & 6 קילו וולט). (איור 4).

תמונות Confocal של microbeads PEC לחשוף ציפוי שכבה אחר שכבה של protamine שכותרתו CF-405 (כחול), הפרין שכותרתו CF594 (אדום) ו FITC-BMP-2 / FITC-נל-1 (ירוק). תוצאות המחקר מראות כי פץ יכול להיקשר עם מטען חשמלי חיובי BMP-2 ו מטען שלילי נל-1 דרך בינדי הפריןתחום ng (איור 5). הדבר מצביע על כך את האינטראקציה בין שרירי החזה ואת גורמי גדילת osteogenic לא גובה תלויה.

כדי להוכיח כי פץ יכול ספיגת ולשחרר BMP-2, השתמשנו assay ELISA כדי לקבוע את כמות BMP-2 הנותרים לאחר דגירה וכמות BMP-2 PBS ביום 1, 3, 6, 10 ו -14 . עם זאת, גישה דומה לא עובדת טוב עם החלבון נל-1, מאז הפרין חוסם את אתר קישור הנוגדן, צמצום משמעותי את האות. לכן, assay חלבון CBQCA שימש כדי לקבוע את ההבדל בין פי אי סי-נל-1 ו- PEC. מתוך עקומת השחרור מצטברת, פץ לא רק להראות יעילות ספיגה נל-1 גבוהה בהשוואה ל BMP-2 אלא גם לשחרר אותו הרבה יותר לאט מאשר BMP-2 (נל-1: 20% לעומת BMP-2: 25%) (איור 6). הדבר מצביע על כך פץ לאגד יותר בחוזקה עם נל-1 מ BMP-2.

frאום מבחן MTT, PEC-נל-1 הוא לא ציטוטוקסיות (איור 7). התוצאה תואמת עם תוצאת assay הכחולה Alamar במחקר קודם 7. הפרין מנטרל את המטען החשמלי החיובי של protamine אשר ממלא תפקיד חשוב בשמירה על ההתאמה הביולוגית של PEC.

כדי לקבוע אם לשחרר נל-1 מ PEC משפיע בידול osteogenic לטווח ארוך, את רמת הביטוי של סמן osteogenic, phosphatase אלקליין (ALP), נחקר על ידי assay colorimetric. נל-1 שחרור PEC מגביר את פעילות ALP של תאי גזע במח עצם הארנב ב -2.2 קפל היום 14 בהשוואה לקבוצת ביקורת PEC (איור 8). BMP-2 מראה גידול הפעילות מקסימאלי ALP (3.75 לקפל) ביום 7. שניהם PEC-BMP-2 ו PEC-BMP-2 + תוספת BMP-2 תכנית הירידה של פעילות ביום 9.

פעילות ALP עם BMP-2 במדיום ללא PEC מוצגת בשנת vivo, גורם גדילה חייב להיות מועברת על ידי המוביל להימנע כשלון. מאת המכרסמים שלנו ומודל חזירי, נוכל להוריד את המינון של BMP-2 על ידי פי 20 ו -6 פי, בהתאמה. הצמצום לא רק להפחית תופעות לוואי לא רצויות, אלא גם יצמצם את עלות שימוש גורם גדילה.

איור 1
איור 1: מחולל חרוז אלקטרוסטטית מזרק משאבה להגדיר בארון בטיחות ביולוגי BSL-2 (א) נחיר מאובטח על בעל זרבובית.. (ב) אגן ביג עבור פתרון סטרונציום כלורי. (C) אלקטרודה כבל. (ד) Hose מספקת פתרון אלגינט. (ה) בעל נחיר וזרוע. (F) אלקטרודות אספקת tהוא פרש הפוטנציאלים להסדיר את גודל החרוז. (G) בוחש מגנטי. (H) 5 מ"ל מזרק. (I) משאבת מזרק כדי להסדיר את זרימת אלגינט. (J) Agitator מלא ידית לשלוט מהירויות ערבוב. (K) ידית שליטה מתח להסדיר את הפרש הפוטנציאלים בין 0-10 קילו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מדידת microbeads אלגינט עם תוכנת ImageJ לאחר פתיחת קובץ תמונה על ידי לחיצה על קובץ → להרחיב, בצע שלב 1:. לחץ על כלי השורה למתוח קו על microbeads אלגינט. בשלב 2, לחץ על נתח בשורת התפריטים וחלון מוקפץ יופיע. חזור על שלב 1 ושלב 2 עד שכל microbeads הוא mea לחצים. בשלב 3, לחץ על כלי הקו, למתוח קו על פני סרגל מידה ולמדוד את אורכו של סרגל מידה. המרת אורך microbeads כדי מיקרומטר ידי הנוסחה באמצעות:. אורך של אלגינט / אורך של בר סולם x 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. ייצוג סכמטי של קומפלקס polyelectrolyte הליבה אלגינט (ירוק כהה) שכבת protamine מטען חיובי (ירוק בהיר), שכבת הפרין מטען שלילי (אדום), גורם גדילה osteogenic, למשל, BMP-2 / נל-1 על השכבה החיצונית (חיוור כחול). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

> איור 4
איור 4:. תמונות שדה מוארת של microbeads אלגינט (א) ללא מוקרן. (ב) 8M רד מוקרן. microbeads אלגינט ללא מוקרן הם כדוריים ואת 8M רד מוקרן עמיתו הוא בצורת דמעה. הגדלה 100X. (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. תמונות במיקרוסקופ סריקת לייזר Confocal של microbeads אלגינט מודגרות עם אנלוגים הניאון של protamine, הפרין, נל-1 ו- BMP-2 (א) CF 405 protamine (כחול), (ב) CF 594 הפרין (אדום), (C נל-1 FITC) (ירוק), ו- (ד לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:. ספיגה ושחרור BMP-2 ו נל-1 (א) ספיגת חלבון נל-1 (שחור) BMP-2 (אדום), (ב) עקום שחרור מצטבר של BMP-2 (אדום) ו NELL- 1 (שחור) מן הספק PEC. תוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7 <br /> איור 7:. Assay Cytotoxicity (א) assay MTT של מח העצם ארנב נובעת תא עם protamine מבוסס PEC נל-1 200 מ"ג / מ"ל לחלץ (שחור), PEC-נל-1 100 מ"ג / מ"ל לחלץ (לבן) ב יום 1 ו -3 (ב) assay הכחול Alamar של מח עצם הארנב נובע תא עם PEC BMP-2 (כחול), PEC (ירוקים) ניסויים בוצעו בשלושה עותקים ותוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8: הפעילות הביולוגית Assay עבור BMP-2 ושחרור נל-1 מן הספק PEC (א) פעילות ALP של תאי גזע במח העצם ארנב מודגרות עם PEC-נל-1 (שחור), PEC (אדום).. פעילות ALP נמדדה כמו ספיגה ב 405 ננומטר. 2.2קפל עלייה בפעילות ALP נצפתה לאחר דגירה עם PEC-נל-1 ב יום 14. (ב) פעילות ALP של תאי גזע במח העצם ארנב מודגרות עם PEC-BMP-2 (אדום) PEC-BMP-2 + תוספת של BMP- 2 (ירוק) PEC (כחול). עלייה בפעילות ALP לאחר הדגרה עם PEC-BMP-2 ו PEC-BMP-2 + תוספת של BMP-2 ב יום 7, פעילות ALP טיפות ביום 9. (ג) ALP פעילות של תאי גזע במח העצם ארנב מודגרות עם PEC- BMP-2 (אדום) BMP-2 (כחול) בינוני (ירוק). תוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
איור 9: Polycaprolactone Tri-סידן פוספט (PCL-TCP) פיגום ארוז עם הספק PEC (א) Polycaprola.פוספט Tri-סידן ctone (PCL-TCP) פיגום (גודל נקבובי 1,300 מיקרומטר) ארוז עם ספק PEC. (ב) פיגום PCL-TCP. (ג) גדלה גבוהה: PEC על צורתו גם לאחר האריזה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטה לעריכת פץ דרך שכבה אחר שכבה הרכבה עצמית. שכבת-ידי שכבת המבנה דמיינו באמצעות אנלוגים הניאון של protamine, הפרין, BMP-2 ו נל-1 ו מיקרוסקופיה confocal. ספיגה ובדיקות לשחרר מראים כי הפרין על PEC מתווכת ספיגה ושחרור גורם גדילת osteogenic. היעילות הספיגה של שיטת PEC היא: נל-1: 86.7 ± 2.7%, BMP-2: 70.5 ± 3.1%. מנשא PEC יש אפנון טוב יותר של נל-1 (20%) שחרור לעומת נשאית ספיחת משטח טהורה כגון חלקיקי אפטיט סידן (40-80%) 11.

מלבד ויסות שחרור, הפרין מנטרל את המטען החשמלי החיובי המופרז polycations כגון protamine, כדי למנוע בעיות לא רצויה cytotoxicity הקשורות 12. פץ לא מראה שום סימני רעילות, כפי שנקבע על ידי assay MTT ואת assay 7 כחול Alamar. את assay ALP מציג מוביל PEC יכול לשמור על bioactivity של שני נל-1 ו- BMP-2. למרות שפותח לטיפול BMP-2 גורם גדילת osteogenic בניתוחי היתוך שדרה, PEC יכול גם לקחת את גורמי גדילה אחרים עם תחומי מחייב הפרין כגון נל-1 ו PDGF-BB. בהשוואה לשיטות משלוח אחרות כגון אנקפסולציה של גורמי גדילת microspheres חומצת polyglycolic, פץ אינו דורש ממסים אורגניים נוטים להשבית צמיחת גורמי 13.

מספר גורמים בהליך ייצור PEC עשוי להשפיע על ביצועי הספק. ראשית, גודל microbead משפיע על יחס שטח פנים / נפח. טעינת גורם גבוהה הצמיחה osteogenic יכולה להיות מושגת באמצעות microbeads קטן. שנית, ריכוז אלגינט צריך להספיק כדי לשמור על יציבות המבנה microbead. יציבות Microbead תלוי בסוג אלגינט, אורך שרשרת (מושפע קרינת גמא) ואת יון divalent בשימוש (בריום> סטרונציום> סידן). בעוד 2% פתרון אלגינט מספיק כדי manufactu מחדש פץ עם מבני microbead יציבים, אלגינט% 4 נדרש בא הקרנה גמא 8 MRad כדי לפצות על ההשפעות של קיצור שרשרת אלגינט במהלך הקרנה. שלישית, שיעור שפלת in vivo של microbeads אלגינט מושפע במידה רבה על ידי אורך שרשרת אלגינט. בהתבסס על הניסיון שלנו ממודלים חולדה חזירי, PEC מפוברק באמצעות 8 MRad מוקרן אלגינט תערוכות מהירה (28 ימים) ושלמה השפלה של הליבה אלגינט (נתונים שלא פורסמו). ביזוי של הליבה אלגינט מספק חדר חיוני ingrowth הגרמי. רביעית, דגירת הלילה של BMP-2 ו נל-1 ב 4 ° C עם רעד קבוע (למשל, 30 סל"ד) יכולה לשפר את יעילות ספיגה. לבסוף, עובי הציפוי protamine הוא תלוי זמן. מאז מידת האינטראקציה הפרין-protamine קובע את שחרורו של גורמי גדילה osteogenic כגון BMP-2 או נל-1, 1 hr של הדגירה protamine תאומץ על מנת לשפר את יציבות המבנה PEC.

s = "jove_content"> השימוש הפרין בטכניקה זו הוא קריטי בייצוב גורמי הגדילה העדין שכך, חשוב להאריך ב bioactivity vivo. בהתחשב בכמות מוגבלת מאוד של הפרין מעורב יחד עם הבחירה של התרופה, כלומר, protamine (תרופה יעילה מאוד לנטרל את פעילות אנטי-קרישה של הפרין), זמן דימום ממושך בעצם מְקוּרקָף הוא תיאורטי בעיקרו ומעשית חסר חשיבות.

טעינת פץ לתוך פיגום PCL-TCP משפרת לוקליזציה של חרוזים באתרי שתל. פיגומים לספק תמיכה מכאנית הכרחית כי הוא חיוני עבור היתוך שדרה. במחקרים הנוכחיים, השתמשנו פיגומי PCL-TCP עם 1,300 מיקרומטר נקבובי כדי להקל אריזה נכונה (איור 9). למרות האיור הנוכחי מראה משלוח גורם גדילת osteogenic PEC עם פיגום PCL-TCP, הקבוצה שלנו גם העריכה ביצועים מובילים עם polyetherketoneketone (PEKKתא עצם) במחקר ארנב אחד עם יעילות דומה.

במחקר זה, העדר השוואה עם ספקים העריכו בעבר השני של rhBMP-2 ו נל-1 יכול לייצג הגבלה.

לסיכום, הנוהל שהוצג מספק הספק שימושי לשלוט שחרור של גורמי גדילה osteogenic עם תחומים הפרין כגון BMP-2 ו נל-1. האסטרטגיה תארה משלב יתרונות רבים: הוא אינו מוגבל ל BMP-2 ו החלים על גורמי גדילה אחרים עם תחומי מחייב הפרין כגון נל-1. הפחתת המינון על גורם הגדילה osteogenic יכול להפחית תופעות לוואי לא רצויות כגון seroma, היווצרות העצם heterotrophic ולהפחית את העלות הכוללת של הטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו ניגוד עניינים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane PALL  PN4612 Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration
24 well plate Cell Star  662160
96 well plate Nuclon Delta Surface Thermo Fisher Scientific 167008
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT Sigma Aldrich M5655 Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1
Acetone Fisher Scientific A/0600/17 Precipitate CF-405
Labeled protamine
Alamar Blue Invitrogen, Life Technologies DAL 1025 Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit Anaspec AS-72146
Ammonium Chloride Merck Art 1145 Stop reagent in FITC labeling
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Invitrogen, Life Technologies D12345 Solvent for fluorescent isothiocyanate I
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich Dissolve  formazan 
Autoclave Hirayama HU-110 Sterilize alginate beads by steam
Beta-glycerophosphate Sigma Aldrich G9422
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit)  Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA 7510800 Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA)  Thermo Fisher Scientific A-6222 To quantify NELL-1 protein
Cell Strainer (100 µm) BD Science 352360 Hold PEC for ALP assay
Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm SPL Life Science 90030 Detach the cell from 24 well plate
CF 405S, Succinimidyl Ester Sigma Aldrich SCJ4600013 Blue fluorescent dye for protamine labeling
CF 594, Hydrazide Sigma Aldrich SCJ4600031 Deep red fluorescent dye for heparin labeling
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Confocal Microscope Olympus  FV1000
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Component of osteogenic growth medium
Dextran Desalting Columns Pierce (Thermo Scientific)  43230
DMEM Gibco  12320
BMP-2 Quantikine ELISA Kit R&D System DBP200 Determine BMP-2 release
Fetal Bovine Serum FBS Hyclone SV30160.03
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I Sigma Aldrich F7250 Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling
ThinCert Cell Culture Inserts,
For 24 Well plates, Sterile		 Greiner  662630 Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) Havard Apparatus 70-2208
n-Hexane (>99%) Sigma Aldrich 139386
Heparin Sigma Aldrich H3149 Binds with osteogenic
growth factor with heparin binding domain
Hydrochloric acid (37%) Merck 100317 Highly Corrosive
Incubator Binder C8150
MicroBCA Protein Assay kit Thermoscientific 23235
Microplate Reader Tecan Infinite M200 For ALP and microBCA assays
Nisco cell encapsulator Nisco Engineering Inc Encapsulation unit VAR V1
Fluorescent Microscope Olympus IX71
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) Osteopore PCL-TCP 0/90 Hold PEC for in vivo study
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml Hyclone Cell Culture SV30010 Antibiotic
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) Vivantis PB0344-1L 10x Solution, Ultra Pure Grade
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 Sigma Aldrich P2568 Polycation
Protamine Sulfate salt, from Salmon Sigma Aldrich P4020 Polycation
Shaker Labnet S2025
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet Thermo Fisher Scientific 68035 Remove unreacted FITC by dialysis
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Sodium Hydroxide Qrec S5158
Sodium Bicarbonate US Biological S4000 Buffer
Sodium carbonate Sigma Aldrich S7795-500G Buffer
Strontium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich 255521 Crosslinker for alginate
Spatula 3dia
5 ml syringe Terumo 140425R Diameter of syringe affects the flow rate
75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck Corning 730720
Toluidine Blue Sigma Aldrich 52040 Heparin assay
Trypsin 1x Hyclone Cell Culture SH30042.01
Sodium alginate Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) Pronova UPMVG Core material of microbeads

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  6. Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
  7. Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
  8. Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
  9. Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
  10. Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
  11. Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
  12. Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
  13. Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).

Tags

Bioengineering גיליון 114 קומפלקס polyelectrolyte המוביל תחום מחייב הפרין protamine עצם morphogenic חלבון 2 (BMP-2) חלבון C-מחייב חלבון קינאז (נל-1)
קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wing Moon Lam, R., Abbah, S. A.,… More

Wing Moon Lam, R., Abbah, S. A., Ming, W., Naidu, M., Ng, F., Tao, H., Goh Cho Hong, J., Ting, K., Hee Kit, W. Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery. J. Vis. Exp. (114), e54202, doi:10.3791/54202 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter