Abstract
Tijdens reconstructieve bot chirurgie, zijn suprafysiologische hoeveelheden groeifactoren empirisch geladen op steigers voor een succesvolle fusie bot te promoten. Grote doses van zeer krachtige biologische agentia dienen door groeifactor instabiliteit als gevolg van de snelle enzymatische afbraak en carrier inefficiënte lokaliseren voldoende hoeveelheden groeifactor bij implantatie sites. Derhalve strategieën die de stabiliteit van groeifactoren verlengen zoals BMP-2 / NELL-1 en controle het vrijkomen kon eigenlijk hun lagere effectieve dosis en derhalve voor hogere doseringen minder nodig tijdens toekomstige botregeneratie operaties. Dit zal bijwerkingen en groeifactor verlagen. Zelf geassembleerde PEC's zijn vervaardigd om een betere controle van de BMP-2 / NELL-1 levering bieden via heparine bindend en verdere potentiëren groeifactor bioactiviteit door het versterken van in vivo stabiliteit. Hier illustreren we de eenvoud van PEC fabricage die helpt bij het delivery van diverse groeifactoren in bot reconstructieve chirurgie.
Introduction
De incidentie van pseudoartrose gerapporteerd wel 10 tot 45% degeneratieve spinale fusie en herziening spinale chirurgie 1 te zijn. De snelheid van pseudarthrose tijdens wervelkolomfusie en andere reconstructieve operaties bot, osteogene groeifactoren zoals BMP-2, Nell-1 1 en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) zijn ingevoerd om de novo osteogenese goede kan komen. Hiervan BMP-2 is een populaire keuze voor spinale fusie-2. Hoewel de potentie van BMP-2 bij het induceren en nieuwe botvorming vergemakkelijken is goed ingeburgerd 3; klinisch significante complicaties zoals heterotope botvorming, seroom en hematoomvorming, ontstekingsreactie, radiculitis, wervellichaam osteolyse en retrograde ejaculatie blijven punten van zorg vanwege de suprafysiologische gebruikshoeveelheid 4,5.
Daarom verlagen van de dosis van BMP-2 blijft een relevante strategie in tenverleidt om bijwerkingen te minimaliseren. Daarnaast worden efficiënte carrier-systemen die nodig is om de eerste burst release van BMP-2 waargenomen in de hedendaagse collageenspons draagsystemen te onderdrukken en de verdere langdurige en gelokaliseerde aflevering van deze potente cytokine verbeteren. De laag voor laag zelfassemblage van afwisselend kationische en anionische polyelektrolyten kunnen worden gebruikt als een afstembare methode opbouwen polyelektrolyt complexen op het oppervlak van scaffold matrices of implanteerbare materialen 6. In dit verband heeft heparine (bekend om de hoogste negatieve ladingsdichtheid van biologische agentia) zijn erkend gretig binden met verschillende groeifactoren via elektrostatische en heparine bindende domeinen. Inderdaad, heparine aangetoond dat de halfwaardetijd te verlengen en aldus potentiëren de bioactiviteit van verschillende groeifactoren.
Op basis hiervan onze groep aangepast een laag voor laag zelfassemblage protocol bij een heparine gebaseerde polyelektrolytcomplex (PEC) die fabriceren ladingen en behoudt de biologische activiteiten van osteogene groeifactoren tijdens immobilisatie 7,8. Het alginaat microbead kern werd vervaardigd door het verknopen α-L-guluronate (G) residuen van alginaat met tweewaardig kation calcium of strontium ionen. Het alginaat kern is een biologisch afbreekbare matrix scaffold; die na de implantatie, is het geresorbeerd in de fusie bed ruimte bieden voor bony ingroei. Poly-L-lysine (PLL) of protamine wordt gebruikt als de kationische laag naar interlace met zowel de steiger matrix (in dit geval het alginaat microkorrel dragerdeeljes) en de negatief geladen heparine; terwijl de anionische heparine laagfuncties te stabiliseren en te lokaliseren geladen groeifactoren. De drielaags PEC is aangetoond groeifactor laadvermogen in een varkensmodel 9 verhogen. Recent zijn PEC dragers is aangetoond dat de effectieve dosis van BMP-2 succesvol met tenminste 20-voudig 10 ratten, varkens modellen van spinale fusie-8.
ntent "> Hier melden wij de methoden voor het vervaardigen van PEC voor een betere groeifactor levering in spinale fusie en de andere reconstructieve chirurgie bot met behulp van BMP-2 als een model osteogene groeifactor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding alginaatoplossing
- Oplossen 200 mg natriumalginaat (onbestraalde) of 400 mg van 8 MRad bestraald natriumalginaat in 10 ml dubbel gedestilleerd water en schud gedurende 1 uur voor niet-uitgestraald alginaat en 15 min voor bestraalde alginaat. Bewaar de alginaatoplossing bij 4 ° C overnacht. Filter de alginaat-oplossing met een steriele 0,2 um spuitfilter voordat alginaat microbead fabricage.
2. Alginaat Microbead Fabrication
- Ontsmet de elektrostatische kraal generator en spuit pomp met 70% ethanol en leg ze in een klasse II bioveiligheidskast (figuur 1).
- Plaats een glazen bak met een magnetische roerstaaf in de kraal generator.
- Stel de arm elektrode van de kraal generator 9 cm boven de wastafel.
- Sluit de elektrodekabel van de kraal generator om de kartelschroef 2 van de arm elektrode, en giet 80 ml srcl 2 oplossing in debekken.
- Laad 5 ml van 0,2 urn gefiltreerde alginaatoplossing in de injectiespuit en rubber buis. Nadat de rubberen buis de arm elektrode, zet de inspuitpomp 5 ml / uur gedurende 2 min aan de lucht te verdrijven De slang en leveren de alginaatoplossing tot aan de punt van de spuitmond. Schakel de injectiepomp.
- Vervolgens schakelt de encapsulator en vervolgens de spuit pomp microbead generatie beginnen. Stel het alginaat debiet 5 ml / uur en de spanning op 5,8 kV op de encapsulator. Gooi de microkralen die tijdens de eerste twee minuten (of de eerste 0,5 ml alginaatoplossing uit de spuit gepompt), omdat deze de neiging microkralen onregelmatige grootte en vorm te zijn.
- Verzamel latere microkralen in 0,2 M strontiumchlorideoplossing. Schakel zowel de spuitpomp en encapsulator (in die volgorde) na het pompen van de vooraf geplande hoeveelheid alginaatoplossing. Herhaal dit voor de volgende partijen microbead fabricage. Na voltooiing, draai vanf de spuitpomp, gevolgd door de encapsulator.
- Bewaar de microkralen in 20 ml 0,2 M strontiumchlorideoplossing bij 4 ° C gedurende de nacht verknoping voltooien en stabilisering van de gel.
3. Grootte Meting van Alginate Microkralen
- Verzamel 0,5 ml alginaat microbolletjes met een plastic pipet en plaats het op een glasplaatje. Bekijk de microkralen onder een optische microscoop bij 10x vergroting. Neem tien beelden van de microbolletjes met een microscoop CCD camera. Sla de beelden met schaal bar (500 pm) in TIFF-formaat met een resolutie van 2.048 x 1.536.
- Met de lengte gereedschappen ImageJ, meten van de grootte van de microbolletjes en schaalbalk (figuur 2). Reken de microkralen lengte van pixel naar micrometer.
- Klik op de line tools en trek een lijn over het midden van het alginaat kraal.
- Klik op "Analyseren" op de menubalk en kies "Measure". Een pop-up venster zal verschijnen.
- Zetten de diameter van de alginaat kraag naar de werkelijke lengte met de formule: lengte van alginaat kraal / lengte van schaalbalk x 500 urn. Bijvoorbeeld, 1.420 (diameter gemeten met behulp van ImageJ) / 2.657 (schaal bar lengte gemeten door ImageJ) * 500 micrometer = 267 micrometer.
- Beschouw de gemiddelde grootte van 100 microparels (gemiddelde ± standaarddeviatie) als vertegenwoordiger omvang van elke partij microkralen.
4. Sterilisatie
- Verzamel de microbolletjes met behulp van een 100 um nylon zeef en spoel de kralen met dubbel gedestilleerd water.
- Met behulp van een spatel, dragen alle microkralen gemaakt van 0,1 ml alginaatoplossing in een 2 ml microcentrifugebuis en dek af met gaas uitdroogt.
- Tenslotte Steriliseer de microkralen autoclaaf behulp vloeistofmodus (115 ° C, 15 min) of overeenkomstig mproducent behoudt de specificaties. Voeg 1,5 liter gedestilleerd water naar de kamer om kralen uit uitdroging te voorkomen.
5. Protamine en Heparine Coating
- Binnen de BSL-2 kap Incubeer de steriele microkralen met 1 ml 2 mg / ml protamine oplossing (gesteriliseerd onder toepassing van een 0,2 urn spuitfilter) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Na incubatie van de microbolletjes gedurende 1 uur (Stap 5.1), het verzamelen van 150 ul van de protamine oplossing voor de micro bicinchoninezuur (microBCA) (deel 6).
- Was de protamine beklede microkralen tweemaal met dubbel gedestilleerd water. Spin down met een tafelmodel centrifuge bij 200 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, zuig het water met een injectiespuit.
- Incubeer protamine gecoate microkorrels met 1 ml 0,5 mg / ml heparine-oplossing (gesteriliseerd onder toepassing van een 0,2 urn spuitfilter) gedurende 30 min tot polyelektrolytcomplex maken (PEC).
- Na incuberen van de beklede microkralen protamine fof 30 min (stap 5.4), het verzamelen van 400 ul van de heparine-oplossing voor heparine inhoud (deel 7) te bepalen.
- Na incubatie, wassen de ongebonden heparine uit de PEC door tweemaal wassen met dubbel gedestilleerd water.
6. Protamine Content
- Voer de microBCA-test volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat, voeg 150 ul oplossing protamine (verzameld voor en na incubatie met microkorrels) in een plaat met 96 putjes. Voeg 150 ul microBCA werkende oplossing.
- Gebruik albumine-oplossing (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 en 200 ug / ml) als ijkstandaarden.
- Incubeer het mengsel gedurende 60 minuten bij 60 ° C. Meet de absorptie met een spectrofotometer bij 562 nm.
- Gebruik de standaardcurve protamine de concentratie van elk onbekend monster volgens instructies van de fabrikant bepaald.
- Bepaal het protamine inhoud van de microbolletjes door de totale hoeveelheid in het protaminebekledingsoplossing (vóór incubatie met microkorrels) vanaf de hoeveelheid protamine achterblijft in de bekledingsoplossing (na incubatie met microkorrels).
7. Heparine Content
- Bereid de 10 ml werkoplossing door het oplossen van 4 mg toluidine blauw en 20 mg natriumchloride in 0,01 N zoutzuur.
- Voeg 400 gl monster (uit stap 5.5) aan de werkoplossing in een verhouding van 2: 3 en vortex gedurende 30 seconden.
- Voeg 600 ul van n-hexaan (equivalent volume aan de werkzame reactie- oplossing) en vortex het mengsel om de toluidineblauw heparine complex te extraheren.
- Verzamelbak 200 pl van de waterige fase met een injectiespuit na fasescheiding.
- Meet de hoeveelheid un-geëxtraheerde toluidineblauw in de waterige fase met behulp van een spectrofotometer bij 631 nm.
- Bereid heparine standaardoplossingen van 0-20 ug / ml.
- Plot van de 631 nm lezing van elke heparine standaard versus heparine-concentratie in ug / ml. Gebruik de standaardcurve heparine concentratie van elk monster te bepalen.
8. Confocale Afbeelding van laag-voor-laag structuur
- Fabriceren protamine, heparine en NELL-1 / BMP-2 fluorescerende analoog CF-405 protamine (blauw), CF 594 heparine (rood) en FITC gelabeld NELL-1 / FITC gelabeld (groen) BMP-2 + héparine + protamine volgens de fabrikant technische fiche.
- Coat 100 g microkralen met 300 gl fluorescerende analoog (bekledingswerkwijze zoals beschreven in 5,3-5,6) CF-405 protamine (blauw) (2 mg / ml, 1 uur incubatie), CF 594 heparine (rood) (0,5 mg / ml, 30 min) en FITC gelabeld NELL-1 / FITC gelabeld (groen) BMP-2 (1,5 mg / ml, gedurende de nacht). Was de microkralen tweemaal met gedestilleerd water om het ongebonden fluorescerende protamine, heparine en NELL-1 / BMP-2 te elimineren.
- Observeer de laag-voor-laag structuur (figuur 3) met behulp van een confocale microscoop bij 10X vergroting. 7
9. BMP-2en NELL-1 Opname and Release
- Belasting 13,3 pl 1,5 mg / ml BMP-2 of NELL-1 oplossing 100 ug PEC. Incubeer PEC bij 4 ° C onder 30 rpm schudden gedurende 10 uur.
- Dompel de microkralen in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C onder constant schudden (30 rpm).
- Verzamel 1 ml van de supernatant en vervangen door 1 ml PBS na 1, 3, 6, 10 en 14 dagen.
- Evalueer de opname en laat efficiëntie van BMP-2 met de ELISA werkwijze volgens protocol van de fabrikant. Evalueer de opname en laat efficiëntie Nell-1 met de carboxybenzoyl- chinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) proteïne assay werkwijze volgens het protocol van de fabrikant.
- Bepaal cumulatieve afgifte op tijdstip (t):
Cumulatieve afgifte op tijdstip (t) = Laat op tijdstip (t) + Vorige afgifte op tijdstip (t-1). - Plot cumulatieve afgifte van BMP-2 en NELL-1 tegen de tijd.
10. In vitro bioactiviteitvan NELL-1
Opmerking: De bioactiviteit Nell-1 afgegeven uit PEC werd beoordeeld door het meten van het vermogen om de expressie van alkalische fosfatase (ALP) bij konijnen beenmergstamcellen (rBMSC) verhogen.
- Zaad 20.000 rBMSCs per putje in een 24-wells plaat en laat ze groeien één dag met 1 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 24 uur werd het medium vervangen door 1 ml van een osteogeen medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 2% penicilline streptomycine, 50 ug / ml ascorbinezuur, 10 mmol / l beta-glycerofosfaat en 10 -8 mol / L dexamethason ) gedurende 7 dagen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Plaats 300 ug PEC-NELL-1 (uit stap 8.2) en PEC binnen celkweek inserts (TC insert) om het PEC gescheiden van de cellen (dit vermijdt de uitspoeling van PEC microbolletjes tijdens de osteogene medium verandering) te houden. Plaats TC te voegen in de 24 goed platen 14 dagen.
- Eens in de drie dagen, zuig 1 ml van het osteogene medium door het plaatsen van een naald buiten de TC insert, en te vervangen door 1 ml vers osteogene medium.
- Na 7 en 14 dagen incubatie bepaald ALP activiteit met een ALP assay kit volgens het protocol van de kit fabrikant.
- Lyseren cellen met assay buffer die 0,1% Triton X-100 bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Schraap gehandeld cellen met behulp van een cel schraper. Incubeer celsuspensie bij 4 ° C onder roeren gedurende ten minste 60 min.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 2500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verzamel de bovenstaande vloeistof voor de bepaling ALP.
- Voeg 50 ul van serieel verdunde alkalische fosfatase standaardoplossing 200-0 ng / ml aan de putjes van een plaat met 96. De uiteindelijke hoeveelheid alkaline fosfatase norm 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 en 0 ng / putje.
- Voeg de supernatant van stap 10.5.2 (50 pl / putje) en verdun met verdunning bUffer.
- Voeg 50 ul van p-nitrofenylfosfaat (pNPP) substraatoplossing in elk putje. Meng de reagentia door voorzichtig schudden van de plaat gedurende 30 sec. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten in het donker. Meet de absorptie bij 405 nm door plaatlezer.
- Bereken ALP-activiteit met behulp van de ijklijn.
- Bepaal eiwitgehalte met de microBCA eiwit assay kit volgens de instructies van de fabrikant. Normaliseren van de ALP-activiteit door te delen ALP activiteit door het eiwitgehalte.
11. levensvatbaarheid van de cellen
- Incubeer 200 mg PEC-NELL-1 met 1 ml DMEM + 10% FBS bij 37 ° C gedurende 24 uur door 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay.
- Zaad 2000 rBMSCs per putje (in 100 ui DMEM met 10% FBS) in een plaat met 96 putjes en incubeer gedurende 1 dag bij 37 ° C, 5% CO2.
- Vervang DMEM + 10% FBS met 100 pl PEC-NELL-1 / PEC extract en incubeerbij 37 ° C, 5% CO2.
- Na 1 dag en 3 dagen incubatie, voeg 10 ul van 5 mg / ml MTT-oplossing en na incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 4 uur in het donker.
- Voeg 100 ul DMSO oplossing in elk putje om formazan kristallen op te lossen.
- Bepaal de absorptie bij 570 nm met een microplaat reader.
- Bereken het relatieve groeipercentage:
12. Verpakking in Steiger en BMP-2 & NELL-1 Loading
- Verpak de PEC in de poriën van een bioresorbeerbare medische kwaliteit polycaprolacton - tri-calciumfosfaat (MPCL-TCP) steiger met behulp van een gesteriliseerde spatel in een BSL-2 kamer.
- Voeg 1,5 mg / ml oplossing van BMP-2 of NELL-1 op de MPCL-TCP scaffold vol PEC en incubeer overnacht bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze carrier, protamine werd gekozen als vervanger van poly-L-lysine omdat het vergelijkbare chemische eigenschappen en het FDA als tegengif van heparine. Optische microscoop resultaten toonden aan dat de niet-bestraalde microbolletjes waren bolvormig met een diameter van 267 ± 14 urn. (0,35 mm nozzle, stroomsnelheid van 5 ml / uur en 5,8 kV). De meerderheid van de bestraalde microkralen of druppelvorm. De diameter gemeten op de ronde deel van de bestraalde microbolletjes was 212 ± 30 micrometer (0,35 mm nozzle, stroomsnelheid van 4 ml / uur en 6 kV). (Figuur 4).
Confocale beelden van de PEC microkralen onthullen layer-by-layer coating van CF-405 gelabelde protamine (blauw), CF594-gelabelde heparine (rood) en FITC-BMP-2 / FITC-NELL-1 (groen). De resultaten geven aan dat de PEC kan binden positief geladen BMP-2 en negatief geladen NELL-1 via de héparine binding domein (Figuur 5). Dit suggereert dat de interactie tussen de PEC en osteogene groeifactoren niet afhankelijk is opgeladen.
Om te bewijzen dat de PEC's kunnen opname en loslaten BMP-2, gebruikten we een ELISA om de hoeveelheid BMP-2 resteert na incuberen en de hoeveelheid BMP-2 in PBS op dag 1, 3, 6, 10 en 14 bepalen . echter, een vergelijkbare aanpak niet goed met de NELL-1 eiwit, omdat heparine blokkeert de antilichaam bindingsplaats, het signaal aanzienlijk te verminderen. Daarom werd het CBQCA eiwitbepaling gebruikt om het verschil tussen PEC-NELL-1 en PEC bepalen. Van de afgiftecurve cumulatieve, PEC niet alleen een hogere NELL 1-opname-efficiëntie vertonen in vergelijking met BMP-2 ook los veel trager dan BMP-2 (NELL-1: 20% vs. BMP-2: 25%) (Fig 6). Dit suggereert dat PEC binden strakker Nell-1 dan BMP-2.
FrOM de MTT assay PEC-NELL-1 is niet cytotoxisch (Figuur 7). Het resultaat komt overeen met de Alamar Blue assay resultaat in een eerdere studie 7. Heparine neutraliseert de positief geladen protamine die een belangrijke rol bij het handhaven van de biologische verenigbaarheid van PEC speelt.
Bepalen of NELL-1 afgifte van PEC invloed langdurige osteogene differentiatie, het expressieniveau van een osteogeen bewaker, alkalische fosfatase (ALP), werd onderzocht door een colorimetrische assay. NELL-1 afgifte van PEC verhoogt de ALP activiteit van konijn beenmergstamcellen met 2,2 maal op dag 14 in vergelijking met de PEC controlegroep (figuur 8). BMP-2 toont de maximale stijging van de ALP-activiteit (3,75 maal) op dag 7. Zowel PEC-BMP-2 en PEC-BMP-2 + extra BMP-2 tonen afname van de activiteit op dag 9.
ALP activiteit BMP-2 in het medium zonder PEC wordt in
Figuur 1: Elektrostatisch kraal generator en injectiepomp opgericht in BSL-2 bioveiligheid kast (A) Nozzle vastgezet op nozzle houder.. (B) groot bassin voor strontiumchlorideoplossing. (C) elektrode kabel. (D) Slang levert alginaatoplossing. (E) Nozzle houder en arm. (F) Elektroden supply tHij potentiaalverschil aan de korrelgrootte regelen. (G) Magneetroerder. (H) 5 ml spuit. (I) spuitpomp met alginaat stroming reguleren. (J) Agitator bedieningsknop naar roeren snelheid te controleren. (K) Voltage bedieningsknop naar het potentiaalverschil tussen 0-10 kV reguleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het meten van alginaat microbolletjes met ImageJ software Na het openen van het image-bestand door te klikken op Bestand → Open, volgt Stap 1:. Op de regel gereedschap en trek een lijn op de alginaat microbolletjes. In Stap 2, klik analyseren op de menubalk en een pop-up venster zal verschijnen. Herhaal stap 1 en 2 totdat alle microbolletjes zijn meadoeld orgaan. In stap 3, klikt u op de line tool, trek een lijn over de omvang bar en meet de lengte van de schaal bar. Omzetten van de microbolletjes lengte urn met behulp van de formule:. Lengte van de alginaat / lengte van de schaal bar x 500 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Schematische weergave van polyelektrolytcomplex Alginaat kern (donkergroen) positieve lading protamine laag (lichtgroen), negatieve lading heparine laag (rood), osteogene groeifactor, bijvoorbeeld BMP-2 / NELL-1 op buitenste laag (pale blauw). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Bright gebied beelden van alginaat microbolletjes (A) Niet-bestraald. (B) 8M Rad bestraald. Niet-bestraalde alginaat microbolletjes zijn sferische en de 8M Rad bestraald tegenhanger is traanvormige. Vergroting 100X. (Schaal bar = 500 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Confocale laser scanning microscopie beelden alginaat microkralen geïncubeerd met fluorescente analogen van protamine, heparine Nell-1 en BMP-2 (A) CF 405 Protamine (blauw), (B) CF 594 heparine (rood), (C ) FITC NELL-1 (groen), en (D Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Opname en afgifte van BMP-2 en NELL-1 (A) Opname Nell-1 eiwit (zwart) BMP-2 (rood), (B) afgiftecurve van BMP-2 (rood) en NELL- Cumulatieve 1 (zwart) van PEC carrier. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
<br /> Figuur 7:. cytotoxiciteit assay (A) MTT-bepaling van konijn beenmerg stengels cel met protamine gebaseerd PEC NELL-1 200 mg / ml extract (zwart), PEC-NELL-1 100 mg / ml extract (wit) op dag 1 en 3. (B) Alamar Blue-assay van konijn beenmerg stengels cel met PEC BMP-2 (blauw), PEC (groen) De experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Figuur 8: bioactiviteit Assay voor BMP-2 en NELL-1 vrijlating uit PEC carrier (A) ALP activiteit van konijn beenmerg stamcel geïncubeerd met PEC-NELL-1 (zwart), PEC (rood).. ALP-activiteit werd gemeten als absorptie bij 405 nm. 2.2voudige toename van ALP-activiteit werd waargenomen na incubatie met PEC-NELL-1 op dag 14 (B) ALP activiteit van konijn beenmergstamcellen geïncubeerd met PEC-BMP-2 (rood) PEC-BMP-2 + toevoeging van BMP 2 (groen) en PEC (blauw). Toename ALP activiteit na incubatie met PEC-BMP-2 en BMP-PEC-2 + toevoeging van BMP-2 op dag 7, ALP activiteit druppels op dag 9 (C) ALP activiteit van konijn beenmergstamcellen geïncubeerd met PEC- BMP-2 (rood) BMP-2 (blauw) en Medium (groen). De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: polycaprolacton tri-calciumfosfaat (PCL-TCP) scaffold gepakt met PEC carrier (A) Polycaprola.ctone tricalciumfosfaat (PCL-TCP) scaffold (poriegrootte 1300 pm) gevuld met PEC carrier. (B) PCL-TCP schavot. (C) Hoge vergroting: PEC behoudt zijn vorm na het verpakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol geeft een werkwijze voor de bereiding van PEC door laag voor laag zelfassemblage. De laag-voor-laag structuur gevisualiseerd met behulp van fluorescente analogen van protamine, heparine, BMP-2 en NELL-1 en confocale microscopie. Opname en release tests tonen aan dat heparine op PEC medieert osteogene groeifactor opname en afgifte. De opname efficiëntie van de PEC methode is: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. De PEC drager een betere modulatie Nell-1 (20%) afgifte met een zuiver oppervlakteadsorptie drager zoals calcium apatiet deeltjes (40-80%) 11.
Naast de modulerende release, heparine neutraliseert het buitensporige positieve lading van polykationen zoals protamine om ongewenste cytotoxiciteit gerelateerde onderwerpen 12 te vermijden. PEC geen tekenen van cytotoxiciteit vertonen, zoals bepaald met de MTT-bepaling en de Alamar Blue-assay 7. De ALP-test toont de PEC vervoerder kan de Bioact behoudentiviteit van zowel NELL-1 en BMP-2. Hoewel ontwikkeld voor osteogene groeifactor BMP-2 therapie bij spinale fusie chirurgie, kan PEC ook tot andere groeifactoren met heparine bindende domeinen zoals NELL-1 en PDGF-BB. In vergelijking met andere methoden leveren zoals inkapseling van groeifactoren in polyglycolzuur microsferen, hebben PEC geen organische oplosmiddelen die vaak inactiveren groeifactoren 13 vereisen.
Een aantal factoren in de PEC fabricage procedure kan carrier prestaties beïnvloeden. Ten eerste, microbead grootte van invloed op de oppervlakte / volume ratio. Hogere osteogene groeifactor belasting kan worden bereikt met kleinere microbolletjes. Ten tweede moet de concentratie alginaat voldoende is om de stabiliteit van de microbead structuur handhaven. Microbead stabiliteit hangt af van het type alginaat, ketenlengte (beïnvloed door gamma bestraling) en de divalente ion gebruikt (barium> strontium> calcium). Terwijl 2% alginaatoplossing volstaat de fabrire PEC met stabiele microbead structuren wordt 4% alginaat vereist na 8 MRad gammastraling ter compensatie van de gevolgen van alginaat Ketenverkorting tijdens bestraling. Ten derde wordt de snelheid van in vivo afbraak van alginaat microparels sterk beïnvloed door alginaat ketenlengte. Op basis van onze ervaring van de rat en varkens modellen, PEC vervaardigd met behulp van 8 MRad bestraald alginaat toont een snelle (28 dagen) en de volledige afbraak van de alginaat kern (ongepubliceerde gegevens). Afbraak van de alginaat kern biedt ruimte essentieel voor bony ingroei. Ten vierde kan de overnacht incubatie van BMP-2 en NELL-1 bij 4 ° C onder constant schudden (bv, 30 rpm) opname-efficiëntie verbeteren. Tenslotte het protamine laagdikte tijdsafhankelijk. Aangezien de omvang van de protamine-heparine interactie bepaalt de afgifte van osteogene groeifactoren zoals BMP-2 of NELL-1, wordt 1 h incuberen protamine genomen om de stabiliteit van de PEC structuur verbeteren.
in vivo bioactiviteit. Gezien de zeer beperkte hoeveelheid heparine betrokken en in combinatie met de keuze van het tegengif, dwz protamine (een zeer effectief geneesmiddel te neutraliseren anticoagulerende activiteiten van heparine), verlengde bloeden tijd Ontdopt bot overwegend theoretisch en praktisch onbelangrijk.
Het laden van de PEC in de PCL-TCP steiger verbetert de lokalisatie van kralen aan implantaat sites. Steigers voorzien noodzakelijke mechanische ondersteuning die cruciaal is voor de rug fusie. In deze studies gebruikten we PCL-TCP scaffolds met 1300 urn poriën juiste verpakking (figuur 9) te vergemakkelijken. Hoewel de huidige afbeelding toont PEC osteogene groeifactor levering met de PCL-TCP steiger, heeft onze fractie ook geëvalueerd carrier prestaties met een polyetherketonketon (PEKK) Botkamer in een konijn studie met een vergelijkbare werkzaamheid.
In deze studie, zou het gebrek aan vergeleken met andere eerder beoordeelde dragers van rhBMP-2 en NELL-1 beperking vormen.
Concluderend, de voorgestelde procedure een bruikbare drager afgifte van osteogene groeifactoren bedienen met heparine domeinen zoals BMP-2 en NELL-1. De beschreven strategie combineert veel voordelen: het is niet beperkt tot BMP-2 en voor andere groeifactoren met heparine bindende domeinen zoals NELL-1. Dosisverlaging op osteogene groeifactor kan ongewenste neveneffecten zoals seroom, heterotrofe botvorming te verminderen en de totale kosten van de behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen belangenconflict.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
