Summary
Vi demonstrerer en kan lagres, transportabelt lipiddobbeltlag dannelse system. En lipiddobbeltlagsmembranen kan dannes inden for 1 time med over 80% succesrate når en frossen membran precursor er bragt til omgivelsestemperatur. Dette system vil reducere besværlige processer og ekspertise, der er forbundet med ionkanaler.
Abstract
En kunstig lipiddobbeltlag eller sorte lipidmembranen (BLM), er et stærkt værktøj til at studere ionkanaler og protein-interaktioner, samt til biosensoranvendelser. Men konventionelle BLM dannelse teknikker har flere ulemper og de ofte kræver særlig ekspertise og arbejdskrævende processer. Især lider konventionelle BLMs fra lave dannelse succesrate og inkonsekvent dannelse membran tid. Her demonstrerer vi en oplagres og transportabelt BLM dannelse systemet med styret udtynding-out tid og forbedret BLM dannelse sats ved at erstatte konventionelt anvendte film (polytetrafluorethylen, polyoxymethylen, polystyren) til polydimethylsiloxan (PDMS). I dette forsøg er en porøs struktureret polymer, såsom PDMS tynd film anvendes. Derudover, i modsætning til konventionelt anvendte opløsningsmidler med lav viskositet, anvendelse af squalen tilladt en styret udtynding-ud via langsom absorption opløsningsmiddel ved PDMS, forlænger membran levetid. I annoncenbetingelse, ved anvendelse af en blanding af squalen og hexadecan, frysepunktet af lipidopløsning blev forøget (~ 16 ° C), blev desuden fremstillet membran forstadier, der kan ubestemt tid opbevares og let transporteres. Disse membran forstadier har reduceret BLM dannelse tid <1 time og opnåede en BLM dannelse på ~ 80%. Endvidere ionkanal-eksperimenter med gramicidin A demonstrerede gennemførligheden af membransystemet.
Introduction
Kunstig lipiddobbeltlagsmembran, eller sort lipidmembranen (BLM), er et vigtigt redskab til at belyse mekanismerne i cellemembraner og ionkanaler, samt for at forstå samspillet mellem ionkanaler og ioner / molekyler. 1-7 Skønt patch-clamp-metoden er ofte betragtes som den gyldne standard for cellemembran undersøgelser, det er besværligt og kræver dygtige operatører for ionkanal-målinger. 8. Mens kunstigt rekonstituerede lipiddobbeltlagsmembraner er dukket op som alternative værktøjer til ionkanal-studier, 9,10 de er også forbundet med besværlige processer og særlig ekspertise. Desuden membraner er modtagelige for mekaniske forstyrrelser. Derfor har lipiddobbeltlag teknologier, der indføres til dato begrænsede praktiske anvendelser. 11
For at øge robustheden og levetiden af lipiddobbeltlagsmembraner, Costello et al. 12, og Ide og Yanagida
Udviklingen af et lipiddobbeltlag platform har primært drejet sig stigende robusthed og levetiden af BLMs. Selv levetiden af BLMs har været substantially forbedret nylig har deres ansøgninger været begrænset på grund af mangel på transporterbart og lagerholdbarhed. For at overvinde disse problemer, Jeon et al. Skabt et lagres membransystem og introducerede en membran forløber (MP). 16 at konstruere et parlamentsmedlem, de forberedt en blanding af n-dekan og hexadecan indeholder 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn-glycero-3-phosphatidylcholin) til styring af frysepunkt lipidopløsning sådanne, at det fryser ved ~ 14 ° C (under stuetemperatur, over typiske køleskabstemperatur). I dette forsøg blev MP spredt over en lille åbning på en polytetrafluorethylen (PTFE) film og efterfølgende frosset i et køleskab ved 4 ° C. Når MP blev bragt til stuetemperatur, MP optøet og et lipiddobbeltlag blev automatisk dannet, hvilket eliminerer ekspertise typisk er forbundet med dannelse membran. Men succesraten for BLM lavet fra MP var så lav som ~ 27%, og membran GERn gang var inkonsekvent (30 min til 24 timer), hvilket begrænser den praktiske anvendelse.
I denne undersøgelse er en polydimethylsiloxan (PDMS) tynd film anvendes i stedet for en konventionel hydrofobe tynde film (PTFE, polyoxymethylen, polystyren) til (a) kontrol fabrikation tid og (b) øge succesraten af BLM dannelse som tidligere rapporteret af Ryu et al. 17. Heri dannelse membran blev lettet ved ekstraktion af opløsningsmidler på grund af den porøse beskaffenhed af PDMS, og den tid, der kræves til dannelse membran blev med held styret ved denne undersøgelse. I dette system, som det lipidopløsning blev absorberet i PDMS tynd film, blev en konsistent membrandannelse tid opnået. Desuden blev membran levetid forlænget på grund af langsom absorption af opløsningsmidler i PDMS tyndfilm, et resultat af tilsætning af squalen til lipid løsning. Vi har udført optiske og elektriske målinger for at kontrollere, at membraner dannet ved anvendelse af denne teknik er egnet til ipå kanaler studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsning
- Fremstilling af pufferopløsning:
- Til formulering pufferopløsning, opløses 1 M KCl (kaliumchlorid), 10 mM Tris-HCI (Tris-hydrochlorid), og 1 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) i destilleret vand og justere pH til 8,0.
- Opløsningen filtreres under anvendelse af et 0,20 um filter. At sterilisere, autoklaveres opløsningen ved 121 ° C i 15 min.
- Fremstilling af lipidopløsning for pre-maleri:
- At formulere lipidopløsning for pre-maleri, opløses 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl--sn-glycero-3-phosphatidylcholin) lipid (vægt: vol) i en blanding af 2: 8 n -decan og hexadecan (vol: v). Omrør natten over under anvendelse af en rotator.
- Fremstilling af lipid, opløsning membrandannelse:
- At formulere lipidopløsning til dannelse membran, opløses 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl--sn-glycero-3-phosphatidylcholin) lipid (vægt: vol) i en blanding af 2: 8 squalene og hexadecan (v: v). Omrør natten over under anvendelse af en rotator.
2. Dannelse af en PDMS Thin Film
- Bland PDMS og hærder i en 9: 1 (vægt / vægt) forhold i en blandekop til dannelse af PDMS præpolymeren. Tilsættes 5 g PDMS præpolymer til en petriskål til dannelse af PDMS tynd film (tykkelse 200 - 250 um). Spred PDMS pre-polymer under anvendelse af en spin-coater ved 800 rpm i 10 sek for at danne en tynd film.
- Anbring petriskålen i et vakuumtørreskab ved et tryk på 100 mTorr i 2 timer for at fjerne luftbobler. At polymerisere præpolymeren tynd film, bages i en ovn i 5 timer ved 70 ° C.
- For at gøre et kvadrat PDMS tyndfilm, skære polymeriserede PDMS tynd film i 2 x 2 cm 2 firkanter. Brug en 500 um mikro punch til lave en åbning i centrum af PDMS tyndfilm. Pre-maling åbninger med 3% DPhPC lipid løsning blandet i 2: 8 n- dekan og hexadecan.
3. Chamber Fabrikation og Assembly
- At fremstille BLM kammer, design to symmetriske blokke af kammeret ved hjælp af 3D tegning software med ydre dimensioner på 4 cm x 1,5 cm x 1 cm og indvendige brønde dimensioner 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
- Craft kammeret under anvendelse af en PTFE-blok med en CNC-maskine og følge producentens anvisninger.
4. Chamber Assembly
- For at samle kammeret, anbringes præ-malede-PDMS tynd film mellem de to PTFE blokke, således at åbningen på PDMS tyndfilm flugter med hullet i kammeret.
- Forsegl de ydre kanter af kammeret ved hjælp af et dækglas med fedt (lette optisk observation). Immobilisere samlet kammer hjælp møtrikker og bolte.
BEMÆRK: Sørg for, at kammeret er godt forseglet, så der er ingen væske lækage.
5. Dannelse af Membrane Precursor med Expedited Selvsamling Formation (maksimalt tilladelige fejl)
- Ved hjælp af en pipette, deponere 0,5pi 0,1% DPhPC lipid blandet i 2: 8 n -decan: hexadecan på åbningen i PDMS tyndfilm samlet med kammeret.
- Inden anvendelse opbevares kammeret i en fryser eller et køleskab under 10 ° C.
6. Membran Dannelse og Verifikation
- Til dannelse af en BLM med maksimale tilladelige fejl, trække kammeret ud af køleskabet og suspendere 2 ml bufferopløsning i hver side af kammeret. Sæt kammeret afsat til <10 min, indtil den frosne membran forløber thaws.
- Placer kammeret på en mikromanipulator til præcist at kontrollere højden i forhold til lyskilden og mikroskopet. Belyse en side af kammeret som en lyskilde under anvendelse af en halogen fiberoptisk illuminator at lysne åbningen af PDMS tyndfilm til optisk observation af BLM dannelsesproces.
- På den anden side, placere en digital mikroskop lodret i forhold til lyskilden for at observere BLM formation (forstørre med 200X).
- At bekræfte BLM formation, observere midten af åbningen, hvor farven bliver lysere end det ringformede rum.
7. Elektrisk Optagelse
- For elektrisk måling, forberede Ag / CL elektroder under anvendelse af en 208 um tyk sølvtråd og blegemiddel i natriumhypochlorit i> 1 min. Placer Ag / CL elektroder i hver side af kammeret dybt nok til at dyppes i bufferopløsning.
- Elektroderne tilsluttes mikroelektrode forstærker. Under anvendelse elektrofysiologi software, anvende en ± 10 mV trekantet bølgeform over membranen til at erhverve en firkantbølge. Set anvende spænding ved at klikke på pilene angivet på V_clamp (mV).
- Optag de elektriske egenskaber af membranen ved at klikke på optageknappen (rød prik ikon). Fortsæt med optagelsen, indtil der ses en ensartet firkantet bølge. Afslut optagelsen ved at klikke på firkantede ikon sort.
8. Ion Channel Indbygning
IKKEE: gramicidin A (GA) inkorporering sker spontant ved dannelse af BLM, som gA tilsættes direkte til lipidopløsningen.
- At observere GA kanal aktiviteter, anvende 100 mV over membranen på en stikprøve på 5 kHz til at måle holde potentiale af membranen. Set anvende spænding ved at klikke på pilene angivet på V_clamp (mV).
- Optag de elektriske egenskaber af GA inkorporering ved at klikke på optageknappen (rød prik ikon). Fortsæt optagelsen, indtil de aktuelle spring overholdes. Afslut optagelsen ved at klikke på firkantede ikon sort.
- Efter elektrisk dataopsamling, filtrere data med en low-pass Bessel-filter ved 100 Hz ved hjælp af en elektrofysiologi software.
- Overhold de aktuelle spring i den filtrerede holde potentielle data (hver aktuel hop, ~ 0,15 ns, repræsenterer dimerisering af en gA ion kanal) for at verificere gA inkorporering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimering af maksimalt tilladelige fejl Solution Sammensætning
Forskellige sammensætninger af lipider og opløsningsmidler blev testet med succes rekonstituere lipiddobbeltlagsmembraner fra maksimalt tilladelige fejl. MP-system med en blanding af N- decan og hexadecan indeholdende 3% DPhPC 14 udviste en lav succesrate for dannelse membran (~ 27%). Hertil kommer, som PDMS filmen kontinuerligt ekstraheret lipidopløsning, var det nødvendigt at optimere sammensætningen opløsningsmiddel for at opretholde en intakt lipiddobbeltlagsmembran. Derfor squalen, som har en viskositet på 12 cP ved 20 ° C 18 blev anvendt i stedet for N- decan, som har en viskositet på 0,92 cP ved 20 ° C. 19 Når anvendtes squalen, både stabilitet og holdbarhed forøges på grund af en formindsket hastighed af opløsningsmiddel absorption af PDMS. tabel 1 sammenligner udtynding-ud, levetid og succesrate på membraner med forskellige opløsningsmidler sammensætninger.
Når anvendtes n- decan, membrandannelse var inkonsekvent og membraner ofte bristede inden for en kort periode, på grund af hurtig absorption af opløsningsmiddel ved PDMS tynde film. På den anden side, når squalen blev anvendt, blev tid til membran brud forsinket. Desuden membrandannelse tid blev mere konsekvent, succesrate på membran-dannelse forbedret, og levetiden af membraner forøges.
Membran Dannelse fra Membrane precursor (MP)
En MP er den frosne form af lipidopløsning, der bliver umiddelbart kan anvendes ved optøning ved stuetemperatur. Lipidet opløsning indeholdende en blanding af N- decan og hexadecan i en lille åbning i en PDMS tynd film fryser til under 16 ° C, og er uendeligt kan oplagres og transporteres i frossen tilstand. Figur 1 illustrerer samlingen af en PDMS tynd film med en PTFE chamber at producere en MP. Før brug blev PTFE kammer trukket fra køleskabet til dannelse membran. Heri blev de PDMS tynd film, der indeholder den frosne lipid løsning placeret mellem to halvdele af PTFE kamre. Når pufferopløsning blev efterfølgende tilsat til begge side af kammeret ved stuetemperatur, lipiddobbeltlagsmembranen dannet spontant ved optøning af den frosne membran precursor (MP).
Ved optøning, lipidopløsningen tyndet ud som beskrevet i figur 2. Når den frosne membran precursor optøet blev to monolag langs grænsefladerne mellem buffer og lipidopløsning bringes i kontakt. 20 Efter dannelse af membranen, GA monomerer, der var forblandet i lipidet viste løsning kanal aktiviteter.
Optisk Observation af membraner
For at optisk verificere membrandannelse, vibrugte transmitteret lys at visualisere membranen. Ved dannelse membran, membranen syntes lysere end omgivelserne på grund af udtynding-ud-processen, og centrum af åbningen (placeringen af dannelse membran) var lysere end det ringformede rum. Figur 3 viser dannelsen membran observeret via digital mikroskopi. Membranen held tyndet ud ved optøning.
Elektrisk Måling af et lipiddobbeltlag
Vi målte elektriske strømme over membranen ved anvendelse af en forstærker til at beregne membrantykkelse. Ag / AgCl elektroder blev nedsænket i begge kamre til elektrisk måling. Når 10 mV peak-to-peak trekant bølge blev påført over membranen, blev trekantbølgen konverteret til en firkantet bølge af strøm på grund af det karakteristiske for lipiddobbeltlagsmembranen (der virker som en kondensator). 21 Som følge heraf var vi stand til at vurdere tykkelsen af membranenved hjælp af følgende ligning:
hvor I (t) repræsenterer elektrisk strøm og C repræsenterer kapacitansen over membranen. V repræsenterer den påførte spids-til-spids spænding (20 mV for 0,0625 sek). Heri, kan C udtrykkes med, permittiviteten af ledig plads (8,85 x 10 12 F / m 2),, dielektricitetskonstanten af lipider (2,1), 22 A, området af membranen (~ 1,29 x 10 -7 m 2), og d er tykkelsen af dobbeltlaget. Med de optiske data i figur 3 og elektriske data, vi beregnet tykkelsen af membranen for at være ~ 4 nm. Derudover rekonstituerede membran opfyldt en giga-ohm plan tætning (> 1 GQ), som typisk kræves for ionkanal-studier. 23
Ion Channel aktiviteter gramicidin A (GA)
For at verificere muligheden for ion-kanal screening med lipid dobbeltlag dannet fra MP, vi indarbejdet gA, en af de mest anvendte ionkanaler til kontrol dannelse membran. Gramicidin A indarbejder i membranen som to adskilte underenheder, der efterfølgende dimerisere. 7 Ion kanaler form efter dimerisering af gA, og ioner trænge igennem gA ion-kanal. Figur 4 illustrerer inkorporering og dimerisering af GA. Ved gA dimerisering, Ga kanal konduktans niveauer var 28 pS, i overensstemmelse med resultaterne af tidligere rapporter. 3
| lipidkoncentration | opløsningsmiddel | Udtynding-out tid (min) | Levetid (min) | Succesrate |
| 0,1% | 2: 8 squalen: hexadecan | 50,6 (± 30,9) | 52,4 (± 30,9) | 77,8% |
| 0,1% | 2: 8 n -decan: hexadecan | 13.2 (± 12,3) | 10,8 (± 7,8) | 75,2% |
| 1% | 2: 8 n -decan: hexadecan | 15,8 (± 8,8) | 26,2 (± 25,3) | 69,3% |
| 1% | 2: 8 n -decan: hexadecan | 13.8 (± 13,3) | 23,6 (± 30,1) | 55,6% |
| 1% | 2: 8 n -decan: hexadecan | 13,6 (± 10,3) | 8,9 (± 3,0) | 50,0% |
Tabel 1. Optimering af maksimalt tilladelige fejl opløsning sammensætning. 0,5 pi lipidopløsning blev suspenderet på en PDMS tyndfilms åbning (500 um diameter). Her har vi varieret lipid koncentration, sammensætning af opløsningsmiddel, og præ-maleri. 17. Tilpasset med tilladelse fra Ryu, H. et al. 7
Figur 1. Skematisk diagram af dannelse membransystem. Den ydre dimension af hver halvdele af kammeret var 4 cm x 1,5 cm x 1 cm, og størrelsen af den indre brønd var 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm. Den indre brønd var stort nok til at rumme 2 ml bufferopløsning. På hver PTFE-blok der var huller til at have de PDMS tyndfilm kontakt med bufferopløsning. Den anden side blev forseglet med et dækglas til optisk observation af BLM. Endelig blev kammeret blokke forstærket med bolte og møtrikker for at undgå væskelækage.4258 / 54258fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk diagram af Frozen Membrane Precursor med Expedited Selvsamling (maksimalt tilladelige fejl) dannelse. Lipid løsning på PDMS tynd-film blænde kan fryses på ubestemt tid. Når den frosne membran precursoren blev bragt ind stuetemperatur til optøning, er lipiddobbeltlag dannelse lettes på grund af ekstraktion af hydrofobt opløsningsmiddel i PDMS tyndfilm. Som GA monomerer var direkte tilføjet i lipid løsning, Ga ionkanaler dannet umiddelbart efter dannelsen membran. Klik her for at se en større version af dette tal.
= "/ Files / ftp_upload / 54.258 / 54258fig3.jpg" />
Figur 3. Mikroskopisk diagram af udtynding-ud-processen. Efter optøning af maksimalt tilladelige fejl og efterfølgende absorption af hydrofobe opløsningsmidler blev udtynding-ud-processen lettes af blænden af PDMS tyndfilm, og membranen blev dannet inden for to minutter efter optøning. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Elektriske målinger upon inkorporering af gramicidin A. Aktuelle hopper på inkorporering og dimerisering af gA i membranen er vist. En amplitude på ~ 28 pS blev observeret efter dimerisering af GA monomerer (100 mV holdepotentiale; 100 Hz Bessel lavpasfilter).rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J.
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J.
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , Merck & Co. (1976).
- Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer Science & Business Media. (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
