Introduction
非球形（和其他）纳米颗粒形态的合成历来使用开始具有良好定义的两亲二嵌段（或嵌段）共聚物的合成和纯化的多步自组装过程完成。其中最常见的自组装技术是由Eisenberg的在20世纪90年代普及并涉及两亲性嵌段共聚物在普通溶剂为两种聚合物嵌段，随后缓慢加入溶剂选择性为块1〜3之一的溶解。作为添加的选择性溶剂（通常为水）中，嵌段共聚物经受自组装以形成聚合物纳米颗粒。最终形态（或形态的混合物）的纳米粒子是由大量的因素，例如各聚合物嵌段，加水的速度与共用的溶剂的性质的相对长度来确定。然而，这种方法一般只允许生产nanopar的ticles在相对 低的固体含量（小于1重量％），因此限制了它的实际的可扩展性4。此外，“中间”相，例如蠕虫状胶束可再现形成可以由于窄的范围的，以稳定这种非球形形态5所需的参数是困难的。
聚合诱导的自组装（PISA）的方法通过利用聚合过程本身来驱动的自组装的原位允许纳米颗粒合成在高得多的固体含量部分地解决了上述艾森伯格方法的缺点（通常为10-30重量％）6 -8。在一个典型的PISA方法中，活性聚合过程用于链延伸的溶剂可溶的大分子引发剂（或宏CTA）与单体是在反应介质中最初可溶，但形成不溶性聚合物。 PISA的方法已被用于通过系统性测试数前的合成蠕虫状胶束 perimental参数，并使用详细的相图作为合成“路线图”5,9。
尽管他们的具有挑战性的合成，存在蠕虫状纳米颗粒由于它们相对于它们的球形同行有趣的性质极大的兴趣。例如，我们已经证明，使用PISA方法合成的装载药物短期和长期的蠕虫状胶束具有体外细胞毒性显著更高相比球状胶束或囊泡10。他人在体内模型11中所示的纳米粒子的纵横比和血液循环时间之间的相关性。其他人已经表明蠕虫状纳米粒子的使用适当的PISA方法合成产生一个宏观凝胶由于纳米颗粒长丝的纳米级纠缠。这些凝胶表现出作为由于其热可逆溶胶-凝胶行为12灭菌凝胶的潜力。
内容】“>该协议描述了在聚合过程中简单地观察该溶液的粘度允许原位监测蠕虫状胶束的形成的方法。相似的蠕虫状胶束凝胶的先前的研究已经表明，高于临界温度时，这些纳米颗粒经受可逆蜗杆球面过渡，因此形成在高温下自由流动的分散体。迄今为止，这些系统已经利用一个热敏感偶氮化合物以引发受控聚合13,14等凝胶化可能不容易在这些系统中观察到热聚合。从这些研究中，有人推测在较低温度下合成PISA衍生的纳米颗粒可允许原位这种凝胶行为观察。最近我们报道了用一个浅显的室温光聚合技术来调解PISA过程中产生的纳米粒子不同形貌15。这里，可视化协议是由在聚合过程中观察溶液的粘度行为呈现为蠕虫状胶束的再生合成。该分散体聚合反应的进行很容易地利用市售的发光二极管（LED）（λ= 460纳米，0.7毫瓦/厘米2）。
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Protocol
1.合成与POEGMA表征宏观CTA
- 添加低聚（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯（OEGMA）（12克，4×10 -2摩尔），4-氰基-4-（phenylcarbonothioylthio）戊酸（CPADB）（0.224克，8×10 -4摩尔）， 2,2'-偶氮二（2-甲基丙腈）（AIBN）（16.4毫克，0.1毫摩尔）和50毫升乙腈（MeCN中）到100毫升圆底烧瓶中。
- 密封该烧瓶用适当大小的橡胶隔片和钢丝和从室温烧瓶冷却到<4℃在冰 - 水浴中。
- 通过用第二21g的针（1.3毫米×38毫米）作为通气口直接鼓泡入氮气通过21g的针（1.3毫米×120毫米），将反应混合物脱氧30分钟烧瓶中。
- 在冰 - 水浴浸入淬火聚合和内容暴露于空气之前放置在油浴中的烧瓶中在70℃下5.5小时。
- 通过在AC搅拌取出乙腈在〜40毫升四氢呋喃（THF）中的压缩空气和ontinuous流再溶解粗混合物。
- 烧瓶滴加的内容添加到400毫升石油烈酒快速搅拌混合物（沸点40-60℃）和乙醚（70:30，体积/体积），继续搅拌直至上清液不再混浊。
注意：在冰浴冷却可被用来加速沉淀过程。 - 倒出上清液并重新溶解在〜40毫升THF的聚合物残余物。
- 重复该沉淀过程（步骤1.5-1.7）至少两次以上，以确保完全除去残余OEGMA单体。从纯化POEGMA宏观CTA首先通过搅拌下被压缩的空气和干燥的连续流在真空烘箱（20℃，10毫巴）4小时除去过量的溶剂。
- 使用先前报道的方法确定由核磁共振的POEGMA宏-CTA（NMR）（Mn为，NMR）的数均分子量
注意：使用上述合成（步骤1.1-1.8）应该产生一个POEGMA宏观CTA采用M N，NMR = 9000和D <1.15。如果合成POEGMA宏观CTA的分子量（和分散度）从这里提出的合成不同（7,000之间-克/摩尔1,000），形成蠕虫状胶束（如原位胶凝所示）仍然会出现使用在稍微改变反应时间尽管在（第2节）提出后续PISA方法。
2. POEGMA-的制剂B -PBzMA使用纳米PISA
- 制备的Ru（联吡啶）3 Cl 2中。6H 2 O的乙醇（EtOH中）的1毫克/毫升储液。存放在冰箱原液以减少溶剂蒸发。
- 插入巴斯德吸管用脱脂棉小一叠第二吸管帮助紧紧包装。倾碱性氧化铝与棉塞移液器，得到大约5厘米的柱。由通过塔传递〜3毫升的BzMA的和收集deinhibited的BzMA洗脱液除去在商用的BzMA的单甲基醚氢醌抑制剂。
- 添加POEGMA macroCTA中（〜9000克/摩尔; 76.9毫克，8.5×10 -6摩尔），deinhibited BzMA的（0.301克，1.71×10-3摩尔），吡啶钌3 CL 2 6H 2 O（128微克， 1.71×10 -7摩尔，1毫克/毫升的乙醇原液128微升），0.383毫升MeCN中和1.402毫升乙醇（1.913毫升总溶剂，80重量％，20体积/体积％的MeCN）至4毫升的玻璃小瓶。
- 如步骤1.2-1.3所述执行脱氧过程。
- 放在一个2000毫升玻璃烧杯中的瓶（ 图2）内衬蓝色LED带（λ 最大 = 460纳米，0.7毫瓦/厘米2），并在室温下用磁力搅拌照射。监测反应小瓶后定期20小时，当在小瓶倒置（ 图3）的高粘度溶液形成自由站立凝胶从反应器中取出。
注意：总时间，以产生自由站立凝胶应为约24小时使用这里提出的条件的蓝色光照射的。在灯光的照射反应堆小的差异（物理尺寸，强度等 ）可能需要稍微改变条件（特别是反应时间），实现了原位形成蠕虫状胶束。 - 从反应器中取出后，通过将纳米颗粒的凝胶在空气中几分钟，直立存储封闭小瓶在黑暗猝灭聚合反应。
纳米形貌3.透射电子显微镜（TEM）影像
- 将约40毫克粗nanopa的在4毫升的玻璃小瓶rticle凝胶（从第2节）。
- 连续搅动使用涡旋混合器纳米粒子凝胶和加入4 7ml乙醇滴加历时至少5分钟。凝胶应成为溶剂加入过程中的自由流动的解决方案。
注意：如果该凝胶用EtOH稀释过快或不能充分搅拌，可能会发生纳米颗粒的一些沉淀。请参阅步骤3.3。 - 通过玻璃棉过滤去除稀释的纳米粒子的宏观聚集。
- 根据先前报道的方法进行稀释样品的TEM成像（醋酸铀染色）。15
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Representative Results
在这项研究中，两步聚合协议用 于使用PISA方法（ 图1）蠕虫状胶束的合成。在第一步骤中，进行OEGMA的聚合，得到一个POEGMA宏CTA其可以用作在随后的聚合步骤中的稳定剂。由于PBzMA的乙醇不溶性，最终导致纳米颗粒形成分散体的条件下将PET-RAFT聚合所得。在聚合过程中，最初透明反应混合物可以观察到成为按照分散聚合混浊，并最终转换到指示蠕虫状胶束的形成（ 图3）的高粘性的凝胶状状态。一个“活”聚合的迹象是明显的（ 图1A）具有低聚合物分散度（D <1.3）和分子瓦特之间的良好的相关性八单体转化率。此外，通过GPC迹线（ 图1B）指示与虽然有些高分子终止和低分子量拖尾在该系统中观察到不同的转换主要为单峰分布。重要的是，这些“死”的聚合物链不以足够的数量，以抑制纯蠕虫状胶束的形成。随转化率，分子量分布的偏移表明主要的形成POEGMA- 乙 -PBzMA嵌段共聚物与 链长的分布窄。
图2A示出在这个实验中，1米商用LED条（λ= 460纳米，4.8瓦/米）被内部2L烧杯卷绕使用的光反应器的设置。在我们的实验中，它也被确定具有相似蓝光强度（ 图1B）一个家庭灯泡也可以在PET-RAFT P为用于ISA的过程。
图4表明，蠕虫状胶束形态的形成也是不同的反应条件下实现的，例如可变小瓶类型和试剂组合物，而且，如果光源是在间歇方式施加。这意味着，尽管聚合速率在大多数光聚合系统的光穿透的效果强，在PET-RAFT PISA协议胶凝行为仍然可以用作蠕虫状胶束形成的可靠指标。这是一个重要的结果，因为通常易地 TEM成像需要提供蠕虫状胶束形成的证据。除了观察到的凝胶化行为，形成纯粹蠕虫状胶束的应通过观察纳米颗粒（> 100）的显著量的通过TEM的形态（用乙酸双氧铀染色）来确认。如果局部囊泡形态观察，照射时间应减少;相反，如果观察球形胶束然后照射时间应略有增加。
图合成使用PET-RAFT，起居光聚合技术，蠕虫状胶束1.反应方案。（以上）采用PISA的做法蠕虫状胶束的合成两步法。 （下）动力学研究证明，（A）的分子量和聚合物分散的PISA聚合过程中的演变和（B）的凝胶渗透色谱（GPC）的分子量分布的演变与转化。从文献改编15许可。版权所有（2015）美国化学学会。 请点击此处查看大versio这个数字的n个。
图2.不同的可见光反应器的数码照片 。 （ 一 ）在本研究中，蓝色内衬使用的反应堆的圆形LED灯条（λ 最大 = 460纳米，0.7毫瓦/ 平方厘米）。 （b）装有可也将在本协议中使用的5瓦灯泡一个家用灯具。 请点击此处查看该图的放大版本。
聚合前介导的PISA聚合。拍摄图像（A） 的PET-RAFT，（B）15小时后图3. 代表的数码照片S和24小时可见光照射后（℃）。在聚合过程中，最初透明的反应混合物变得混浊，并最终过渡到原位形成蠕虫状胶束的指示的一个独立的凝胶状态。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 B 使用PET-RAFT PISA的做法产生蠕虫状胶束形成-PBzMA嵌段共聚物。POEGMA- 4.表征和TEM图像使用不同的聚合条件下形成的蠕虫状胶束的TEM照片（和数码照片插入）。 （A）和（C）进行照射24小时，而（B）用10,000克/摩尔POEGMA宏CTA时所需的凝胶化之前39小时（总共开/关照射时间）。在每一种情况下，高粘度的凝胶形成是蠕虫状胶束的形成的特点。从文献改编15许可。版权所有（2015）美国化学学会。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这种可视化协议表明仅仅通过观察凝胶状行为的发作，监测蠕虫状胶束的形成的能力。这种方法的效用在于以监测，相较于其他的方法在聚合过程中蠕虫形成的能力。可使用两种市售的单体（OEGMA和BzMA的）的两阶段的聚合，得到的自组装POEGMA- b -PBzMA两亲嵌段共聚物来执行此过程。
这里应注意的是，具有不同的反应器几何形状，光强度等 ，相对于与图2的反应器可能需要稍微改变条件，得到蠕虫状胶束凝胶。由于钌基催化剂的吸收特性，聚合反应可只发生在根据蓝色可见光的合理速率。原则上，也可以使用具有不同的光吸收特性的其它催化剂。应注意，以不留在反应器中的蠕虫凝胶太长否则宏观析出物可能会开始形成。此发生是由于纳米颗粒试图重新组织成囊泡结构，而是由高粘性介质被抑制。在某些情况下，我们观察到通过TEM成像部分囊泡（水母或章鱼结构）的形成当聚合保持在反应器中以外的自由站立的凝胶状状态的第一观察。
为了增加这种技术的可访问性，在该协议报告的PET-RAFT PISA聚合反应无外温度调节（冷却风扇，水浴等 ）在室温下进行。聚合（低于5℃）的过程中附加地，低功率LED条不产生在小瓶的温度可观察到的增加而增加。虽然这是众所周知的是，聚合反应速率对温度的强依赖性，INH的蠕虫状胶束在50℃下聚合时以诱导甚至宏观凝胶状行为的能力ibition尚未观察。
获得短蠕虫状胶束（平均），也可以通过在反应介质已达到一个独立的状态，但在粘度显着增加之前除去光源。相比于自由站立的凝胶，这种方法可能是有利的，因为这些“软”凝胶（无沉淀），用于分析的稀释是显著容易。以类似的方式，球形胶束可以通过降低照射时间甚至进一步获得;典型地后混浊的聚合过程中的第一个开始。
原则上，一个范围内的不同solvophillic单体可以用来代替OEGMA（ 例如 ，聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯），聚（甲基丙烯酸）的聚合反应动力学和自组装参数但是一些优化将需要。宏CTA的均聚的高生命活力应以增加后续PISA聚合的效率来证明。然而，只要在聚合过程中作为存在足够纯蠕虫状胶束相，仍可发生凝胶化。所提出的方法的效用在于，不同长度的宏观CTA稳定剂可无需显著重新优化过程用于形成蠕虫状胶束被使用的事实。在这个协议中，POEGMA宏观CTA被然而使用热引发RAFT协议合成，我们还证明具有高链端保真度以生成POEGMA使用均匀的PET-RAFT协议16的能力。虽然到的BzMA结构类似的单体也已经报道以形成蠕虫状胶束凝胶17，它很可能是唯一的单体的数量有限的能够经受受控自由基分散体聚合一愕LD蠕虫状胶束显著胶凝性能。
虽然不同的反应器设置（包括反应小瓶几何）可能会导致在大多数光聚合系统中不同的聚合速率，能够直观地监测原位形成蠕虫状胶束使用PET-RAFT PISA的做法时，有助于克服这种限制。其结果是，聚合反应时间可以根据所实现的准确的反应器装置来改变。这是众所周知的，该蠕虫状胶束相可以是难以制造高纯度和收率，然而，在所提出的方法，我们能够以固体含量> 10％（重量），以产生蠕虫状颗粒。重要的是，这些颗粒的形成可以聚合，而不是以前的报告，由此蠕虫状胶束合成只能淬火聚合并进行易地 TEM成像后确认过程中被监测。
IMPORTAntly，可重复地产生在高固体含量，这些高纵横比的纳米颗粒的能力有若干特别是在生物领域的作为药物递送载体的应用具有重要意义。大量的研究已经证明，在生物环境中的非球形形态的有趣的行为如相比，他们的球形对口11或变化的细胞摄取行为10增加的血液循环时间。虽然这些颗粒在乙醇溶液中合成，我们先前已经证明了适当的透析条件下这些PISA纳米颗粒的形态可以在水溶液10被保留。这种方法的优点在于透析之前先封装乙醇分散条件下水溶性差的治疗剂到水中生物研究的能力。此外，它很可能是这些长形颗粒表现出不同的细胞摄取BEH的Avior相对于球形结构，由于其病毒样形态。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Cyano-4- (phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid (CPADB) |
Sigma-Aldrich | 722995-5G | |
| Oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA) | Sigma-Aldrich | 447935-500ML | Average Mn 300, contains 100 ppm MEHQ as inhibitor, 300 ppm BHT as inhibitor |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | ||
| Ru(bpy)3Cl2.6H2O | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| Benzyl methacrylate (BzMA) | Sigma-Aldrich | 409448-1L | Contains monomethyl ether hydroquinone as inhibitor |
| Aluminium oxide (basic) | Chem-Supply Pty Ltd Australia | AL08371000 | |
| 95% Ethanol (EtOH) | Sucrogen Bio Ethanol | 80889 | |
| Acetonitrile (MeCN) | Chem-Supply Pty Ltd Australia | RP1005-G2.5L | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Chem-Supply Pty Ltd Australia | TA011-2.5L | |
| Petroleum Spirits (40-60 °C) | Chem-Supply Pty Ltd Australia | PA044-2.5L | |
| Diethyl Ether | Chem-Supply Pty Ltd Australia | EA0362.5L | |
| Dimethylacetamide (DMAc) | VWR International Australia | ALFA22916.M1 | For GPC analysis |
| Pasteur pipettes (230 mm) | Labtek | 355.050.503 | |
| Glass beakers | Labtek | 025.01.902 (2L)/ 2110654 (1L) | 2 L beaker is for attaching LED strips to form the circular reactor |
| Commercial LED strip | EcoLab | n/a | λ = 460 nm, 4.8 W/m |
| 4 ml Glass Vials | Labtek | APC502214B | |
| 0.9 ml Quartz Cuvette | Starna Scientific Ltd | 21/Q/2 | |
| Needle (0.8 mm x 38 mm) | Beckton Dickson | 302017 | For deoxygenating reactions |
| Needle (0.8 mm x 120 mm) | B Braun Australia | 4665643 | For deoxygenating reactions |
| Sleeve stopper septa (rubber septum) | Sigma-Aldrich | z564680/z564702 | |
| Stirring hotplates | VWR International Australia/In Vitro Technologies | 97018-488/RADRR91200 | |
| Vortex mixer | VWR International Australia | 412-0098 | |
| Vacuum oven | In Vitro Technologies | MEMVO200 |
References
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