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Neuroscience

Analyse automatisée de Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

Une méthodologie simple et efficace pour l'analyse par ordinateur du comportement de nage de nématodes dans un liquide est décrit. La méthode ne nécessite que peu ou pas d' investissement pour C. elegans laboratoires. Le matériel utilisé est standard, et le logiciel de l'ordinateur pour l'analyse comportementale (Celest) est une open source un.

Abstract

Disséquer les circuits neuronaux et neuromusculaires qui régulent le comportement reste un défi majeur en biologie. Le nématode Caenorhabditis elegans a prouvé être un organisme modèle inestimable pour aider à relever ce défi, d'inspirer des approches technologiques, la construction de la connectome du cerveau humain, à verser effectivement la lumière sur les facteurs moléculaires spécifiques des modèles fonctionnels de base. L'essentiel des études comportementales chez C. elegans ont été réalisées sur des substrats solides. En liquide, les animaux présentent des modèles de comportement qui comprennent le mouvement à une gamme de vitesses en 3D, ainsi que les mouvements du corps partiels, comme une boucle postérieure sans changement de forme antérieure, qui introduisent de nouveaux défis pour la quantification. Les étapes d'une procédure simple, et l' utilisation d'un logiciel qui permet une analyse à haute résolution de C. elegans nager comportement, sont présentés ici. Le logiciel, appelé Celest, utilise un programme informatique spécialisé qui suitplusieurs animaux en même temps et fournit de nouvelles mesures de C. elegans locomotion dans un liquide (natation). Les mesures sont principalement fondées sur la posture animale et basées sur les mathématiques utilisées dans la vision par ordinateur et reconnaissance de formes, sans exigences de calcul pour seuil seuils. L'outil logiciel peut être utilisé à la fois évaluer les prouesses d'ensemble de la natation dans des centaines d'animaux provenant d'essais combinés petits lots et de révéler de nouveaux phénotypes même dans des mutants génétiques bien caractérisés. La préparation des échantillons pour l'analyse avec Celest est simple et low-tech, ce qui permet une large adaptation par la communauté scientifique. L' utilisation de l'approche de calcul décrite ici doit donc contribuer à la meilleure compréhension du comportement et des circuits de comportement dans le modèle C. elegans.

Introduction

Définir comment la génétique, l'épigénétique, l'expérience et l'environnement influencent le comportement est un défi majeur dans la biologie moderne. Simples, des modèles génétiquement justiciables qui peuvent être informatiquement suivis et mesurés peuvent apporter des contributions essentielles pour atteindre cet objectif. Les nématodes Caenorhabditis elegans est un modèle du genre. Le but de cet article est de montrer comment C. elegans natation locomotion peuvent être suivis et quantifiée pour extraire des informations sur huit nouvelles caractéristiques présentant un intérêt biologique.

C. elegans a une durée de vie relativement courte d'environ 2 - 3 w et une période de reproduction d'environ 4 jours à 20 ° C 1,2. Dans les cultures de laboratoire standard, ce nématode microscopique est cultivé sur des plaques de Pétri contenant le nématode Growth Media (NGM) qui se propagent avec une source alimentaire bactérienne 3,4. animaux WT N2 se déplacent activement élégantes ondes sinusoïdales sur des plaques d'agar-rempli; ils changent mouvement rates en itinérance (nourriture recherche), logement (navigation), ou la récupération d'un repas (satiété quiescence inactif) 5. Dépréciation 6 ou 7-12 ans peuvent également modifier considérablement le mouvement des plaques.

Les gènes qui modulent le comportement, healthspan ou le vieillissement, peuvent être caractérisés fonctionnellement par l' analyse de C. modèles de mouvement elegans ou la locomotion. Une approche pour mesurer healthspan est de classer les adultes vieillissants en trois catégories (par exemple, A, B et C) en fonction de leur locomotion sur des plaques, avec une activité physique vigoureuse étant la classe A et la paralysie étant la classe C 7,8,13. Bien qu'un tel tri qualitatif est utile pour révéler les différences dans la forme physique, les catégories sont larges sans limites claires et donc leur notation est soumise à expérimentateur partialité.

Un nombre croissant de trackers ont élevé l'objectivité, la sophistication et la précision de l'analyse de C. elegans mouvementsur des supports solides 14-18. C. elegans locomotion sur les plaques se limite essentiellement au plan dans lequel l'animal est en contact avec la surface solide du support. (C. elegans peut également induire l' exploration en soulevant la tête loin du reste du corps qui est toujours en contact avec une surface solide, le positionnement du corps dans des plans multiples. Toutefois, ce comportement inhabituel.) Lorsqu'il est placé dans un liquide, ce nématode initie un mouvement ondulatoire, ou la natation, qui comporte plus vaste mouvement dimensionnel, une plus grande plage de la vitesse et de la profondeur du mouvement, et une incidence augmente avec l'âge de la antérieure se déplaçant différemment postérieure par rapport aux animaux sur des surfaces solides. Comme une analyse rapide de la condition physique et la réponse à nouvel environnement, un expérimentateur peut placer un animal dans une goutte de liquide et de marquer sa fréquence de courbures du corps dans le champ de dissection. L'enregistrement vidéo peut faciliter scorings actuels et futurs de la vigueur de natation de laanimal. Cependant, l'approche manuelle limite le nombre de fonctionnalités qui peuvent être marqués, et est complètement contraint de marquer un animal à la fois.

Locomotion en liquide a été moins exploré que la locomotion sur des milieux solides. En effet, il y a peu d' options logicielles qui sont robustes et faciles à mettre en œuvre dans le laboratoire pour mesurer la locomotion dans un liquide 19-24. Le logiciel Celest (C. elegans Swim Test) offre la simplicité des mesures d'utilisation et de mathématiques à base qui fournissent des données (scores de courbure) directement pertinents à la nature de la motion 8; (description détaillée des caractéristiques et avantages de Restif et al. 8). En outre, l'analyse informatique permet l'élucidation des caractéristiques phénotypiques qui sont impossibles pour l'oeil humain de marquer. Ici, les données qui illustrent la résolution de cette approche d'analyse sont présentés et facile à mettre en œuvre le protocole d'enregistrer les essais de natation pour l'analyse de Celest ultérieure est décrite.

Protocol

1. nématode croissance et manipulation

  1. Cultivez C. elegans sur des boîtes de Pétri standard contenant NGM repéré avec OP50-1 Escherichia coli comme source de nourriture 1-3.
  2. Maintenir les cultures dans un incubateur qui maintient la température désirée. C. elegans se développe bien entre 15 et 25 ° C, 20 ° C étant la température de croissance standard.
    NOTE: La natation est un phénotype robuste, mais nager vigueur peut être affectée par des facteurs environnementaux, y compris la contamination sur des plaques et la surchauffe des cultures et des diapositives. De fortes efforts pour maintenir des conditions stables doivent être faites.
  3. Utilisez un pick nématode maison faite d'un fil de platine flamme scellé dans une tige de verre pour gérer le transfert des animaux simples 4.

2. Mettre en place pour l'analyse Swim

  1. Utilisez un système intégré constitué d'un stéréomicroscope, caméra CCD numérique, et le logiciel d'enregistrement vidéo numérique. Le logiciel Celest can être utilisé sur un ordinateur séparé.
    1. Couvrez le microscope avec un tissu sombre (par exemple, feutre) pour éviter l' éblouissement dans la zone de chute de bain sur la lame de microscope et d' améliorer la qualité de l' image.
    2. Réglez la distance et un grossissement de travail du microscope pour la vue de la zone de baignade, et le miroir de base pour obtenir net contraste des animaux contre l'arrière-plan. Réglez l'éclairage à fond noir pour visualiser les corps des adultes en blanc sur le fond noir, qui fonctionne très bien pour la visualisation de calcul et de suivi avec le logiciel d'analyse de natation.
    3. Prenez soin de garder la zone de travail, lame de microscope, et nager tomber très propre. Les débris peuvent interférer avec l'analyse en bouchant la nage libre des adultes et minces fils de fibre peut être détectée comme ne bouge pas animaux pendant le suivi.

3. Préparation des animaux pour l'analyse de la condition physique en liquide

  1. Introduire à la pipette 60 ul otampon f 1x M9 dans un anneau de 10 mm préimprimé sur une lame de microscope. Assurez-vous que la goutte recouvre entièrement la zone à l'intérieur de l'anneau. Le logiciel extrait plus d'informations de natation en utilisant cette taille de gouttes contenues sur une diapositive que ce serait si l'utilisation des plaques multipuits.
  2. Choisissez les nématodes adultes seuls et de les transférer dans la goutte de tampon 1x M9, ce qui minimise le transport de bactéries qui peuvent obscurcir le liquide. Minimiser les bactéries en plaçant d'abord les animaux pour le transfert à un côté de la plaque qui ne contient pas beaucoup pelouse bactérienne, de les laisser ramper, et puis doucement les soulevant.
    1. Lors du transfert des nématodes dans la goutte, utiliser un champ de dissection à proximité de la station d'analyse pour réduire la durée de bain, ce qui peut affecter le comportement des animaux 25.
    2. Placez seulement 4 adultes dans la baisse si elles se déplacent vigoureusement et se croisent souvent. À titre indicatif pour minimiser chevauchement des nageurs (qui confond l'analyse computationnelle), envisager de placer4 animaux par goutte quand ils sont aussi actifs que les jeunes, les adultes en bonne santé WT et 5 animaux par goutte quand ils sont plus âgés et montrent moins de vigueur.
      REMARQUE: les nématodes Healthy WT commencent instinctivement nager rapidement après avoir été placé dans un liquide. Avec l'aide d'un pic à nématode, séparer délicatement les adultes dans la goutte si elles agglutinent.

4. Analyse de la condition physique en liquide - Enregistrement vidéo de la piscine

  1. Placez la lame chargée avec des adultes sur la base du microscope pour enregistrer leur piscine. Les détails de capturer des vidéos de 30 de comportement d'un animal dans un liquide (vidéo 1), et l' échantillonnage d' un grand nombre de ces documents est facilement accompli quand aidé par un logiciel de Celest 8,26; cependant, nager plus longues périodes peuvent être idéal pour d' autres études comportementales spécifiques 25. Surtout, assurez-vous de maintenir le même grossissement dans tous les enregistrements, car les différences de grossissement affect analyse de la natation et la comparaison volonté de polarisation.
    Remarque: Ces étapes sont fournies à titre indicatif en utilisant le logiciel d'enregistrement numérique vidéo figurant dans le tableau des matériaux; logiciel d'accès ouvert VirtualDub pourrait remplacer, même si nous avons pas testé.
    1. Utilisez les paramètres suivants comme guide pour l'analyse de natation réussie: taille de l'image de 696 x 520 pixels, la résolution d'image de 0,02 mm / pixel, et un taux de 18 images / s. versions plus haute résolution de ces paramètres peuvent faciliter le suivi, mais ne seront pas affecter les mesures calculées par le programme.
      NOTE: La zone de baignade prévue par la chute de 60 pi de tampon 1x M9 sur la lame de microscope n'a pas beaucoup de profondeur, ce qui réduit au minimum vers le haut et le mouvement de la natation vers le bas.
  2. Sous Paramètres, allez à 'Enregistrement', set 'Limit Sequence Taille »à« 545 cadres sur le disque ». Dans la même rubrique, cochez la case 'Use Recording Manager'. Cliquez sur le 'enre actuelle Modifierle script ding ... "bouton, et sous la rubrique« Commandes », sélectionnez« Grab Frame ', et sous la rubrique «Conditions d'arrêt', entrez 'Arrêt après 0: 00: 30.00.
  3. Pour enregistrer, sélectionnez «Nouvelle séquence dans la RAM» sous la rubrique de la maison, puis appuyez sur le bouton «Record» rouge. Le logiciel va récupérer 545 cadres de plus de 30 s avec l'appareil photo numérique et les tenir dans la mémoire RAM.

5. Analyse de la condition physique dans le liquide - Traitement vidéo

  1. Fragment de la vidéo dans une séquence de trames d'image en cliquant sur l'en-tête de la maison et en sélectionnant la séquence complète Exporter vers ... "dans le logiciel d'enregistrement vidéo.
    REMARQUE: Le logiciel d'enregistrement vidéo numérique peut enregistrer les images que .bmp, .jpg, .tif ou .png, qui peut être lu par le programme d'analyse de natation présenté ici. Notez que les fichiers .tif utilisent plus d'espace de stockage, mais certains formats tels que .jpg peuvent dégrader la qualité de l'image.
  2. Lancez le programme d'analyse de natation à partir de MATLAB by cliquant sur le bouton Exécuter.
  3. Sur l'écran d'accueil du programme d'analyse de natation, utilisez le "Ajouter une vidéo" ou "Ajouter plusieurs vidéos de boutons pour télécharger des séquences d'images cadres un à la fois ou en groupe tout en attachant des étiquettes pertinentes telles que le génotype, la date, le procès et la durée . Le logiciel crée une base de données des séquences marquées.
  4. Activer le suivi simultané de plusieurs animaux dans les séquences téléchargées en cliquant sur '1. Processus vidéos. Dans le nouvel écran, sélectionnez les vidéos souhaitées dans la case de gauche et cliquez sur «Ajouter à la liste '. Pour chaque vidéo, cliquez sur son nom dans la liste en haut à droite pour afficher la première image de la vidéo en bas à droite. Délimiter la zone de baignade en sélectionnant 3 points à l'intérieur de l'anneau, et lancer le traitement en cliquant sur "Process toutes les vidéos mentionnées ci-dessus. Voir les progrès du traitement au fond du centre.
  5. Une fois terminé, "Fermer" l'écran de traitement vidéo.

6. Analyse de la condition physique en liquide - Mesure

  1. Cliquez sur '2. mesures Compute 'pour ouvrir un nouvel écran où les vidéos traitées peuvent être téléchargés, un à la fois, pour valider ou rejeter le suivi des animaux simples. Vidéos qui ont été traitées apparaîtront dans la liste à gauche où le nom de la vidéo peut être cliqué pour télécharger cette vidéo.
  2. Utilisez cette étape manuelle de se concentrer sur les zones de suivi (blocs rouges) manqués par opposition à un suivi avec succès (blocs verts).
    NOTE: Alternativement, on peut compter sur la sortie automatisée de suivi valide puisque le logiciel dispose d' un solide système de suivi (94,1% de validité observée en 2.020 animaux de 404 vidéos 8).
    1. Trouver la «Validité du corps segmenté» dans la première barre de couleur sur l'écran dans la moitié inférieure. Le pourcentage des «cadres valides» est en vert, et le pourcentage des «cadres Rejeté» est en rouge. ≥80% des trames valides impliquent que le suivi information utilisé pour calculer des mesures vient d'au moins 432 cadres sur 540 dans un 30 s nager essai enregistré à 18 images / s.
    2. Facilement naviguer et modifier des blocs de validité / rejeté images utilisant le «bloc suivant», «Changer la validité», «bloc de Split ', et les options« frame Isoler ». Dans les rares cas où 2 animaux croisent dans une zone de baignade peu fréquentée, changer leur numéro d'identification sur une plage de trame spécifique avec le bouton «Switch».
    3. Voir les graphiques à barres dans la moitié inférieure de l'écran pour plus d'informations sur le suivi et les performances qui se chevauchent. La longueur du corps segmenté (la longueur du corps de l'animal par image) est en corrélation avec chevauchement des incidences.
  3. Si des points lumineux sur la vidéo interfèrent avec l'analyse, ajuster les zones claires dans la zone de baignade en sélectionnant la fonction «zones Glare de.
  4. Cliquez sur 'Enregistrer et mesures Calculer »pour enregistrer l'entrée de validité avant jusqu'àcharger une autre vidéo traitée. A ce stade , le logiciel calcule, en arrière - plan (non représenté à l'utilisateur), des cartes courbure de la performance de nage des animaux individuels et les paramètres indiqués ci - dessous (vidéo 2).
    REMARQUE: Les paramètres mesurés qui sont axés sur ici sont décrits dans le tableau 1. Le taux d'initiation Vague, nombre d'onde du corps, l'asymétrie, étirement, et le curling sont calculés sur la base des cartes de courbure que le logiciel calcule pour les animaux; la vitesse de Voyage, Coup de pinceau, et l'activité des paramètres d'index ne sont pas basées sur des cartes de courbure.
  5. Cliquez sur «Fermer» pour quitter l'écran des «mesures Compute de.

7. Analyse de la condition physique en liquide - Sortie des résultats

Remarque: Le logiciel peut rendre compte de multiples mesures du mouvement de natation, qui couvrent de manifestes à très subtils traits comportementaux pas facilement marqués par oeil (Vidéos 3 et 4). Ici leaccent est mis sur 8 paramètres qui montrent généralement une bonne dynamique: taux d'onde d'initiation, le nombre d'onde du corps, Asymétrie, stretch, de curling, de vitesse Voyage, Coup de pinceau, et l'indice d'activité.

  1. Sur l'écran d'accueil du programme, cliquez sur "3. Résultats 'pour obtenir le résultat de l'analyse.
  2. Créer des groupes échantillons pour le traitement statistique en sélectionnant les séquences analysées souhaitées des images dans la zone gauche et en les déplaçant dans une nouvelle ou existante groupe d'échantillons en cliquant sur les boutons 'Ajouter à l'échantillon sélectionné »ou« Ajouter au nouvel échantillon ».
  3. Cliquez sur "Afficher les graphiques pour ces échantillons» pour aller à un second écran qui affiche les graphiques et les statistiques clés des échantillons pour chacun des 8 paramètres par sélection sur la partie supérieure de l'écran.
    1. Si vous le souhaitez, d'ajuster la représentation des graphiques à barres en haut à gauche de l'écran en utilisant les «couleurs», «# d'histogrammes 'et' # de vers de les sélecteurs.
  4. Utilisation'Histogrammes 2D »pour tracer des combinaisons de deux quelconques paramètres via la« mesure sur l'axe X' et 'Mesure sur l'axe Y de la menus déroulants sur la gauche de l'écran. Cliquez sur «Fermer» pour quitter et revenir à l'écran 'affichage des résultats de.
  5. Utilisez le bouton 'Exporter ...' en haut à gauche de l'écran pour enregistrer des données numériques détaillées .csv pour ouvrir et manipuler davantage dans un programme de feuille de calcul.
  6. 'Fermer' écran 'Résultats' pour revenir à l'écran d'accueil et cliquez sur «Quitter» pour assurer l'enregistrement de la base de données contenant les séquences vidéo analysées.

Representative Results

En analysant la locomotion dans un liquide (natation), phénotypes qui ne sont pas évidents sur des milieux solides (ramper) peuvent être élucidés. Pour quantifier la natation locomotion , nous avons développé un logiciel spécifique qui mesure dix nouveaux paramètres du comportement de nage 8. Les huit plus utiles de ces paramètres sont décrits en détail dans le tableau 1. Ces paramètres sont appelés taux d'onde d'initiation, nombre d'onde du corps, Asymétrique, Stretch, Curling, vitesse Voyage, Coup de pinceau, et de l'indice d'activité. Des études illustrant la puissance du logiciel ont défini le déclin fonctionnel des centaines de vieillissement adultes avec WT, antécédents de comportement ou de longévité mutant 8, et ont analysé le bien étudié mutants de longévité âge-1 (hx546) et daƒ-16 (mgDƒ50), qui abritent des mutations qui perturbent la voie de signalisation de l'insuline normale. L'âge-1 gène code pour une phosphatidylinositide 3-kinase (PIK3) Sous - unité catalytique, et, quand il abrite la hx546 de mutation, provoque l' extension de durée de vie et résistance au stress 27-29. Le gène daƒ-16 code pour une boîte de forkhead O (FOXO) facteur de transcription qui raccourcit la durée de vie et altère la réponse au stress lorsque supprimé 30-33.

Certains paramètres de natation tels que le taux d' onde d'initiation, la vitesse Voyage, coup de pinceau et de l' indice d'activité progressivement diminué avec l' âge , même dans des contextes génétiques favorables (figure 1). En ligne avec les connaissances actuelles, longue durée de vie à l' âge 1 (hx546) mutants ont montré une performance physique plus vigoureuse que WT à un âge avancé et extrêmement vieux. Aussi comme prévu, de courte durée daƒ-16 (mgDƒ50) mutants affichés compromis performance, surtout au très vieux âges. Remarquablement, ce ne fut que sous le contrôle de la vision de l'ordinateur Celest et package algorithme mathématique que le superior la performance de natation de l' âge-1 (hx546) mutants était détectable au début de l' âge adulte. Le fait que les résultats en amélioration de la performance physique au jeune vie adulte âge-1 (hx546) suggère que cette mutation affecte le développement normal et / ou jeune phénotype adulte d'une manière non précédemment apprécié (Figure 1).

Body nombre d'onde, Asymétrie, stretch et curling paramètres ont suivi une tendance avec l' âge dans le WT et le vieillissement des adultes mutants (figure 2). Fait intéressant, le niveau du logiciel de résolution a révélé des traits comportementaux plus fins comme la symétrie soutenue des mutants tout au long de leur durée de vie et l'incapacité des anciens daƒ-16 (mgDƒ50) mutants extrêmes âge-1 (hx546) pour étirer et se recroquevillent dans la mesure où même -AGE WT et l' âge-1 (hx546) adultes.

En plus de la perte inévitable de l'ensemble physique performance en raison de l' âge, chaque individu adulte affiche un motif de progression unique à travers le processus de vieillissement, même si la génétique et de l' environnement sont pratiquement homogène 7. (En contrôlant la génétique et de l' environnement, les effets de confusion possibles de ces facteurs sont minimisés, dévoilant la contribution significative de la stochasticité à la dégénérescence liée à l' âge.) A synchronisé C. elegans population d'origine génétique similaire conservé dans un environnement contrôlé contient toujours un mélange de différentes catégories de personnes en fonction de leurs particularités de vieillissement. Bien que commencent tous les adultes en bonne santé, certains perdent rapidement leur forme physique (mauvais agers, classe C) tandis que d'autres maintiennent la vigueur pour une longue période de temps (agers gracieux, classe A). Bad agers semblent donc avoir un healthspan considérablement plus courte que agers gracieux.

Comme plus en détail dans notre étude 8, agers gracieux entretenus FITN physique jeuneess observée par comparaison avec le profil de natation de beaucoup plus jeunes adultes (figures 3, 4 et 5). Cette remise en forme soutenue est comparable à la performance physique-1 âge (hx546) mutants à long terme à l' âge post-reproduction (D 11) (figures 1 et 2). Au contraire, les mauvaises agers considérablement perdu beaucoup de leur capacité physique , peu après la reproduction, l' exécution à des niveaux similaires à ceux des anciens et progeric daƒ-16 (mgDƒ50) adultes extrêmes (figures 1 - 4). Ces similitudes peuvent être tirées par rapport brut, les signatures cependant particulières sont facilement perceptibles à regarder de plus près. Par exemple, bien qu'il y ait une certaine corrélation entre l'étendue des deux étirement et le curling dans les anciens types sauvages extrêmes et mutants vieillissement (Figure 2), cette relation n'a pas été observée dans les mauvais agers (figures 4 et 5), qui montrent plus forte propension à se recourber up maisne pas étirer dans les échantillons testés. Le logiciel que nous présentons ajoute ainsi dimension à l'analyse de la condition physique ou de la capacité locomotrice en fournissant les outils pour des études plus sophistiquées qui ne sont pas traitables avant. En résumé, Celest fournit des lectures complètes sous la forme de huit nouvelles mesures mises en évidence ici, qui définissent l'empreinte comportementale de spécifique génétiques, épigénétiques et milieux environnementaux, permettant l'identification des modèles de paramètres uniques et communs qui peuvent être les signatures de conditions spécifiques ( environnement, pharmacologiques, nutritionnels), les processus biologiques, ou organisme états tels que healthspan.

Figure 1
Figure 1: Celest Rapports logiciels sur Vague Initiation Rate (A), indice d' activité (B), Coup de pinceau (C) et Vitesse Voyage (D) pour WT, l' âge-1 (hx546) et daƒ-16 (mgDƒ50) Adultes sur D 4 (jeune adulte), 11 (post-reproduction) et (vieille extrême) 20. '#' Dans le numéro «moyen de l'axe y. WTS sont colorés en gris, âge 1 en vert et daƒ-16 en rouge. Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne (SEM). WT de même âge et des mutants de vieillissement ont été comparés pour la signification statistique à l'aide d'une analyse de variance suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. ** P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 dans chaque point de données à partir de quatre essais indépendants. Notez que ici, et pour la figure 2, la vidéo de chaque individu 30 est fait avec 4 animaux, et pour chaque essai , nous marquer un total de 16 animaux à partir de 4 vidéos de natation, ceci est fait pour 4 répétitions biologiques pour chaque point de données indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 2
Figure 2: Rapports de logiciels sur le corps Nombre d' onde (A), Asymétrique (B), Stretch (C), et Curling (D) pour WT, l' âge-1 (hx546) et (mgDƒ50) Adultes sur D 4 16 daƒ (jeune l' âge adulte), 11 (post-reproduction) et âgé de 20 (extrême). '#' Dans le numéro «moyen de l'axe y. WT sont colorés en gris, âge 1 en vert, et daf-16 en rouge. Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne (SEM). WT de même âge et des mutants de vieillissement ont été comparés pour la signification statistique à l'aide d'une analyse de variance suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. *, P = 0,01 - <0,05; ** P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 dans chaque point de données de quatre indépendants, 30 s nager essais.f.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Rapports de logiciels sur Vague Initiation Rate (A), indice d' activité (B), Coup de pinceau (C), et la vitesse Voyage (D) pour les jeunes adultes WT (D 4), et de même âge Gracieux et Bad agers (D10 et 11). '#' Dans le numéro «moyen de l'axe y. Les jeunes WTS sont colorés en gris, classe A agers gracieux en vert, et la classe C mauvais agers en rouge. Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne (SEM). Catégorie A agers gracieux et classe C mauvais agers ont été comparés à D 4 jeunes adultes à l'aide d'une ANOVA suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. **** P <0,0001. n = 27 dans chaque point de deux indépendants de données, 30 s nager essais. Graphique est légèrement modifié par Restif et al. (2014) 8, qui a été publié sous la CreativeCommons Paternité (CC BY) licence http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Rapports de logiciels sur le corps Nombre d' onde (A), Asymétrique (B), et Curling (C) pour les jeunes adultes WT (D 4), et agers même âge gracieux et Bad (D 10 et 11). '#' Dans le numéro «moyen de l'axe y. Les jeunes WTS sont colorés en gris, classe A agers gracieux dans agers verts et la classe C mauvais en rouge. Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne (SEM). Catégorie A agers gracieux et classe C mauvais agers ont été comparés à D 4 jeunes adultes à l'aide d'une ANOVA suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. ** P = 0,001 - <0,01; **** P <0,0001; et al. (2014) 8, qui a été publié sous la Creative Commons Paternité (CC BY) http de licence: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Rapport du logiciel sur stretch pour adultes Jeune WT (D 4), et de même âge Gracieux et Bad agers (D 10 et 11). Les jeunes WTS sont colorés en gris, classe A agers gracieux dans agers verts et la classe C mauvais en rouge. Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne (SEM). Classe A Les agers gracieux et la classe C mauvais agers ont été comparés à D 4 yadultes eunes utilisant ANOVA à sens unique suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. n = 27 dans chaque point de données à partir de deux essais indépendants. Graphique est légèrement modifié par Restif et al. (2014) 8, qui a été publié sous la Creative Commons Paternité (CC BY) http de licence: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1
Vidéo 1: Natation d'un groupe représentatif de C. elegans adultes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 2
Vidéo 2: Celest Logiciel de calcul des différents Plans incurvation des Performances Swim des animaux testés. cartes Curvature sont calculées en arrière-plan; ils ne figurent pas dans l'interface logicielle avec l'utilisateur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 3
Vidéo 3: calcul du logiciel des mesures de natation individuelles basées sur Cartes Courbure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 4
Vidéo 4: Logiciel de calcul des mesures de natation qui ne reposent pas sur CourbureCartes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Discussion

L'utilisation de C. elegans comme système modèle continue d'augmenter en raison de sa malléabilité génétique, tractability expérimentale et de l' anatomie annotée au détail méticuleux. Par exemple, la structure neuronale et la connectivité du C. elegans hermaphrodite est clairement cartographiés 34-36, ce qui facilite grandement les enquêtes sur les circuits neuronaux spécifiques qui contrôlent des comportements particuliers. 302 neurones constituent le système nerveux de l'hermaphrodite adulte, qui traitent d'un large éventail d'entrées sensorielles en sorties comportementales de base comme la locomotion. La structure du système nerveux mâle plus complexe a également été décrite 37, circuit de validation spécifique du sexe à traiter. 37

C. elegans comportement a été largement étudié sur des plaques de culture standard contenant des milieux solides. Depuis WT C. elegans se déplace dans des ondes sinusoïdales prévisibles sur des plaques d'agar-rempli, écarts par rapport auschéma global peut être détectée par l'œil et a marqué manuellement. Cette approche, cependant, est soumis au critère de l'expérimentateur et de main-d'œuvre. Outils matériels et logiciels conçus pour suivre et mesurer C. elegans locomotion sur des milieux solides supprimer la polarisation de la subjectivité et de permettre des études à grande échelle, ce qui permet des questions biologiques plus sophistiqués à traiter. La base de données de comportement récent créé par le laboratoire Schafer 16 est un excellent exemple de l'extension analytique et approfondie qui a été réalisé avec un système de calcul de locomotion sur des plaques.

Lorsque WT C. elegans est placé dans un liquide, l'animal adapte rapidement son mouvement au nouvel environnement, initiant une baignade. C. elegans piscine utilise une plus grande amplitude de mouvement que l' exploration et peut être plus irrégulière 8. Des logiciels comme Celest est destiné à combler l'écart pour une analyse détaillée de C. elegans comportement dans un liquide, permiPrép quantification des paramètres de mouvement associé qui ne sont pas faciles à mesurer par l'œil non assistée, ou qui peut être accompli plus rapidement que la notation manuelle. Dans 8 h dure un individu pourrait traiter jusqu'à 200 vidéos, ~ 1000 enregistrements par jour.

Le logiciel définit la natation évaluer les paramètres qui servent une empreinte digitale complète de la condition physique et le comportement. En plus d'enrichir la compréhension des aspects complexes de C. elegans comportement liquide et leurs voies moléculaires sous - jacents, ce logiciel peut être utilisé pour explorer de multiples aspects de la biologie , y compris les réponses pharmacologiques, le vieillissement et le comportement distinct. Présenté ici, la vue d' ensemble des changements quantifiés qui se produisent dans la performance physique de C. elegans adultes comme ils l' âge est un exemple d' une telle application du logiciel (pour un compte rendu plus détaillé, voir Restif et al. 8). Dans le contexte du vieillissement, certains paramètres mesurés ont diminué tandis qued'autres ont augmenté ou n'a pas changé de manière cohérente dans le type sauvage. Les tendances ont été confirmées dans une large mesure par le profil de calcul des mutants de longévité, et les profils relatifs des cohortes de ager gracieuses et mauvaises des populations du même âge conservés dans des conditions environnementales uniformes. La haute résolution du logiciel peut également révéler des phénotypes subtiles jusque -là inconnue dans les mutants largement caractérisés (par exemple, l' âge-1 (hx546) dans la figure 1).

Il y a quelques étapes particulièrement critiques du protocole décrit. Le maintien d'un environnement de température constante entre l'environnement de bain et la culture de la plaque de déformation est importante pour nager reproductibilité, alors expérimentateurs sont fortement encouragés à aller à de grands efforts pour éviter les changements de température aléatoires. médias de natation doivent être à la même température que les plaques. De même, une attention particulière à la taille des gouttes pour la baignade contribuera à assurer la reproductibilité. Enfin, il est prudent de penser enavancer sur le déchargement des gros fichiers vidéo qui accumulent. Le traitement des images sur un site en dehors de l'ordinateur de capture vidéo est recommandée.

L'utilisation du logiciel présenté ici pour l'analyse de natation a certaines limites. Premièrement, bien que les programmes peuvent suivre simultanément plusieurs animaux, si plus de cinq animaux sont analysés conjointement, il y a un risque accru que les animaux vont nager à travers les uns des autres dans les images vidéo. Lorsque le programme ne peut pas clairement déterminer quel animal était qui, censure ces trames de données. Bien que cette fonctionnalité du programme garantit que les données pour les animaux individuels sont de haute qualité, elle limite le débit. Deuxièmement, les images devraient être assez propre, qui est exempt de poussière, les taches et les reflets de lumières, comme des signaux associés peuvent aussi confondre l'analyse d'image. Comme il est indiqué dans la section de protocole 2.1.1, un investissement très low-tech qui peuvent grandement aider la capture d'image en éliminant les complications aux fluctuations in éclairage ambiant est de couvrir l'espace scénique avec un tissu sombre qui ne permet pas la lumière ambiante pour atteindre la scène. Troisièmement, le programme est optimisé pour les animaux au stade adulte. Jeune larves nagent très rapidement et ont de petits corps, ce qui augmente l'erreur de programme. Quatrièmement, certains des logiciels utilise MATLAB, et quand il y a des mises à niveau de version et / ou mises à jour du système d'exploitation, des liens de programme peut être perturbé. Actuellement, le logiciel est optimisé pour une utilisation sur MATLAB 2015b et Mac OS la version 10.10, mais nous nous attendons bientôt publier une version du logiciel qui est plus robuste contre ces changements. Enfin, les fichiers de données vidéo peuvent devenir grande vitesse, et nécessitent un espace de stockage à allouer.

En résumé, présenté ici est une méthode simple qui peut être facilement mis en œuvre par un laboratoire sans beaucoup d' investissements pour créer des vidéos de C. elegans natation pour l' analyse de Celest. Caractéristiques du logiciel incluent une automatisation du suivi paranalyse simultanée de suivi multi-animal, et l' utilisation de bases mathématiques (c. -à- mesure de courbure) pour la quantification de la plupart des paramètres de locomotion. Le logiciel est open source, avec le code des démos et accessibles au public comme détaillé dans Restif et al. 8. Bien que le programme comporte une analyse avancée de la vision par ordinateur pour le suivi, d' autres systèmes de suivi publié (par exemple, Greenblum et al., 2014 38) sont compatibles avec l'analyse des paramètres du logiciel présenté ici. Les améliorations futures seront dirigées vers la conversion du logiciel dans un paquet plus robuste qui ne restreint pas l' utilisation des versions spécifiques des systèmes d'exploitation mentionnés ci - dessus (également indiquées dans le tableau des matériaux).

Acknowledgments

le développement Celest a été soutenu par le NIH accorde R21AG027513 et U01AG045864. Données et des représentations vidéo de courte durée sont adaptées de Restif et al. (2014) 8, qui ont été publiés sous la licence Creative Commons Paternité (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Nous remercions Ricardo Laranjeiro aide manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

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Neuroscience numéro 118 le comportement de natation locomotion, Vieillissement sarcopénie suivi
Analyse automatisée de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportement Swim Utiliser Celest Software
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Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

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