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Neuroscience

の自動解析 Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

液体中の線虫水泳行動のコンピュータベースの分析のための効率的で簡単な方法が記載されています。この方法は、 線虫の実験室のための無投資に少し必要です。使用されるハードウェアは標準であり、行動分析（セレスト）のためのコンピュータ・ソフトウェアは、オープンソースの一つです。

Abstract

行動を規制神経細胞および神経筋の回路を解剖すると、生物学における主要な課題です。線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、人間の脳のコネクトームを構築し、技術的アプローチを鼓舞から、実際に基本的な機能性パターンの特定の分子のドライバーに光を流しに、この課題に取り組むうえで貴重なモデル生物であることが証明されました。 C.エレガンスにおける行動研究の大部分は、固体基板上で行われてきました。液体では、動物が3Dで速度の範囲での動きだけでなく、定量化のための新たな課題を紹介し、前方の形状変化せず、このような事後カールなどの部分的な身体の動きを含んで行動パターンを示します。簡単な手順のステップ、およびC.エレガンスの高解像度解析が行動を泳ぐ可能にするソフトウェアの使用は、ここに提示されています。セレスト命名ソフトウェアは、トラック専門のコンピュータプログラムを使用し複数の動物が同時にCの新たな手段を提供する液体（水泳）に移動エレガンス 。対策は、主に動物の姿勢で接地し、閾値カットオフのための計算要件なしに、コンピュータビジョンとパターン認識で使用される数学に基づいています。ソフトウェアツールを組み合わせ、小さなバッチ試験から動物の数百人で全体の水泳の腕前を評価し、偶数ではよく特徴付けられた遺伝的変異体を新たな表現型を明らかにするために、両方に使用することができます。セレストと分析のための試料の調製は、科学界によって幅広い適応を可能にする、シンプルでローテクです。ここで説明する計算論的アプローチの使用は、したがって、 線虫モデルにおける行動と行動の回路のより深い理解に貢献すべきです。

Introduction

どのように遺伝学、エピジェネティクス、経験、および環境影響の振る舞いを定義することは、現代生物学の大きな課題です。計算上、追跡および測定することができる簡単な、遺伝的に受け入れられるモデルは、この目標に向けて重要な貢献をすることができます。線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、そのようなモデルです。この記事の目的は、運動水泳C.エレガンスは、生物学的関連性で8新規の特徴についての情報を抽出するために追跡し、定量化することができる方法を示すことです。

3ワットと20°C 1,2で約4日間の繁殖期- C.エレガンスは、約2の比較的短い寿命を持っています。標準的な実験室培養物において、この微細な線虫、細菌食料源3,4で拡散され線虫成長培地（NGM）を含むペトリ皿上に成長させます。 WT N2動物を寒天で満たされたプレート上の優雅な正弦波に積極的に移動します。それらは運動ラットを変更します、（食品シーク）ローミング（閲覧）を住居、または食事（非アクティブな満腹の休止）5からの回復エス。減損6または年齢7-12も劇的にプレート上の動きを変更することができます。

健康寿命または老化現象を調節する遺伝子は、機能的にC.エレガンスの移動パターンまたは移動を分析することによって特徴づけることができます。健康寿命を測定するための一つのアプローチは、活発な身体活動は、クラスC 7,8,13ているクラスAと麻痺であることで、プレート上での移動に応じて3種類（ 例えば 、A、B、およびC）に老化の大人を分類することです。このような定性的なソートは体力の違いを明らかにするのに便利ですが、カテゴリが明確な境界のない幅広いするので、それらの得点は、バイアスを実験者になる場合があります。

トラッカーが増えて客観性、洗練、そしてエレガンスの動きの解析の精度が上昇しています14-18固形培地上。 C.は、プレート上の移動はほとんどの動物は、媒体の固体表面と接触している面に限定されるエレガンス 。 （C.エレガンスはまた、複数の面で体を配置する、固体表面に接触してまだ体の残りの部分から離れて頭を持ち上げて探査を誘導することができる。ただし、この動作が異常である。）は、液体中に置かれた場合、これを線虫は、固体表面上の動物と比較して、後方とは異なって移動するより広範な次元の動き、動きの速さと深さのより大きな範囲、と前の年齢で発生率の増加を特徴と波状運動、または水泳を開始します。体力、新しい環境への応答の迅速な分析としては、実験者は、液滴の中に個々の動物を配置することができますし、解剖範囲の下で体を曲げるのその周波数を獲得します。ビデオ録画は、水泳活力の現在および将来のscoringsを容易にすることができます動物。しかし、手動のアプローチが得点することが可能な機能の数を制限し、完全に一度に一つの動物を採点するように制約されています。

液体中の歩行運動は、固形培地上の歩行未満検討されています。確かに、堅牢かつ液体19-24で運動を測定するために実験室で実施するのが容易であり、いくつかのソフトウェア・オプションがあります。ソフトウェア・セレスト（C.エレガンス水泳試験）は、運動8の性質に直接関連するデータ（曲率スコア）を提供し、使用し、数学的なベースの措置のシンプルさを提供しています。 （Restif らの機能および利点の説明を詳述する。8）。また、コンピュータ解析は、人間の目が得点するのは不可能な表現型の特徴の解明を可能にします。ここでは、この解析手法の分解能を例示するデータが提示され、後続のセレスト分析のために水泳試験を記録するためにプロトコルを実装することは容易に説明されます。

Protocol

1.線虫の成長と取り扱い

  1. NGMを含む標準ペトリ皿上のC.エレガンスの成長は食料源1-3としてOP50-1 大腸菌でスポット。
  2. 所望の温度を維持するインキュベーターで培養液を保管してください。 C.エレガンスは、20°Cは、標準的な成長温度であると、15から25℃によく育ちます。
    注：水泳は、しかし、活力が文化やスライドのプレートの汚れや過熱などの環境要因によって影響を受ける可能性が泳ぐ、堅牢な表現型です。安定した状態を維持するための強力な努力がなされるべきです。
  3. 単一の動物4の転送を処理するためにガラス棒に炎が封止された白金線で作られた自家製の線虫のピックを使用してください。

スイム分析のための設定2.

  1. 実体顕微鏡、デジタルCCDカメラ、およびデジタルビデオレコーディングソフトウェアからなる統合されたシステムを使用してください。セレストソフトウェアCAnは別のコンピュータ上で使用すること。
    1. 暗い布で顕微鏡を覆い、顕微鏡スライド上の水泳ドロップエリアにグレアを防止し、画像品質を向上させるために（ 例えば、フェルト）。
    2. 背景に動物の鋭いコントラストを得るために、完全な水泳領域のビュー、およびベースミラーに顕微鏡の作動距離と倍率を調整します。水泳解析ソフトウェアで計算可視化し、追跡のために非常にうまく機能黒い背景、に対して、白と大人の体を可視化するために暗視野に照明を設定します。
    3. 作業領域、顕微鏡スライドを維持し、非常にきれいドロップ泳ぐように注意してください。デブリは、大人の自由遊泳を閉塞することにより分析を妨害することができ、繊維の薄いスレッドが追跡中に​​動物を被申立として検出することができます。

液体中の体力の分析のための3動物の準備

  1. ピペット60μLoを1×M9バッファF顕微鏡スライド上にあらかじめ印刷10ミリメートルリングへ。ドロップが完全にリングの内側の領域をカバーしていることを確認します。ソフトウェアは、マルチウェルプレートを利用することになる場合よりも、スライドに含まれるこのドロップサイズを使用してより多くの水泳情報を抽出します。
  2. 単一の大人の線虫を選択し、液体を曇らせることができる細菌の輸送を最小限に抑え、1×M9バッファーの低下にそれらを転送します。最初にそれらを持ち上げ優しく、その後、多くの細菌叢が含まれていないプレートの側面への転送のために動物を配置し、それらをクロールさせること、およびによって細菌を最小限に抑えます。
    1. ドロップに線虫を転送する場合は、動物25の動作に影響を与える可能性があり、水泳の時間の長さを短くする分析ステーションに近い解剖スコープを使用しています。
    2. 彼らはしばしば激しくクロスパスを移動する場合、ドロップだけ大人4名を配置します。 （コンピュータ解析を混乱させる）スイマーを重ねる最小化するためのガイダンスとして、配置することを検討してください彼らは古いと少ない活力を表示するとき、彼らは若く、健康なWTの大人とドロップあたり5匹の動物と同様に活性であるドロップ4匹。
      注：健康なWTの線虫直感的液体中に配置された後、すぐに泳ぎ始め。彼らは凝集場合は、線虫のピックの助けを借りて、静かにドロップで大人を分離します。

液体中の体力の4分析 - 水泳のビデオ録画

  1. 彼らの水泳を記録するために、顕微鏡のベース上の大人を搭載したスライドを置きます。液体中の個々の動物の行動の30秒のビデオキャプチャの詳細（ 動画1）、およびセレストソフトウェア8,26によって助けたときに容易に達成されるように多数のレコードのサンプリング。しかし、長い期間が他の特定の行動研究25のための理想的かもしれ泳ぎます。倍率差がaffecので重要なことは、すべての録画全体で同じ倍率を維持することを確認してくださいトンスイミング分析と意志バイアス比較。
    注：これらの手順は、 材料の表に記載されているデジタルビデオ録画ソフトを使用してのガイダンスとして提供されています。私たちはこれをテストしていませんが、VirtualDubのオープンアクセス・ソフトウェアは、代用可能性があります。
    1. 696のx 520ピクセルの画像サイズ、0.02ミリメートル/ピクセルの画像解像度、および18フレーム/秒の速度：成功水泳分析のためのガイダンスとして、以下の設定を使用します。これらの設定のより高い解像度のバージョンでは、追跡を容易にすることができるが、プログラムによって計算された措置には影響しません。
      注：顕微鏡スライド上の1×M9バッファー60μLの降下は上向きと下向きの水泳運動を最小化する多くの深さを、持っていませんが提供する水泳ゾーン。
  2. [設定]で、[ディスク上の545フレーム」に設定し、「リミットシーケンスの大きさ ''を記録」にアクセスしてください。同じ見出しの下に、「利用レコーディングマネージャ]チェックボックスをオンにします。 「編集現在recorをクリックしてください鼎のスクリプトは...コマンド」ボタンを押すと、下の ''入力して、「停止条件」、および下の「グラブフレーム」を選択し「停止後の0：00：30.00」。
  3. 録音、自宅の見出しの下にある「RAMで新規シーケンス」を選択し、赤い「録音」ボタンを押してください。ソフトウェアは、デジタルカメラで30秒かけて545フレームを取得し、RAMメモリにそれらを保持します。

液体中の体力の5分析 - ビデオ処理

  1. ホームの見出しをクリックして選択することで、画像フレームのシーケンスにビデオを断片化」へのエクスポート全配列を... 'ビデオ録画ソフトウェアで。
    注：デジタルビデオ録画ソフトウェアは、ここに提示水泳解析プログラムで読み取ることができますこれらの全ての.bmp、.jpgの、の.tif、.pngのいずれか、などのフレームを保存することができます。 .tifファイルはより多くのストレージスペースを使用することに注意してくださいが、そのような.jpgのようないくつかのフォーマットは、画質を劣化させる可能性があります。
  2. MATLAB Bから水泳解析プログラムを起動しますyは、実行ボタンをクリックします。
  3. 水泳解析プログラムのホーム画面で、[追加1ビデオ」またはそのような遺伝子型、日付、試験と継続時間などの関連標識を結合しながら、画像フレームのシーケンスを一度にまたはグループ内の1つをアップロードするボタンの複数のビデオの追加」を使用します。ソフトウェアは、標識された配列のデータベースを作成します。
  4. 1 'をクリックすることで、アップロードしたシーケンス内の複数の動物の同時トラッキングを有効にします。プロセス・ビデオ」。新しい画面では、左のボックスに希望の動画を選択してクリックし、「リストに追加」。各ビデオについては、右下のビデオの最初の画像を表示するために右上のリストでその名前をクリックします。リングの内側に3ポイントを選択することで、水泳ゾーンを画定し、「上記に記載されているすべての動画プロセス」をクリックして処理を開始します。中央下部に処理の進行状況を表示します。
  5. 映像処理画面完了すると、「閉じます」。

6。液体中の体力の分析 - 測定

  1. 2」をクリックします。計算の措置は「検証したり、単一の動物の追跡を拒否するように、処理されたビデオは一度に1、アップロードすることができる新しい画面を開きます。処理されたビデオは、ビデオ名がその動画をアップロードするためにクリックすることができ、左側のリストに表示されます。
  2. 成功したトラッキング（緑ブロック）とは対照的に逃したトラッキング（赤ブロック）の分野に注力し、この手動手順を使用します。
    注：ソフトウェアは、ロバストなトラッキングシステム（404ビデオ8から2020動物で観察されるように94.1パーセントの妥当性）を有しているので、別の方法として、1は有効な追跡の自動化された出力に依存することができます。
    1. 下半分の画面全体の最初のカラーバーの「セグメント化された身体の妥当性」を検索します。 「有効フレーム」の割合は緑色であり、かつ「拒否フレーム」の割合が赤です。有効なフレームの≥80％は、追跡私ことを意味するもの対策を計算するために使用nformationは30秒で540のうち少なくとも432フレームから来て18フレーム/秒で記録された裁判を泳ぎます。
    2. 簡単にナビゲートし、有効なのブロックを変更/ '次にブロック」、「スイッチの妥当性」、「分割ブロック」、および「アイソフレーム」オプションを利用したフレームを拒否しました。 2匹の動物が混雑していない水泳ゾーンでパスを越えていることをまれに、「スイッチ」ボタンで特定のフレーム範囲にわたって、その識別番号を切り替えます。
    3. トラッキングと重複公演に関する追加情報については、画面の下半分に棒グラフを表示します。セグメント化された本体（フレーム当たりの動物の体の長さ）の長さは、重複発生率と相関します。
  3. 動画上の任意の明るいスポットが分析を妨害した場合、「グレアゾーン」機能を選択することで、水泳ゾーン内の明るい部分を調整します。
  4. アップ前に妥当性入力を保存するには、「保存して計算措置」をクリック別の処理されたビデオをロードします。ソフトウェアは、計算し、この段階で、バックグラウンドで、個々の動物の水泳能力の曲率マップを（ユーザーに図示せず）とのパラメータを以下に示す（ ビデオ2）。
    注：ここに焦点を当てて測定されたパラメータを表1に記載されています。ウェーブの開始速度、車体波数、非対称性、伸縮性、およびカールは、ソフトウェアは、動物のための計算曲率マップに基づいて計算されています。走行速度、ブラシストローク、およびアクティビティインデックスパラメータは、曲率マップに基づいていません。
  5. 「計算措置」画面を終了するには、「閉じる」をクリックします。

液体中の体力の7.分析 - 結果の出力

注：ソフトウェアが容易に目で獲得していない非常に微妙にあからさまな行動特性からカバー水泳運動の複数のメジャー、上に報告することができます（ ビデオ3および4）。ここでウェーブ開始速度、ボディ波数、非対称、ストレッチ、カーリング、旅行速度、ブラシストローク、およびアクティビティインデックス：焦点は、典型的には、良好なダイナミックレンジを示す8つのパラメータです。

  1. プログラムのホーム画面で、3 'をクリックしてください。表示結果は、「解析結果を得ることができます。
  2. 左側のボックス内のフレームの所望の分析配列を選択し、または「選択したサンプルに追加 ''新しいサンプルに追加]ボタンをクリックすることで、新規または既存のサンプルグループにそれらを移動することによって、統計的処理のためのサンプルグループを作成します。
  3. 画面の上部に選択することによってグラフや8各パラメータのサンプルの主要な統計情報を表示する第二の画面に移動するには、「これらのサンプルを表示：グラフ]をクリックします。
    1. 希望する場合は、「色」、「ヒストグラムの＃ '、およびセレクタ「ワームの＃'を使用して、画面の左上にあるバーグラフの表現を調整します。
  4. つかいます「2Dヒストグラム」は、画面の左側にあるドロップダウンメニュー 'Y軸の測定」と「X軸上の措置'を介して任意の2つのパラメータの組み合わせをプロットします。終了し、「結果の表示」画面に戻るには、「閉じる」をクリックします。
  5. 開き、さらにスプレッドシートプログラムで操作するための.csvファイルとして詳細な数値データを保存するには、画面の左上にある「エクスポート...」ボタンを使用してください。
  6. バックホーム画面に移動して、分析したビデオシーケンスを含むデータベースの保存を確実にするために「終了」をクリックする「閉じる」「結果の表示」画面が表示されます。

Representative Results

液体（水泳）で運動を分析することにより、固形培地（クロール）に容易に明らかでない表現型を解明することができます。水泳運動を定量するために、我々は遊泳行動8の10の新規パラメータを測定する特定のソフトウェアを開発しました。これらのパラメータの8最も有用表1に詳細に記載されています。これらのパラメータは、ウェーブの開始速度、ボディ波数、非対称、ストレッチ、カーリング、旅行速度、ブラシストローク、およびアクティビティインデックスと命名されています。ソフトウェアのパワーを例示する研究は、WTと老化の大人数百人、行動や長寿変異体背景8の機能低下を定義している、とよく研究長寿変異体年齢-1（hx546）とdaƒ-16（mgDƒ50）を分析していますこれは正常なインスリンシグナル伝達経路を混乱させる変異を保有します。遺伝子年齢-1は PIK3（ホスファチジルイノシトール3-キナーゼをコードしますそれが変異hx546を保有）触媒サブユニット、およびは、寿命の延長とストレス耐性27-29を引き起こします。遺伝子daƒ-16は、寿命を短くし、30〜33を削除したときにストレス応答を損なうフォークヘッドボックスO（FOXO）転写因子をコードします。

ウェーブの開始速度、移動速度、ブラシストロークと活動指数などの水泳の一部のパラメータは、徐々にでも良好な遺伝的背景（ 図1）に年齢とともに減少しました。現在の知識に沿って、長寿命の年齢-1（hx546）変異体は、先進的かつ非常に古い年齢でWTよりもより激しい物理的な性能を示しました。予想通りまた、短命daƒ-16（mgDƒ50）変異体は、特に、非常に古い年齢で、妥協の性能を示しました。驚くべきことに、それだけでセレストのコンピュータビジョンと数学的アルゴリズムパッケージsuperioの精査の下にありました年齢-1（hx546）変異体のRの水泳のパフォーマンスは成人期の開始時に検出可能でした。 年齢-1（hx546）若い成人の生活で強化された物理的なパフォーマンスの結果は、この変異は、以前に（ 図1）を認めていない方法で正常な発達および/または若年成人の表現型に影響を及ぼすことを示唆しているという事実。

ボディ波数、非対称、ストレッチ、およびカーリングのパラメータは、WTにおける年齢と老化変異大人（ 図2）でアップに推移しました。興味深いことに、ソフトウェアの解像度レベルは、それらの寿命とストレッチと同程度に丸くする極端な古いdaƒ-16の不能（mgDƒ50）突然変異体全体に年齢-1（hx546）変異体の持続的な対称性などの細かい行動特性を明らかにしました-age WTと年齢-1（hx546）成人ありません。

物理perfoの全体的な必然的な損失に加えて、年齢によるrmanceは、それぞれ個別の大人は、遺伝と環境が7事実上均質であっても、老化プロセスを経てユニークな進行パターンが表示されます。 （遺伝と環境を制御することにより、これらの要因の可能な交絡効果は年齢に関連した変性に偶然性の重要な貢献を発表、最小化されている。）は、同様の遺伝的背景の同期線虫集団が制御された環境で保たはまだのミックスが含まれています彼らの老化特殊性に応じて、個人の異なるクラス。すべてのとして健康な成人を開始するが、他の人が、より長い期間（優雅なエージャー、クラスA）のための活力を維持しながら、いくつかは、急速に体力（悪いエージャー、クラスC）を失います。バート・エージャーは、このように優雅なエージャーよりもかなり短い健康寿命を持っているように見えます。

我々の研究8で詳しく説明するように、優雅なエージャーは若々しい物理fitnを維持しました多くの若い成人（ 図3、図4及び5）の水泳プロファイルと比較して観察されるように、ESS。この持続的なフィットネスは、ポスト生殖年齢で長寿命の年齢-1（hx546）変異体の物理的性能（D 11）に匹敵する（ 図1および図 2）。逆に、悪いエージャーは劇的に極端な古いとprogericdaƒ-16（mgDƒ50）成人（ - 4図1）のものと同様のレベルで行うことにより、すぐに再生した後、それらの物理的な能力の多くを失いました。これらの類似性は、総比較することによって描画することができ、しかし、特定の署名はよく見に容易に顕著です。極端な古い野生型でストレッチやカールの両方の程度や老化の変異体（ 図2）との間に何らかの相関があるが、例えば、この関係はカールする高い傾向を示し悪いエージャー（ 図4、図 5）、では観察されませんアップが、試験されたサンプルにストレッチしないように。我々が提示するソフトウェアは、このように前に扱いやすいなかった、より高度な研究のためのツールを提供することで、体力や運動器官の能力の分析に次元を追加します。要約すると、セレストは8小説措置の形で総合的な読み出しを提供（特定の条件の署名することができ、ユニークで共通のパラメータパターンの識別を可能にする、特定の遺伝子、エピジェネティックの行動指紋、および環境的背景を定義する、ここで強調表示しましたこのような健康寿命などの環境、薬理学的、栄養）、生物学的プロセス、または生物の状態。

図1
図1：ウェーブ開始レート（A）、WT、 年齢-1（hx546）、およびdaƒ-16（mgDƒ50）のための活動指数（B）、ブラシストローク（C）と旅行速度（D）にセレストソフトウェアのレポート D 4（青年期）、11（ポスト生殖）と20（極端な古い）上の大人。 Y軸の「＃」は「数」を意味します。 WTは赤で緑とdaƒ-16グレー、 年齢-1で着色されています。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）です。同じ年齢のWTと老化の変異体は、ANOVAはDunnettの多重比較検定に続いて一方向を使用して統計的有意性について比較しました。 **、P = 0.001 - <0.01; ***はp = 0.0001 - <0.001。 n = 4つの独立した試験からの各データポイントで62。なお、ここでは、 図2のために、それぞれ個別の30秒のビデオは、4匹の動物で構成され、各試行のために、我々は4水泳ビデオから16の動物の合計スコア、これは示された各データポイントの4生物学的複製のために行われています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ntent「FO：キープtogether.withinページ= "1"> 図2
図2：WTのためのボディウェーブナンバー（A）、非対称（B）、ストレッチ（C）、およびカーリング（D）上のソフトウェアレポート、 年齢-1（hx546）及びD 4にdaƒ-16（mgDƒ50）大人（若いです成人期）、11（ポスト再生）および20）（極端な古いです。 Y軸の「＃」は「数」を意味します。 WTは赤で、緑色、およびDAF-16に灰色、 年齢-1で着色されています。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）です。同じ年齢のWTと老化の変異体は、ANOVAはDunnettの多重比較検定に続いて一方向を使用して統計的有意性について比較しました。 *、P = 0.01 - <0.05; **、P = 0.001 - <0.01; ***はp = 0.0001 - <0.001。 n = 4つの独立した、30秒からの各データポイント62は、試験を泳ぎます。e.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3：ウェーブ開始レート（A）、活性指数（B）、ブラシストローク（C）、および若年WT大人のための旅行速度（D）（D 4）、および同年齢優雅でバート・エイジ（D10上のソフトウェアレポート11）。 Y軸の「＃」は「数」を意味します。ヤングのWTは、赤、緑、およびクラスC悪いエージャーの灰色、クラス優雅なエージャーに着色されています。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）です。クラスは、優雅なエージャーおよびクラスC悪いエージャーはDunnettの多重比較検定に続く一方向ANOVAを使用してDに4若年成人を比較しました。 **** に、p <0.0001。 N = 2の独立した、30秒からの各データポイント27は、試験を泳ぎます。グラフは若干ら Restifから変更されています。クリエイティブで公開されていました（2014年）8、コモンズ（CC BY）ライセンスhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4：ヤングWT大人のためのボディウェーブナンバー（A）、非対称（B）、およびカーリング（C）上のソフトウェアレポート（D 4）、および同年齢優雅でバート・エイジ（D 10及び11）。 Y軸の「＃」は「数」を意味します。ヤングのWTは、赤、緑、およびクラスC悪いエージャーの灰色、クラス優雅なエージャーに着色されています。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）です。クラスは、優雅なエージャーおよびクラスC悪いエージャーはDunnettの多重比較検定に続く一方向ANOVAを使用してDに4若年成人を比較しました。 **、P = 0.001 - <0.01; **** に、p <0.0001; ら Restifから変更されています。 /creativecommons.org/licenses/by/4.0/：クリエイティブ・コモンズ（CC BY）ライセンスのhttpで公開されていました（2014年）8、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5：ヤングWTの大人のためのストレッチのソフトウェアレポート（D 4）、および同年齢優雅でバート・エイジ（D 10及び11）。ヤングのWTは、赤、緑、およびクラスC悪いエージャーの灰色、クラス優雅なエージャーに着色されています。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）です。クラスA優雅なエージャーとクラスC悪いエージャーは、D 4 yに比較しましたDunnettの多重比較検定に続く一方向ANOVAを用いてoung大人。 N = 2の独立した試験からの各データポイントで27。グラフは若干ら Restifから変更されています。 /creativecommons.org/licenses/by/4.0/：クリエイティブ・コモンズ（CC BY）ライセンスのhttpで公開されていました（2014年）8、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ビデオ1
ビデオ1：C.の代表グループの水泳は大人エレガンス 。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）

動画2
ビデオ2：試験した動物の水泳パフォーマンスの個々の曲率マップのセレストソフトウェア計算。曲率マップは、バックグラウンドで計算されます。彼らは、ユーザーとのソフトウェアインターフェイスには表示されません。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）

ビデオ3
ビデオ3：個々の曲率マップに基づいて泳ぐ対策のソフトウェア計算。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）

ビデオ4
ビデオ4：曲率に依存しないスイム対策のソフトウェアの計算地図。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）

Discussion

モデル系としての線虫の使用は、細心の詳細に注釈を付け、その遺伝展性、実験的な従順および解剖学的構造に増加し続けています。例えば、 線虫の雌雄同体の神経構造との接続は明らかに大幅に特定の動作を制御し、特定の神経回路の研究を促進し、34-36をマッピングされます。 302ニューロンは運動のような基本的な行動の出力に感覚入力の広い範囲を処理する大人の雌雄同体の神経系を構成しています。より複雑な男性の神経系の構造も対処する性別特有の回路を可能にする、37に記載されています。 37

C.エレガンスの動作は、広く固体培地を含む標準培養プレート上で検討されています。 WT C.はからの逸脱、寒天を充填したプレート上で予測可能な正弦波に移動エレガンスので、全体的なパターンは、目で検出され、手動で採点することができます。このアプローチは、しかし、実験の基準が適用され、労働集約的です。 C.は、固体培地上で歩行エレガンス追跡し、測定するように設計されたハードウェアおよびソフトウェアツールは、主観バイアスを除去し、対処するより洗練された生物学的な質問を可能にする、大規模な研究を可能にします。シェーファーラボ16で作成された最近の行動データベースは、プレート上の移動のための計算システムを用いて達成された分析の拡張と深さの優れた例です。

WT C.エレガンスは、液体中に配置されると、動物はすぐに水泳を開始し、新たな環境への動きを適応させます。 C.エレガンスの水泳はクロールよりも動きの大きな範囲を利用し、8より不規則であることができます。セレストのようなソフトウェアは、Cの詳細な分析のためのギャップを埋めるためのものです、液体中permiを行動エレガンス容易に未支援の眼によって測定されない、またはそれはより迅速に手動スコアリングよりも達成することができる運動関連パラメータのめの設定定量。 8ハード時間では個人は200ビデオ、〜一日あたり1,000レコードまで処理できました。

ソフトウェアは、体力と行動の総合的な指紋としての役割を果たすスイミング評価するパラメータを定義します。 C.エレガンス液中の挙動とその基礎となる分子経路の複雑なファセットの理解を豊かにすることに加えて、このソフトウェアは、薬理学的応答、老化、および明確な行動を含む生物学の複数の側面を探索するために使用することができます。彼らの年齢としてここに提示、Cの物理的性能で発生する定量化された変更の概要は、大人のエレガンスソフトウェアのようなアプリケーションの一例である（より詳細なアカウントに対して、Restif らを参照してください。8）。老化の文脈では、いくつかの測定されたパラメータが、一方減少しました他の人が増加または一貫して、野生型に変化しませんでした。トレンドは長寿変異体の計算プロファイルによって大部分が確認され、同じ年齢集団の優雅で悪いエージャーコホートの相対的なプロファイルは、均一な環境条件に維持しました。ソフトウェアの高分解能も広範囲に特徴の変異体（ 例えば、 年齢-1 図1の（hx546））で以前に未知の微妙な表現型を明らかにすることができます。

記載されたプロトコルのいくつかの特に重要なステップがあります。実験者は、高度にランダムな温度変化を避けるために、せっかくに行くことを奨励されているので、水泳の環境と歪平板培養の間に一定の温度環境を維持することは、水泳の再現性のために重要です。スイムメディアはプレートと同じ温度である必要があります。同様に、水泳のドロップサイズに細心の注意は、再現性を確保するのに役立ちます。最後に、に考えることが賢明です蓄積大きなビデオファイルのオフロードについて進めます。ビデオキャプチャコンピュータから離れたサイトに画像を処理することをお勧めします。

水泳の分析のためにここに提示ソフトウェアの使用は、一定の制限があります。プログラムが同時に複数の動物を追跡することができますが、以上の5匹の動物が共同で分析されている場合、最初に、動物はビデオ画像にお互いを泳いで渡るということ増加した可能性があります。プログラムは、明確に、それはそれらのデータフレームを検閲する、あった動物判断できない場合。このプログラムの機能は、個々の動物のデータは、高品質であることを保証するが、スループットを制限します。関連する信号も画像解析を混乱することができますように、第2、画像はかなりきれいにする必要があり、それは、ほこり、汚れやライトからのグレアの自由です。プロトコルセクション2.1.1、大幅に変動して合併症を排除することで、画像キャプチャを助けることができる非常にローテクな投資で述べたように私nは環境照明は、周囲の光がステージに到達することはできません暗い布でステージ領域をカバーすることです。第三に、プログラムは、大人の段階で動物のために最適化されています。若い幼虫は、プログラムエラーを増加させる、非常に速く泳ぐと小さな体を持っています。第四に、ソフトウェアの一部は、MATLABを使用して、バージョンのアップグレードおよび/またはオペレーティングシステムのアップグレードがある場合、いくつかのプログラムリンクは破壊されてもよいです。現在、ソフトウェアは、MATLAB 2015bでの使用に最適化されており、Mac OSのバージョン10.10が、我々はすぐにこのような変化に対してより堅牢であるソフトウェアバージョンを掲載することを期待されています。最後に、映像データファイルは、迅速に大きくなると、割り当てされる記憶空間を必要とします。

要約すると、ここで提示を簡単セレスト分析のために水泳C.エレガンスのビデオを作成するために多くの投資することなく、任意の実験室で実現することができる簡単な方法論です。ソフトウェアパッケージの特長を通じて追跡から大規模な自動化を含みます分析、同時マルチ動物の追跡、およびほとんどの歩行パラメータの定量のための数学的な塩基（ すなわち、曲率を測定）の使用。ソフトウェアはRestif らに詳述されているよう公に利用可能なコードとデモで、オープンソースです。 8。プログラムは、トラッキングのための高度なコンピュータビジョンの分析、他の公開された追跡システムを備えていますが（ 例えば 、Greenblum ら 、2014 38）ここに提示ソフトウェアのパラメータ解析と互換性があります。今後の改善点は、上記のオペレーティング・システムの特定のバージョン（また、 材料の表に示されている）に使用を制限しないより堅牢なパッケージにソフトウェアを変換に向けられます。

Acknowledgments

セレストの開発は、NIHの助成金R21AG027513とU01AG045864によってサポートされていました。データおよびいくつかの短いビデオ表現はRestif らから適応されます。クリエイティブ・コモンズ（CC BY）ライセンスhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/の下で公開された（2014年）8、。私たちは、原稿のヘルプはリカルドLaranjeiroに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

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神経科学、問題118、水泳行動、運動、
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Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

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