Summary
En effektiv og enkel metode for databasert analyse av nematode svømming oppførsel i flytende er beskrevet. Metoden krever lite eller ingen investering for C. elegans laboratorier. Maskinvaren som brukes er standard, og dataprogrammer for atferdsanalyse (Celest) er en åpen kildekode ett.
Abstract
Dissekere de nevrale og nevromuskulære kretser som regulerer atferd er fortsatt en stor utfordring i biologi. Den nematode Caenorhabditis elegans har vist seg å være en uvurderlig modellorganisme i å hjelpe til å takle denne utfordringen, fra inspirerende teknologiske tilnærminger, og bygge den menneskelige hjerne connectome, å faktisk belyse de spesifikke molekylære driverne av grunnleggende funksjonelle mønstre. Hovedtyngden av de atferdsmessige studier i C. elegans har blitt utført på faste underlag. I flytende, dyr utviser atferdsmønstre som inkluderer bevegelse i en rekke hastigheter i 3D, samt delvis kroppsbevegelser, for eksempel en posterior krøller uten anterior form for bevegelse, som introduserer nye utfordringer for kvantifisering. Trinnene i en enkel prosedyre, og bruk av en programvare som gir høy oppløsning analyse av C. elegans svømme atferd, blir presentert her. Programvaren, oppkalt Celest, bruker en spesialisert dataprogram som sporerflere dyr samtidig og gir nye tiltak av C. elegans bevegelse i væske (svømming). Tiltakene er hovedsakelig forankret i dyre holdning og basert på matematikk som brukes i maskinen visjon og mønstergjenkjenning, uten beregnings krav til terskel cut-offs. Programvaren verktøyet kan brukes til både å vurdere samlet svømming prowess i hundrevis av dyr fra kombin liten batch forsøk og for å avsløre nye fenotyper selv i godt karakterisert genetiske mutanter. Utarbeidelse av prøver for analyse med Celest er enkel og low-tech, slik bred tilrettelegging av det vitenskapelige samfunn. Bruk av beregnings tilnærmingen som er beskrevet her bør derfor bidra til større forståelse av atferd og atferds kretser i C. elegans modell.
Introduction
Definere hvordan genetikk, epigenetikk, erfaring og miljø påvirker atferd er en stor utfordring i moderne biologi. Enkle, genetisk mottagelig modeller som kan beregnings spores og målte kan ta viktige bidrag mot dette målet. De nematode Caenorhabditis elegans er en slik modell. Hensikten med denne artikkelen er å vise hvordan C. elegans svømming bevegelse kan spores og kvantifisert å hente ut informasjon om åtte nye funksjoner med biologisk relevans.
C. elegans har en forholdsvis kort levetid på ca 2 - 3 m og en reproduksjons periode på omtrent 4 d ved 20 ° C 1,2. I standard laboratorie kulturer, er dette mikroskopisk nematode dyrket på Petri plater som inneholder nematode Vekst Media (NGM) som er spredt med en bakteriell matkilde 3,4. WT N2 dyr bevege aktivt i elegante sinusbølger på agar-fylt plater; de endrer bevegelse rottees ved roaming (mat seeking), bolig (surfing), eller komme seg etter et måltid (inaktiv metthet quiescence) 5. Nedskrivning 6 eller alderen 7-12 kan også dramatisk endre bevegelse på tallerkener.
Gener som modulerer atferd, healthspan eller aldring, kan være funksjonelt preget av å analysere C. elegans bevegelsesmønstre eller bevegelse. En måte å måle healthspan er å klassifisere aldrende voksne inn i tre kategorier (f.eks, A, B og C) i henhold til deres bevegelse på platene, med sterk fysisk aktivitet som klasse A og lammelse blir klasse C 7,8,13. Selv om en slik kvalitativ sortering er nyttig for å avdekke forskjeller i fysisk form, kategoriene er bred uten klare grenser og dermed deres scoring er gjenstand for forskningsforventninger.
Et økende antall trackere har forhøyede objektivitet, raffinement, og presisjonen i analysen av C. elegans bevegelsepå faste medier 14-18. C. elegans bevegelse på platene er stort sett begrenset til det plan i hvilket dyret kommer i kontakt med den faste overflate av mediet. (C. elegans kan også indusere utforskning ved å løfte hodet vekk fra resten av kroppen som fortsatt er i kontakt med en fast overflate, plassering av legemet i flere plan. Dette er imidlertid uvanlig dette problemet.) Når det plasseres i væske, denne nematode initierer en undulatory bevegelse, eller svømming, som har mer omfattende dimensjonal bevegelse, et større spekter av fart og dybde av bevegelse, og en økt forekomst med alderen av fremre flytte forskjellig fra bakre forhold til dyr på faste overflater. Som en rask analyse av fysisk form og respons på nytt miljø, kan en eksperimentator plassere en enkelt dyr i en væske dråpe og scorer sitt hyppigheten av kroppen svinger under dissekere omfang. Videoopptak kan lette nåværende og fremtidige scorings over svømme kraft avdyr. Men den manuelle tilnærmingen begrenser antall funksjoner som kan skåres, og er fullt begrenset til scoring ett dyr om gangen.
Locomotion i væske er mindre utforsket enn locomotion på faste medier. Faktisk er det få programvare alternativer som er robuste og enkle å gjennomføre i laboratoriet for å måle bevegelse i væske 19-24. Programvaren Celest (C. elegans Swim Test) tilbyr enkelhet i bruk og matematiske baserte tiltak som leverer data (kurvatur scores) direkte relevant for innholdet i bevegelse 8; (detaljert beskrivelse av funksjoner og fordeler i Restif et al. 8). Videre gjør beregnings analyse klarlegging av fenotypiske egenskaper som er umulig for det menneskelige øyet å score. Her er data som eksemplifiserer oppløsningen av denne analysen tilnærming presentert og en enkel å implementere protokollen til å ta opp svømme prøvelser for påfølgende Celest analyse er beskrevet.
Protocol
1. nematode vekst og håndtering
- Grow C. elegans på standard Petri plater som inneholder NGM flekket med OP50-1 Escherichia coli som matkilde 1-3.
- Hold kulturer i en inkubator som opprettholder den ønskede temperatur. C. elegans vokser godt fra 15 til 25 ° C, med 20 ° C som den standard veksttemperatur.
MERK: Svømming er en robust fenotype, men svømme handlekraft kan påvirkes av miljøfaktorer, inkludert forurensning på tallerkener og overoppheting av kulturer og lysbilder. Sterke innsats for å opprettholde stabile forhold bør gjøres. - Bruk en hjemmelaget nematode hakke laget av en platinatråd flamme-forseglet i en glasstav for å håndtere overføring av enkelt dyr 4.
2. Sett opp for Swim Analysis
- Bruke et integrert system bestående av et stereomikroskop, digitalt CCD-kamera, og digital video-opptak programvare. Den Celest programvare can brukes på en separat datamaskin.
- Dekk mikroskop med en mørk klut (f.eks følte) for å hindre gjenskinn i svømme dråpe området på objektglass og forbedre bildekvaliteten.
- Juster mikroskop arbeids avstand og forstørrelse til full visning av svømme-området, og basen speilet for å få skarp kontrast til dyrene mot bakgrunnen. Sett belysning til mørk-feltet for å visualisere de likene av de voksne som hvit mot svart bakgrunn, noe som fungerer veldig bra for beregnings visualisering og sporing med svømmer analyseprogramvare.
- Vær nøye med å holde arbeidsområdet, objektglass, og svømme slippe veldig rent. Rusk kan forstyrre analysen av occluding gratis svømming for voksne, og tynne tråder av fiber kan oppdages som ikke-bevegelig dyr under sporing.
3. Animal Forberedelse for analyse av fysisk trening i væske
- Pipetter 60 mL of 1 x M9 buffer inn i en 10 mm ring forhåndstrykk på et objektglass. Pass på at fallet helt dekker innsiden området av ringen. Programvaren henter mer svømming informasjon ved hjelp av denne rulle størrelsen finnes på et lysbilde enn det ville gjort hvis utnytte multibrønnplater.
- Plukk enslige voksne nematoder og overføre dem til slipp av 1x M9 buffer, minimere transport av bakterier som kan sky væsken. Minimalisere bakterier ved først å plassere dyrene for overføring til en side av platen som ikke inneholder mye bakteriell plen, la dem gjennomgå, og deretter forsiktig løfte dem opp.
- Ved overføring av nematoder i rulle, bruker en dissekere omfang nær analysestasjonen for å redusere lengden på svømme tid, noe som kan påvirke oppførselen til dyrene 25.
- Plasser bare 4 voksne i rulle hvis de beveger seg kraftig, og krysse baner ofte. Som veiledning for å minimere overlapp svømmere (som forundrer beregningsanalyse), vurdere å plassere4 dyr pr fall når de er så aktive som unge, friske WT voksne og 5 dyr per dråpe når de blir eldre og vise mindre handlekraft.
MERK: Sunn WT nematoder instinktivt begynne å svømme snart etter å ha blitt plassert i væske. Ved hjelp av en nematode pick, forsiktig skille de voksne i rulle hvis de klumper seg.
4. Analyse av fysisk trening i Flytende - Video Recording of Swimming
- Plasser lysbildet lastet med voksne på bunnen av mikroskop for å spille inn sin svømming. 30 s videoer fange detaljer om en person dyrets oppførsel i væske (Video 1), og prøvetaking av et stort antall slike poster gjør du enkelt ved hjelp av Celest programvare 8,26; Men lenger svømme perioder kan være ideelt for andre spesifikke atferdsstudier 25. Viktigere, sørg for å opprettholde samme forstørrelse gjennom alle opptakene siden forstørrelse forskjeller affect svømming analyse og vilje skjevhet sammenligning.
MERK: Disse trinnene er gitt som veiledning ved hjelp av digital video-opptak programvare som er oppført i tabell for material; VirtualDub åpen tilgang til programvare kan erstatte, selv om vi ikke har testet dette.- Bruk følgende innstillinger som veiledning for vellykket svømmetur analyse: bildestørrelse på 696 x 520 piksler, bildeoppløsning på 0,02 mm / pixel, og en hastighet på 18 bilder / s. Høyere oppløsning versjoner av disse innstillingene kan legge til rette for sporing, men vil ikke påvirke tiltakene beregnet av programmet.
MERK: svømme sone gitt av 60 ul dråpe 1x M9 buffer på objektglass har ikke mye dybde, noe som minimerer oppover og nedover svømming bevegelse.
- Bruk følgende innstillinger som veiledning for vellykket svømmetur analyse: bildestørrelse på 696 x 520 piksler, bildeoppløsning på 0,02 mm / pixel, og en hastighet på 18 bilder / s. Høyere oppløsning versjoner av disse innstillingene kan legge til rette for sporing, men vil ikke påvirke tiltakene beregnet av programmet.
- Under Innstillinger, gå til "Opptak", sett "Limit Sequence Size" til "545 rammer på disk". Under samme posisjon, se 'Bruk Recording Manager "-boksen. Klikk på "Rediger gjeldende registding script ... "-knappen, og under" Kommandoer ", velg" Grab Frame ", og under" Stop betingelser ", skriv" Stopp etter 0: 00: 30,00 '.
- For å ta opp, velg "New Sequence i RAM 'under hjem overskriften, og trykk deretter på den røde opptaksknappen. Programvaren vil hente 545 rammer over 30 s med digitalt kamera og holde dem i RAM-minne.
5. Analyse av fysisk trening i Flytende - Video Treatment
- Fragmentere video i en sekvens av bilderammer ved å klikke hjem overskriften og velge "Export full sekvens til ..." i video-opptak programvare.
MERK: digital video-opptak programvare kan lagre rammene som .bmp, .jpg, .tif eller .png, som alle kan leses av svømme-analyseprogrammet presenteres her. Merk at TIF-filer bruker mer lagringsplass, men noen formater som JPG kan redusere bildekvaliteten. - Start svømmetur analyseprogram fra MATLAB by klikke Kjør-knappen.
- På startskjermen av svømme analyseprogrammet, bruker du "Legg til en video" eller "Legg til flere videoer 'knappene for å laste opp sekvenser av bilde rammer én om gangen eller i grupper mens knytter relevante merker som genotype, dato, trial og varighet . Programvaren oppretter en database av de merkede sekvensene.
- Aktiver samtidig sporing av flere dyr i de opplastede sekvenser ved å klikke på 'en. Process videoer '. I den nye skjermen, velger du de ønskede videoene i boksen til venstre og klikk 'Legg til listen'. For hver video, klikker du navnet øverst i høyre listen for å vise det første bildet av videoen nederst til høyre. Avgrense svømme sone ved å velge 3 poeng inne i ringen, og initiere behandling ved å klikke "Process alle videoene som er nevnt ovenfor '. Se fremdriften av behandlingen ved senteret bunnen.
- Etter fullført, 'Lukk' videobehandling skjermen.
6. Analyse av fysisk trening i væske - Måling
- Klikk på "2. Beregne tiltak "for å åpne en ny side der de bearbeidet videoer kan lastes opp, en om gangen, for å bekrefte eller avvise sporing av enkelt dyr. Videoer som har blitt behandlet vises i listen til venstre hvor videonavnet kan klikkes for å laste opp video.
- Bruk denne veiledningen steg for å fokusere på områder av tapte sporing (røde blokker) i motsetning til vellykket sporing (grønne blokker).
MERK: Alternativt kan man stole på automatisert produksjon av gyldig sporings siden programvaren har et robust system for sporing (94,1% gyldighet som ble observert i 2020 dyr fra 404 videoer 8).- Finn 'gyldighet segmentert kropp "i den første fargelinjen over skjermen i den nederste halvdelen. Prosentandelen av "Gyldige rammer 'er i grønt, og andelen av" Avviste rammer' er i rødt. ≥80% av gyldige rammer innebærer at sporing jegnformasjon brukes til å beregne tiltak kommer fra minst 432 rammer av 540 i en 30 s svømme prøve bokført til 18 bilder / s.
- Enkelt navigere og endre blokker av gyldig / avvist rammer utnytte «Neste blokk", "Switch gyldigheten ',' delt block ', og' Isolate ramme" alternativer. I sjeldne tilfelle at 2 dyr krysset stier i en urørte svømmetur sone, bytte sine identifikasjonsnummer over en bestemt bildeutvalg med "Switch" -knappen.
- Vis stolpediagrammene i nedre halvdel av skjermen for ytterligere informasjon om sporing og overlappende forestillinger. Lengden av den segmenterte legemet (dyrets kroppslengde per ramme) korrelerer med overlappende hendelser.
- Hvis noen lyspunkter på video forstyrre analysen, justere lyse områder i svømme-sonen ved å velge 'Glare soner "funksjon.
- Klikk på Lagre og Compute tiltak "for å lagre gyldighet innspill før opplasting annet behandlet video. På dette stadiet programvaren beregner, i bakgrunnen (ikke vist for brukeren), kurvatur kart over svømmetur ytelsen til enkelte dyr og parametrene angitt nedenfor (Video 2).
MERK: De målte parametre som er fokusert på her er beskrevet i Tabell 1. The Wave initiering rate, kropp bølge nummer, asymmetri, strekk, og curling er beregnet basert på krumningen kartene som programvaren beregner for dyrene; Kjørehastigheten, penselstrøk, og aktivitetsindeks parametere er ikke basert på krumn kart. - Klikk Lukk for å avslutte 'Compute tiltak "skjerm.
7. Analyse av fysisk trening i Flytende - Utgang av resultater
Merk: Programvaren kan rapportere på flere mål på svømmetur bevegelse, som dekker fra utilslørt til svært subtile atferdsmessige trekk ikke lett scoret av øyet (Videoer 3 og 4). herFokuset er på 8 parametere som vanligvis viser en god dynamisk omfang: Wave initiering rente, kropp bølge nummer, asymmetri, Strekk, Curling, kjørehastighet, penselstrøk, og aktivitetsindeks.
- På startskjermen av programmet, klikk på "tre. Vis treff "for å få analysen utgang.
- Opprett utvalgsgrupper for statistisk behandling ved å velge de ønskede analysert sekvenser av rammer i boksen til venstre og flytte dem inn i en ny eller eksisterende utvalgsgruppe ved å klikke på "Legg til valgt sample" eller "Legg til ny Sample" -knappene.
- Klikk "Vis grafer for disse prøvene" for å gå til en annen skjerm som viser grafer og nøkkeltall av prøvene for hver av de 8 parametere ved valg på toppen av skjermen.
- Hvis ønskelig kan du justere representasjon av søylediagrammer øverst til venstre på skjermen ved hjelp av 'Farger', '# av histogrammer' og '# av ormer' velgere.
- Bruk'2D histogrammer' å plotte kombinasjoner av eventuelle to parametere via "Mål på X-aksen" og "Mål på Y-aksen 'drop down menyer på venstre side av skjermen. Klikk Lukk for å avslutte og gå tilbake til "Vis resultater" skjerm.
- Bruk "Export ..." -knappen øverst til venstre på skjermen for å lagre detaljerte talldata som CSV-fil for å åpne og ytterligere manipulere i et regnearkprogram.
- 'Lukk' 'Vis resultater "skjermen for å gå tilbake til startskjermen, og klikk" Avslutt "for å sikre lagring av databasen som inneholder de analyserte videosekvenser.
Representative Results
Ved å analysere bevegelse i væske (svømming), kan fenotyper som ikke kommer klart fram på faste medier (krypende) bli belyst. For å kvantifisere svømming locomotion vi utviklet spesifikk programvare som måler ti nye parametre for svømmeatferd 8. De åtte mest nyttige av disse parametere er beskrevet i detalj i tabell 1. Disse parametrene er oppkalt Wave initiering rate, Body bølge nummer, Asymmetri, Stretch, Curling, kjørehastighet, penselstrøk, og aktivitet indeks. Studier eksemplifiserer kraften av programvaren har definert funksjonell nedgang av hundrevis av aldrende voksne med WT, atferds eller levetid mutant bakgrunn 8, og har analysert godt studert levetid mutanter alders 1 (hx546) og daƒ-16 (mgDƒ50), Disse inneholdt mutasjoner som forstyrrer den normale insulinsignalveien. Genet alder-1 koder for en phosphatidylinositide 3-kinase (PIK3) Katalytisk subenhet, og, når det havner mutasjonen hx546, fører levetid forlengelse og stresstoleranse 27-29. Genet daƒ-16 koder for en gaffelhodeboks O (FOXO) transkripsjonsfaktor som forkorter levetiden og svekker stress respons når slettet 30-33.
Enkelte parametere for svømming som Wave initiering hastighet, kjørehastighet, penselstrøk og aktivitet indeks sank gradvis med alderen selv i gunstige genetiske bakgrunn (figur 1). I tråd med dagens kunnskap, lang levetid alders 1 (hx546) mutanter viste en mer intens fysisk ytelse enn WT på avanserte og svært gamle tider. Også som forventet, vises kortvarige daƒ-16 (mgDƒ50) mutanter kompromittert ytelse, spesielt på ekstremt gamle aldre. Bemerkelsesverdig var det bare under gransking av Celest datamaskinen visjon og matematisk algoritme pakke som superior svømmetur resultatene av alders 1 (hx546) mutanter kunne påvises ved utbruddet av voksenlivet. Det faktum at alder-1 (hx546) resulterer i forbedret fysisk yteevne hos unge voksne liv tyder på at denne mutasjonen påvirker normal utvikling og / eller unge voksne fenotype på en måte som ikke tidligere er verdsatt (figur 1).
Body bølge nummer, asymmetri, Stretch, og Curling parametere tendert opp med alder i WT og aldring mutante voksne (figur 2). Interessant, oppløsningen nivået av programvaren viste finere atferdsmessige trekk som vedvarende symmetrien av alder-1 (hx546) mutanter i hele sin levetid, og den manglende evne av ekstreme gamle daƒ-16 (mgDƒ50) mutanter til å strekke og krølle opp i den grad at samme -age WT og alders 1 (hx546) voksne gjør.
I tillegg til den generelle uunngåelige tap av fysisk performance på grunn av alder, viser hver enkelt voksen et unikt mønster progresjon gjennom aldringsprosessen, selv når genetikk og miljø er tilnærmet homogene 7. (Ved å kontrollere genetikk og miljø, er de mulige konfunderende effekter av disse faktorene minimert, avslører den betydelige bidrag stochasticity til aldersrelatert degenerasjon.) En synkronisert C. elegans befolkningen i samme genetiske bakgrunn oppbevares i et kontrollert miljø fortsatt inneholder en blanding av forskjellige klasser av enkeltpersoner i henhold til sine aldrende særegenheter. Selv om alle starter som friske voksne, noen raskt miste sin fysiske form (dårlige ledere, klasse C), mens andre hevder kraft for lengre periode (grasiøs ledere, klasse A). Dårlige ledere dermed ut til å ha en betydelig kortere healthspan enn grasiøs ledere.
Som ytterligere beskrevet i vår studie 8, grasiøs ledere opprettholdt ungdommelig fysisk treness som observert ved sammenligning med svømmer profilen til mye yngre voksne (figur 3, 4 og 5). Denne vedvarende fitness er sammenlignbar med den fysiske utførelsen av langlivede alders 1 (hx546) mutanter på post-reproduktiv alder (D 11) (figur 1 og 2). Tvert imot, dårlige ledere dramatisk mistet mye av sin fysiske kapasitet snart etter reproduksjon, utføre på et nivå som ligner på de ekstreme gamle og progeric daƒ-16 (mgDƒ50) voksne (figur 1 - 4). Disse likhetene kan bli trukket av brutto sammenligning, men bestemte signaturer er lett merkbar ved en nærmere titt. For eksempel, selv om det er en viss sammenheng mellom graden av både strekk og krølling i ekstreme gamle vill type og aldring mutanter (figur 2), er dette forhold ikke er observert i dårlige ledere (figurene 4 og 5), noe som viser høyere tilbøyelighet til å krølle opp, menikke å strekke i prøvene som ble testet. Programvaren vi presenterer legger dermed dimensjon til analysen av fysisk form eller motorisk kapasitet ved å tilby verktøy for mer avanserte studier som ikke var medgjørlig før. Oppsummert gir Celest omfattende avlesninger i form av åtte nye tiltak fremhevet her, som definerer atferds fingeravtrykk av spesifikke genetiske, epigenetisk og miljøbakgrunn, slik at identifisering av unike og felles parameter mønstre som kan være underskriftene til spesifikke forhold ( miljømessige, farmakologiske, ernærings), biologiske prosesser, eller organisme stater som healthspan.
Figur 1: Celest Software Rapporter om Wave Initiation Rate (A), Activity Index (B), Brush Stroke (C) og kjørehastighet (D) for WT, alder-en (hx546), og daƒ-16 (mgDƒ50) Voksne på D 4 (ung voksen alder), 11 (post-reproduksjon) og 20 (ekstrem gammel). '#' I y-aksen betyr 'nummer'. WT er farget i grått, alder-en i grønt og daƒ-16 i rødt. Feilfelt er standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Samme alder WT og aldrings mutantene ble sammenlignet for statistisk signifikans ved hjelp av en enveis ANOVA fulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 i hvert datapunkt fra fire uavhengige forsøk. Merk at her, og for figur 2, er hver enkelt 30 s video laget med 4 dyr, og for hvert forsøk vi scorer totalt 16 dyr fra 4 svømme videoer, er dette gjort for 4 biologiske replikater for hvert datapunkt vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Programvare Rapporter om Body Wave Number (A), Asymmetri (B), Stretch (C), og Curling (D) for WT, alder-en (hx546) og daƒ-16 (mgDƒ50) Voksne på D 4 (unge voksen alder), 11 (post-reproduksjon) og 20 (ekstrem gammel). '#' I y-aksen betyr 'nummer'. WT er farget i grått, alder-en i grønt, og DAF-16 i rødt. Feilfelt er standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Samme alder WT og aldrings mutantene ble sammenlignet for statistisk signifikans ved hjelp av en enveis ANOVA fulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 i hver datapunkt fra fire uavhengige, 30 s svømme forsøk.e.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Programvare Rapporter om Wave Initiation Rate (A), Activity Index (B), Brush Stroke (C), og kjørehastighet (D) for unge WT voksne (D 4), og av samme alder Grasiøs og Bad Agere (D10 og 11). '#' I y-aksen betyr 'nummer'. Unge WT er farget i grått, klasse A grasiøs ledere i grønt, og klasse C dårlige ledere i rødt. Feilfelt er standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Klasse A grasiøs ledere og klasse C dårlige ledere ble sammenlignet med D 4 unge voksne ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multippel sammenligningstest. ****, P <0,0001. n = 27 i hver datapunkt fra to uavhengige, 30 s svømme forsøk. Graph er litt endret fra Restif et al. (2014) 8, som ble utgitt under Creative(CC BY) Commons Attribution-lisens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Programvare Rapporter om Body Wave Number (A), Asymmetri (B), og Curling (C) for Young WT voksne (D 4), og av samme alder grasiøs og dårlige Agere (D 10 og 11). '#' I y-aksen betyr 'nummer'. Unge WT er farget i grått, klasse A grasiøs ledere i grønne og klasse C dårlige ledere i rødt. Feilfelt er standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Klasse A grasiøs ledere og klasse C dårlige ledere ble sammenlignet med D 4 unge voksne ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multippel sammenligningstest. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001;
Figur 5: Programvare Rapport om Stretch for Young WT voksne (D 4), og av samme alder Grasiøs og Bad Agere (D 10 og 11). Unge WT er farget i grått, klasse A grasiøs ledere i grønne og klasse C dårlige ledere i rødt. Feilfelt er standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Klasse A grasiøs ledere og klasse C dårlige ledere ble sammenlignet med D 4 young voksne ved hjelp av en enveis ANOVA fulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. n = 27 i hvert datapunkt fra to uavhengige forsøk. Graph er litt endret fra Restif et al. (2014) 8, som ble publisert under (CC BY) Creative Commons Attribution-lisens http: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: Svømming av en representativ gruppe C. elegans voksne. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Celest Programvare Beregning av individuelle kurvatur Kart av svømme forestillinger av de testede dyr. Kurvatur kart er beregnet i bakgrunnen; de ikke vises i programvaren grensesnittet med brukeren. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3: Programvare beregning av svømme Tiltak basert på individuelle kurvatur Maps. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4: Programvare Beregning av Swim Tiltak som ikke stole på CurvatureMaps. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Discussion
Bruken av C. elegans som modellsystem fortsetter å øke på grunn av sin genetiske malleability, eksperimentell tractability og anatomi kommenterte til nitid detalj. For eksempel er neuronal struktur og tilkobling av C. elegans hermafroditt klart kartlagt 34-36, i stor grad legge til rette for undersøkelser av spesifikke nevronale kretser som styrer spesielle atferd. 302 nevroner utgjør voksen hermafroditt nervesystem, som behandler et bredt spekter av sanseinntrykk i grunnleggende atferds utganger som bevegelse. Strukturen av de mer komplekse hann nervesystemet er også blitt beskrevet 37, slik at kjønnsspesifikke krets som skal behandles. 37
C. elegans atferd har blitt grundig studert på standard kultur plater som inneholder faste medier. Siden WT C. elegans beveger seg i forutsigbare sinusbølger på agar-fylt plater, avvik fragenerelle mønsteret kan oppdages ved øyet og scoret manuelt. Denne tilnærmingen er imidlertid underlagt eksperimentators kriterium og er arbeidskrevende. Hardware og software verktøy utviklet for å spore og måle C. elegans locomotion på faste medier fjerne subjektiviteten skjevhet og gi rom for store studier, tillater mer avanserte biologiske spørsmål tas opp. Den nylige atferds database opprettet av Schafer lab 16 er et utmerket eksempel på den analytiske forlengelse og dybde som er oppnådd med et beregningssystem for locomotion på tallerkener.
Når WT C. elegans er plassert i væsken, tilpasser dyret raskt sin bevegelse til det nye miljøet, initiere en svømmetur. C. elegans svømming utnytter et større spekter av bevegelse enn krypende og kan være mer uregelmessig 8. Programvare som Celest er ment å fylle gapet for detaljert analyse av C. elegans atferd i væske, Permitte opp kvantifisering av motion-forbundet parametere som ikke er lett målt ved un assistert øye, eller som kan oppnås raskere enn manuell scoring. I åtte vanskelig h en person kan behandle opptil 200 videoer, ~ 1000 poster per dag.
Programvaren definerer svømming vurdere parametere som fungerer som en omfattende fingeravtrykk av fysisk form og atferd. I tillegg til berikende forståelse av komplekse fasetter av C. elegans atferd i flytende og deres underliggende molekylære stier, kan denne programvaren brukes til å utforske flere aspekter av biologi, inkludert farmakologiske tiltak, aldring og distinkt oppførsel. Presentert her, oversikt over de kvantifiserte endringer som skjer i den fysiske utførelsen av C. elegans voksne som de alder er ett eksempel på en slik anvendelse av programvaren (for en nærmere redegjørelse, se Restif et al. 8). I forbindelse med aldring, enkelte målte parametre avslått mensandre økt eller ikke konsekvent endring i villtypen. Trender ble bekreftet i stor grad av beregningsorientert profil levetid mutanter, og de relative profiler av grasiøs og dårlige Ager årskull av samme alder populasjoner holdt i ensartede miljøforhold. Den høye oppløsning av programvaren kan også avsløre subtile fenotyper tidligere ukjente i stor utstrekning karakterisert mutanter (for eksempel alder-1 (hx546) i figur 1).
Det er noen spesielt kritiske trinn i protokollen beskrevet. Opprettholde en konstant temperatur miljø mellom svømme miljøet og belastningen plate kultur er viktig for svømme reproduserbarhet, så forskere er sterkt oppfordret til å gå til store anstrengelser for å unngå tilfeldige temperaturendringer. Svømme media bør være på samme temperatur som platene. Likeledes vil nøye hensyn til dråpestørrelse svømme bidra til å sikre reproduserbarhet. Til slutt, er det klokt å tenke påavansere om lossing av de store videofiler som samler. Det anbefales å behandle bilder på et nettsted bortsett fra videoopptak datamaskin.
Bruken av programvaren som presenteres her for svømmetur analyse har visse begrensninger. Første, selv om programmene samtidig kan spore flere dyr, hvis mer enn fem dyr i fellesskap analysert, er det en økt mulighet for at dyrene skal svømme over hverandre i de videobilder. Når programmet kan ikke entydig bestemme hvilke dyr var som det sensurerer de datarammer. Selv om denne program-egenskap sikrer at data for individuelle dyr som er av høy kvalitet, det begrenser gjennomstrømningen. For det andre bør bildene være ganske ren, som er fri for støv, smuss og gjenskinn fra lys, som tilhørende signaler kan også forvirre bildeanalyse. Som nevnt i protokollen avsnitt 2.1.1, en svært low-tech investering som i stor grad kan hjelpe bildeopptak ved å eliminere komplikasjoner med svingninger in miljø belysning er å dekke sceneområdet med et mørkt stoff som ikke tillater omgivende lys som kommer til scenen. For det tredje er programmet optimalisert for dyr på voksne stadiet. Unge larver svømmer veldig fort og har små kropper, noe som øker programfeil. Fjerde, noen av programvaren bruker MATLAB, og når det er versjonsoppgraderinger og / eller oppgraderinger av operativsystemet, kan enkelte program linker bli forstyrret. Foreløpig er programvare optimalisert for bruk på MATLAB 2015b og Mac OS versjon 10.10, men vi forventer snart å publisere en programvareversjon som er mer robust mot slike endringer. Endelig kan videodatafiler blir store rask, og krever lagringsplass til å bli tildelt.
I sammendraget, som presenteres her er en enkel metode som lett kan implementeres av alle laboratorier, uten mye investering for å lage videoer av C. elegans svømming for Celest analyse. Funksjoner av programvarepakken inkluderer omfattende automatisering fra sporing gjennomanalyse, samtidig med flere dyr sporing, og bruk av matematiske baser (dvs. kurvatur tiltak) for kvantifisering av de fleste locomotion parametere. Programvaren er åpen kildekode, med kode og demoer offentlig tilgjengelig som beskrevet i Restif et al. 8. Selv om programmet har avansert datamaskin visjon analyse for sporing, andre publiserte sporingssystemer (f.eks Greenblum et al., 2014 38) er kompatible med parameteren analyse av programvare som presenteres her. Fremtidige forbedringer vil være rettet mot å konvertere programvaren til en mer robust pakke som ikke begrenser bruken til de spesifikke versjoner av operativsystemene som er nevnt ovenfor (også angitt i tabell for material).
Acknowledgments
Celest utvikling ble støttet av NIH tilskudd R21AG027513 og U01AG045864. Data- og noen korte video representasjoner er tilpasset fra Restif et al. (2014) 8, som ble utgitt under den (CC BY) Creative Commons Attribution-lisens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vi takker Ricardo Laranjeiro for manuskriptet hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans WT (ancestral). | |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
| OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
| Nematode Growth Medium (NGM) | For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| M9 buffer | For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| EQUIPMENT | |||
| CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
| MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
| Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
| Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
| Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |
References
- Brenner, S.
- Jove Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans (2016).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, T., Kim, J., Oldenbroek, M., Kerr, R., You, Y. J. ASI regulates satiety quiescence in C. elegans. J Neurosci. 33 (23), 9716-9724 (2013).
- Brown, A. E., Yemini, E. I., Grundy, L. J., Jucikas, T., Schafer, W. R. A dictionary of behavioral motifs reveals clusters of genes affecting Caenorhabditis elegans locomotion. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 791-796 (2013).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003702 (2014).
- Ibanez-Ventoso, C., et al. Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (3), 235-246 (2006).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat Commun. 6, 8919 (2015).
- Hsu, A. L., Feng, Z., Hsieh, M. Y., Xu, X. Z. Identification by machine vision of the rate of motor activity decline as a lifespan predictor in C. elegans. Neurobiol Aging. 30 (9), 1498-1503 (2009).
- Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
- Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N., Driscoll, M. In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 4 (3), 127-137 (2005).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS One. 8 (7), e69653 (2013).
- Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. J Vis Exp. (69), e4094 (2012).
- Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (5), 1539-1549 (2008).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Schreiber, M. A., Pierce-Shimomura, J. T., Chan, S., Parry, D., McIntire, S. L. Manipulation of behavioral decline in Caenorhabditis elegans with the Rag GTPase raga-1. PLoS Genet. 6 (5), e1000972 (2010).
- Fang-Yen, C., et al. Biomechanical analysis of gait adaptation in the nematode Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20323-20328 (2010).
- Buckingham, S. D., Partridge, F. A., Sattelle, D. B. Automated, high-throughput, motility analysis in Caenorhabditis elegans and parasitic nematodes: Applications in the search for new anthelmintics. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 4 (3), 226-232 (2014).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. J Exp Biol. 211 (Pt 23), 3703-3711 (2008).
- Restif, C., Ibanez-Ventoso, C., Driscoll, M., Metaxas, D. Tracking C. elegans swimming for high-throughput phenotyping. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1542-1548 (2011).
- Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
- Johnson, T. E., Tedesco, P. M., Lithgow, G. J. Comparing mutants, selective breeding, and transgenics in the dissection of aging processes of Caenorhabditis elegans. Genetica. 91 (1-3), 65-77 (1993).
- Morris, J. Z., Tissenbaum, H. A., Ruvkun, G. A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Nature. 382 (6591), 536-539 (1996).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Ogg, S., et al. The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Ziv, E., Hu, D. Genetic variation in insulin/IGF-1 signaling pathways and longevity. Ageing Res Rev. 10 (2), 201-204 (2011).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Varshney, L. R., Chen, B. L., Paniagua, E., Hall, D. H., Chklovskii, D. B. Structural properties of the Caenorhabditis elegans neuronal network. PLoS Comput Biol. 7 (2), e1001066 (2011).
- Jarrell, T. A., et al. The connectome of a decision-making neural network. Science. 337 (6093), 437-444 (2012).
- Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping. IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).
