Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Arbeta med Auditory HEI-OC1 celler

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Introduction

Hus Ear Institute-organ Corti en (HEI-OC1) celler är härledda från hörselorganet av en transgen mus 1,2. Inkubering av varje cell från denna transgena mus vid 33 ° C / 10% CO2 (tillåtliga betingelser) inducerar expression av en immortaliserande gen som utlöser de-differentiering och accelererad proliferation; flytta cellerna till 39 ° C / 5% CO2 (icke-tillåtande betingelser) leda till minskad proliferation, differentiering och, åtminstone i fallet med HEI-OC1, celldöd 2,3.

HEI-OC1 celler klenades och karakteriserades i vårt laboratorium över ett decennium sedan, och initiala studier visade att de uttrycker specifika markörer av cochlea hårceller, såsom Prestin, myosin 7a, Atoh1, BDNF, calbindin och calmodulin, men också markörer för att stödja celler såsom connexin 26 och fibroblasttillväxtfaktorreceptor (FGF-R) 2. Därför föreslogs det att HEI-OC1 kunde representera en common stamfader för sensoriska och stödjande celler i organ Corti 2. Parallella studier visade tydligt att arketypiska ototoxiska läkemedel som cisplatin, gentamicin och streptomycin inducerade kaspas-3-aktivering i dessa celler, medan droger anses icke-ototoxiska, som penicillin, inte 2,3. Därför var denna cellinje föreslås som ett in vitro-system för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i ototoxicitet och för screening av potentiella ototoxicitet eller otoprotective egenskaper hos nya farmakologiska läkemedel. Det uppskattas att HEI-OC1 celler har använts i mer än hundra och femtio studier som publicerats under de senaste tio åren.

Medan du tittar på den potentiella pro-apoptotiska effekten av olika läkemedel var viktigt mål för de flesta studier med denna cellinje har andra viktiga cellprocesser som autophagy och åldrande precis börjat utredas i HEI-OC1 celler 4-7. jagna färsk studie från vårt laboratorium 8 använde vi HEI-OC1 celler att samla en omfattande uppsättning data om celldöd, överlevnad, proliferation, åldrande och autophagy inducerad av olika farmakologiska läkemedel som ofta används vid kliniken. Vi jämförde också några av svaren från HEI-OC1-celler med de från HEK-293 (humana embryonala njurceller) och HeLa (humana epitelceller) som fick identisk behandling. Våra resultat indikerade att HEI-OC1-celler svarar på varje läkemedel på ett karakteristiskt sätt, med en distinkt dos- och tidsberoende känslighet för åtminstone en av de mekanismer som studeras. Vi betonade också i denna studie att en korrekt tolkning av de experimentella resultaten kommer att kräva att utföra parallella studier med mer än en teknik 8.

I en annan studie undersökte vi användning av HEI-OC1-celler för att utvärdera den funktionella responsen hos Prestin, motor proteinet av cochlea yttre hårceller (OHCs) 9 + K + ATPas, som translokeras från plasmamembranet till cytoplasman utan betydande förändringar i den totala celluttryck. Dessutom visade vi att P-HEI-OC1-celler har en robust NLC associerade till Prestin motorik, som minskade när densiteten hos Prestin molekyler som är närvarande vid plasmamembranet ökas. Sammantaget stöder dessa resultat starkt nyttan av HEI-OC1-celler för att undersöka hörsel proteiner.

I denna video artikeln beskriver vi hur kulturen HEI-OC1 celler, varför det är lämpligt att använda celler växer tillåtande betingelser (P-HEI-OC1) för cytotoxicitet studier, hur man ska värdera mekanismen / s av läkemedelsinducerad cytotoxicitet och hur för att utföra elektrofysiologiska studier (t.ex., patch-clamp, icke-linjär kapacitans (NLC)) för att undersöka funktionella egenskaperna hos Prestin, den molekylära motorn av cochlea OHCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellodling

Obs: Alla cellodlingsprotokoll måste utföras med lämpliga cellodlingstekniker (för referens se de 3 första kapitlen i cellbiologi: A Laboratory Handbook, Volume I 10). HEI-OC1-celler kräver inte någon ytterligare beläggning eller behandling av de cellodlingsskålar för korrekt vidhäftning och tillväxt. Mycket viktigt: Använd inte glas rätter för cellodlingsändamål; fenotypen och biologiska svaret hos cellerna till farmakologiska läkemedel kommer att ändras (G Kalinec & F Kalinec, opublicerad); konventionella plast cellodlingsskålar rekommenderas (se tabell av material / utrustning). Ägna särskild uppmärksamhet åt aseptisk teknik för att undvika föroreningar, men aldrig använda antibiotika (t.ex. ampicillin eller streptomycin) med HEI-OC1 celler. Om det behövs använder amfotericin B. Medan HeLa och HEK-293-celler har använts som kontroll i tidigare studier med HEI-OC1 8, någon annan cellinje kundevara acceptabla för detta ändamål.

  1. Återupplivning av Frozen HEI-OC1 celler
    Obs: Detta protokoll kan också användas med andra cellinjer från samma transgena möss som utvecklats i vårt laboratorium, såsom OC-K3, från organ Corti 11,12, och SV-k1, från stria vascularis 13,14.
    1. Ta en flaska med frysförvarade HEI-OC1 celler från flytande N2, och placera den i ett vattenbad vid 37 ° C. Dränka endast den nedre halvan av flaskan, och låt den tina tills endast en liten mängd is återstår i flaskan. Torka utsidan av flaskan med 70% alkohol.
    2. Pipettera cellerna från flaskan och leverera hela volymen (~ 1,5 x 10 5 celler / ml) långsamt, droppe för droppe, i en 15 ml koniskt rör innehållande 10 ml av en förvärmda tillväxtmedium, som Dulbeccos modifierade Eagles medium ( DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
    3. Avlägsna DMSO genom att centrifugera röret vid 300-500 xg under 5 minuter, och kasta bort than supematanten och återsuspendering av cellerna i 9 ml färskt tillväxtmedium (DMEM + 10% FBS). Disaggregera klumpar eller ark av celler genom flöde och återflöde av de suspenderade cellerna, från pipetten till mediet och vice-versa, tre till fyra gånger med spetsen på pipetten vidröra botten av röret.
    4. Placera den totala volymen av celler suspenderade i odlingsmedium i 100 mm diameter obehandlade, plast cellodlingsskålar.
    5. Inkubera cellerna vid 33 ° C med 10% CO2 (tillåtliga betingelser).
  2. Subkultur av HEI-OC1 celler
    Obs: Före sammanflytning (~ 80%) cellerna bör anpassas till fjädring och subodlades för att förhindra kulturen dör. Detta protokoll kan också användas tillsammans med andra cellinjer som utvecklats i vårt laboratorium från samma transgena musen, såsom OC-k3, från Cortis organ 11,12, och SV-k1, från stria vascularis 13,14.
    1. Ta bort gammalt medium och tvätta cellerna med 2 ml PBS. </ Li>
    2. Täcka cellmonoskiktet med en lösning av 0,25% trypsin, med användning av 1 ml per 25 cm 2 ytarea. Att gå vidare till nästa steg mer än 40% av cellerna måste tas bort. Undersöka celler med användning av ett inverterat mikroskop och, om nödvändigt, "smälla eller knacka" odlingsskålarna försiktigt för att frige alla eventuella återstående vidhäftade celler.
      Obs: Var försiktig som trypsinering under långa perioder kan orsaka celldöd; inte tillräckligt och de överförda cellerna kommer otillräcklig för de planerade studierna.
    3. Resuspendera cellerna, enligt det förfarande som beskrivs i 1.1.3, och överföra dem till en 15 ml koniska rör.
    4. Centrifugera i 5 minuter vid 300-500 xg, kassera mediet, samla cellerna med färskt tillväxtmedium och utsäde dem, åtminstone, fyra 100 mm diameter cellodlingsskålar. Antalet celler per skål kommer att bero på den mängd celler som återvunnits. Inkubera cellerna vid 33 ° C med 10% CO2 (P-HEI-OC1) och dividera igen så många gånger som behövs förde planerade experiment eller för att generera en ny lager.
    5. För mäldberedningen, byt 100 rätter mm diameter av 250 till 550 ml cellodlingsflaskor; för experiment, kan mindre rätter eller flera brunnar plattor vara mer adekvat.
    6. För differentiering, inkubera HEI-OC1 celler vid tillåtande betingelser tills de når ~ 80% konfluens; sedan flytta skålarna till 39 ° C med 5% CO2 (NP-HEI-OC1) under 2 till 3 veckor.
      Obs: Celler kommer successivt sluta prolifererande och döende. Ändra mediet varannan dag för att avlägsna döda celler. Beroende på det ursprungliga antalet celler, vanligen efter ~ 4 veckor inga fler celler kommer att vara tillgänglig för experiment. Differentieringen startar så snart som cellerna är placerade vid NP betingelser, men inte varje cell differentierar i samma takt. Viktigt är Prestin uttryck och membranlokaliserings ökar under differentieringsprocessen (se Representativa resultat Figur 4), vilket ger en kvalitativoch kvantitativ indikation på graden av differentiering.

2. Drug Cytotoxicitet Studies

Notera: HEI-OC1-celler odlade vid tillåtliga betingelser (P-HEI-OC1) rekommenderas för dessa studier (se Representativa resultat, figur 1).

  1. Cellviabilitet (MTT-analys)
    1. Samla P-HEI-OC1-celler genom att följa det förfarande som beskrivs i 1,2, och räkna dem med antingen en automatisk cellräknare eller hemocytometer. Justera koncentrationen till 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Ympa cellerna på 96-brunnars tydliga flatbottnade plattor (100 | il per brunn), inkubera över natten för fastsättning vid substratet, och sedan behandla dem med de läkemedel av intresse. Glöm inte att inkludera ämnen och icke-behandlade celler (kontroll)!
    3. Efter läkemedelsbehandling (vanligen 24 eller 48 h vid 33 ° C), utföra MTT-analysen genom att följa tillverkarens protokoll. I allmänhetProtokollen för denna analys har följande steg:
      1. Tillsätt 10 | il MTT-reagens till varje brunn.
      2. Inkubera plattan vid 37 ° C under 2-4 timmar tills lila färgen är synlig, och sedan lägga till 100 mikroliter av MTT Tvättmedel reagens till varje brunn. Skaka inte plattan.
      3. Täck plattan och lämna den i mörker under 2 till 4 h vid 37 ° C.
      4. Använd en mikroplattavläsare för att mäta absorbansen vid 570 nm i varje brunn, inklusive ämnena (enbart tillväxtmedium). Normalisera data med genomsnittliga OD i kontrollceller som 100% av lönsamheten.
  2. Caspase 3/7 aktiveringsanalys
    Obs: HEI-OC1 celler odlade vid tillåtande betingelser (P-HEI-OC1) rekommenderas för dessa studier.
    1. Samla HEI-OC1-celler genom att följa det förfarande som beskrivs i 1,2, och räkna dem med antingen en automatisk cellräknare eller en hemocytometer. Justera koncentrationen till 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Seed cellerna på WHite väggar 96-brunnars plattor (100 fil per brunn), inkubera över natten för fastsättning vid substratet, och sedan behandla dem med de läkemedel av intresse. Glöm inte att inkludera ämnen och icke-behandlade celler (kontroll)!
    3. Efter läkemedelsbehandling (vanligen 24 eller 48 timmar vid 33 ° C), utför kaspas-analysen efter respektive tillverkarens protokoll. I allmänhet, protokollen för denna analys har följande steg:
      1. Förbereda reagensen, blanda dem väl, och låta dem komma i jämvikt till rumstemperatur.
      2. Avlägsnande av cellerna från inkubatorn och tillåta plattorna att jämvikt vid rumstemperatur.
      3. Lägg den angivna mängden reagens till varje brunn, var noga med att undvika korskontaminering genom att inte röra brunnar innehållande olika prover med samma pipettspetsar.
      4. Täck plattan och blanda under 30 s med användning av en plattskakanordning vid 300-500 rpm.
      5. Inkubera plattan vid rumstemperatur under en period av åtminstone 30 min. fastställbarae optimal inkubationstid empiriskt. Om rumstemperaturen varierar använder en konstant temperatur inkubator, eftersom temperaturvariationer kommer att påverka luminiscens läsning.
      6. Mät luminiscens i varje brunn, och normalisera värden av genomsnittligt luminiscens i kontrollceller som 100% av caspase-aktivering.
  3. Celldelning (Proliferation)
    1. Samla HEI-OC1-celler genom att följa det förfarande som beskrivs i 1,2, och räkna dem med antingen en automatisk cellräknare eller en hemocytometer. Justera koncentrationen till 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Ympa cellerna på 96-brunnars tydliga flatbottnade plattor (100 | il per brunn), inkubera över natten vid tillåtliga betingelser för fastsättning vid substratet, och sedan behandla dem med de läkemedel av intresse. Glöm inte att inkludera ämnen och icke-behandlade celler (kontroll)!
    3. En timme efter behandling, lägga till varje brunn 1 pl beredd 100x BrdU (5-brom-2'-deoxyuridine) lösning, och återgå plattorna till inkubatorn vid 33 ° C.
    4. Efter 12, 24 och 48 timmar, ta bort den befintliga mediet från motsvarande plattor och tvätta varje brunn en gång med PBS.
    5. Utför cellprolifereringsanalys att följa tillverkarens protokoll. I allmänhet, protokollen för denna analys har följande steg:
      1. Förbereda reagensen, inklusive monterings / denatureringslösning, tvättbuffert, primär antikropp upptäckt lösning, sekundär detektionsantikropp lösning och BrdU-lösning såsom anges i tillverkarens protokoll.
      2. Tillsätt fixerings / denatureringslösning till varje brunn, i de mängder som anges i tillverkarens protokoll, och hålla plattan vid rumstemperatur i 30 minuter.
      3. Ta bort fäst / denatureringslösning och tillsätt den primära antikroppen vid den koncentration som anges i tillverkarens protokoll. Hålla plattan vid rumstemperatur under 1 timme.
      4. Ta bort lösningen med den primära antibody, tvätta plattan 3 gånger med tvättbuffert, och sedan lägga till den sekundära antikroppen vid den koncentration som anges i tillverkarens protokoll. Hålla plattan med den sekundära antikroppen vid rumstemperatur under 30 min.
      5. Ta bort lösningen med den sekundära antikroppen, tvätta plattan 3 gånger med tvättbuffert, och tillsätt substratet. Efter 10 min inkubation vid rumstemperatur, tillsätt STOP-lösning. Var försiktig: Styr färgförändring; Om lösningen blir mycket mörk, stoppa reaktionen före standardutvecklingstiden av 10 min.
      6. Läs absorbans vid 450 nm inom 30 minuter från tillsats av stopplösningen.
  4. cytotoxicitet
    Obs: HEI-OC1 celler odlade vid tillåtande betingelser (P-HEI-OC1) rekommenderas för dessa studier.
    1. Inkubera vid tillåtliga betingelser, vanligen under 24-48 h, HEI-OC1-celler i enbart cellodlingsmedium (kontroll) eller medium plus de läkemedel av intresse.
    2. Vid slutet av behandlingen, Tvätta cellerna tre gånger med PBS, och dra av med användning av 1 ml per 25 cm 2 ytarea av en icke-enzymatisk cell dissociationslösning under 3 min.
    3. Efter frånkoppling, samla in och pelletera cellerna genom centrifugering vid 3000 x g under 5 min, avlägsna supernatanten, och ge fläckar cellerna under 15 minuter i mörker med reagenset ingår i cytotoxicitetsanalysen.
    4. Bestämma antalet levande HEI-OC1 celler genom flödescytometri som anges av tillverkaren av flödescytometern.
  5. senescens
    1. Inkubera vid tillåtliga betingelser, vanligen under 24-48 h, HEI-OC1-celler i enbart cellodlingsmedium (kontroll) eller medium plus de läkemedel av intresse.
    2. Bestämma antalet åldrande associerade beta-galaktosidas-positiva celler med användning av flödescytometri med protokollet beskrivet av Debacq-Chainiaux et al. 15 eller annan metod som är känd för att ge tillförlitliga resultat. En kort protokoll för flödescytometri är följande:
        <li> Vid slutet av de experimentella behandlingar, tvätta cellerna tre gånger med PBS och sedan inkubera dem med 100 nM Bafilomycin A1 i cellodlingsmedium under 1 timme vid tillåtande betingelser.
      1. Lägga C12FDG vid en slutlig koncentration av ~ 33 ^ M, och fortsätta att inkubera cellerna under 1-2 timmar.
      2. Tvätta cellerna två gånger med PBS, skörda dem med användning av 1 ml per 25 cm 2 ytarea av en icke-enzymatisk cell dissociation lösning under 3 minuter, och pelletera dem genom centrifugering vid 3000 x g under 5 min.
      3. Resuspendera cellerna i iskallt PBS och bestämma antalet positiva HEI-OC1-celler genom flödescytometri såsom anges av tillverkaren av flödescytometer.
  6. autophagy
    1. Samla HEI-OC1-celler kontrollera och svalt (berövas serum under 48 timmar) genom att följa det förfarande som beskrivs i 1,2, och behandla dem för Western blöt genom att följa standardprotokoll. I allmänhet, protokollen för Western blot ha följande steps:
      1. Seed HEI-OC1-celler i 6-brunnsplattor vid en koncentration av 1,0 x 10 5 celler / ml. Efter 24 och / eller 48 h, tvätta cellerna med iskall PBS.
      2. Lysera med 200 | il av TNESV-buffert (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) med proteasinhibitorcocktail och 1 mM PMSF under 5 min på is.
      3. Samla upp cellerna (genom skrapning ner i varje brunn), överföring till mikrocentrifugrör och centrifugera vid 16800 xg under 5 min vid 4 ° C.
      4. Samla supernatanterna och kvantifiera proteinkoncentration med användning av BCA-analys.
      5. Lägga 5x laddningsbuffert och 1 mM DTT till varje prov och koka i 5 min för att denaturera proteinerna.
      6. Kör prover med SDS-PAGE på en 4-12% gel, och överföring till PVDF-membran.
      7. Blockera membranen med 5% fettfri torrmjölk i TBS-T med 0,1% Tween 20 under 60 min vid RT.
      8. Inkubera membranen över natt vid 4 ° C med primära antibodies.
      9. Nästa dag, tvätta membranen extensivt med TBS-T, och inkubera med en sekundär IgG-antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas (HRP) (1: 1500) under 1 timme.
      10. Identifiera immunreaktivitet med en förstärkt kemiluminescens (ECL) detekteringssystemet. Normalisera proteinuttrycksnivåer med hjälp av GAPDH (1: 2000 i TBS-T med i 10% fettfri torrmjölk) som standard.
    2. I Western blöts undersöka uttrycket av åtminstone två olika markörer av autophagy såsom Beclin-1 och LC3B (vanligtvis vid en: 1000 utspädning i TBS-T med 2,5% BSA). Glöm inte att leta efter en kontroll av proteinuttryck såsom GAPDH eller aktin.
    3. Utvärdera uttrycket av proteinet av intresse genom densitometri med hjälp av en digital Blot scanner eller datorprogram som allmän egendom NIH bild eller ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Elektrofysiologi Experiment med HEI-OC1 Celler

  1. skörd av celler
    Obs: Använd celler växer i 100 mm diameter odlingsskålar på 50% -80% konfluens. Trypsin, Accutase, enzym fri lösning eller p hosphate- b uffered s aline + e thylene d iamine t Etra en cetic syra (PBS-EDTA) kan användas för att lyfta cellerna utan signifikanta effekter på antalet och kvaliteten på gigatätningar . I vissa fall gör dock trypsinbehandling cellerna skörare. I dessa fall tillåta cellerna att återhämta sig under approximativt 30 minuter innan experimenten.
    1. Tvätta cellerna två gånger med 10 ml PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +.
    2. Tillsätt 2 ml av en enzymfria borttagningslösning, såsom icke-enzymatisk cell dissociation lösning och inkubera disken under 3 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
    3. Använda ett inverterat mikroskop för att kontrollera att cellerna lossnar. Om det behövs, flytta cell odlingsskål att lösgöra fler celler, men gör det försiktigt.
      Obs! Skaka inte skålen.
    4. Tillsätt 10 ml DMEM + 10% FBS och pipett cellerna försiktigt upp och ned fem gånger med en 10-ml pipett.
    5. Titta på cellerna under ett mikroskop. Om> 80% av cellerna redan separerade (singel), behövs ingen ytterligare pipettering. Om cellerna är fortfarande i kluster, upprepa försiktigt pipettera tills mer än 80% celler är singel.
    6. Placera ~ 10 ml av suspenderade celler i en 15 ml koniskt rör, centrifugera i 2 minuter vid 100 xg, och kassera supernatanten.
    7. Använd ~ 200 pl externa inspelningslösning (Leibovitz L-15-medium justerades till 305-310 mOsm med destillerat vatten) för att resuspendera cellerna. En optisk kontroll av cellerna ska visa många ensamstående, runda celler med släta membran kanter.
  2. Patch-clamp och NLC Mätningar
    1. Utför patch-clamp och mätningar av spänningsberoende icke-linjär kapacitans (NLC) med endequate förstärkare och mjukvara, samt standardelektrofysiologiska tekniker. Som inre (intrapipette) lösning användning 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na, och 10 mM HEPES; justera pH till 7,2 med Tris.
    2. Under mikroskop, välj en enda frisk cell, med runda och mjuka membran kanter. Fästa spetsen på glaspipett till cellytan och kontrollera membranets motstånd. Detta bör vara cirka 3-6 megaohm, motsvarande en inre diameter (ID) av spetsen av pipetten på ~ 2 | j, m.
    3. Tryck försiktigt mikropipett spets mot cellplasmamembranet och sedan använda sug. En del av cellmembranet kommer att sugas in i pipetten, vilket genererar en elektrisk resistans i storleksordningen 10 - 100 gigaOhms (gigatätning).
    4. Etablera helcell-tillstånd genom att störa plasmamembranet med sugpulser.
    5. Använda celler som inte uttrycker Prestin, såsom HEK-293, som en kontroll 9.
      Obs: Aktuellt svar bör filtreras vid 5 kHz, och korrigeringar för effekterna av rest serieresistans. kan utföras insamling alla uppgifter och de flesta analyser med hjälp av programvaran vanligtvis medföljer lås-förstärkare. Kapacitans funktion kan monteras på den första derivatan av en två tillstånd Boltzmann funktion som relaterar olinjär laddning till membranspänning 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I ett par av de senaste publikationer rapporterade vi en omfattande uppsättning studier som syftar till att utvärdera svaret från HEI-OC1 celler till flera vanliga farmakologiska narkotika samt undersöka Prestin funktion 8,9. I dessa studier gjorde vi användning av alla de protokoll som beskrivs i tidigare avsnitt.

Ett av resultaten av dessa tidigare studier var att HEI-OC1-celler odlades vid icke tillåtliga betingelser (39 ° C / 10% CO2 = NP-HEI-OC1) visade en mycket signifikant minskning i cellviabilitet, och en lika signifikant ökning i celldöd, när det gäller celler odlade vid tillåtliga betingelser (33 ° C / 10% CO2 = P-HEI-OC1) (Figur 1). Därför utförde någon cytotoxicitet studie NP-HEI-OC1 celler bör ägna avsevärda ansträngningar i diskriminerande läkemedelseffekter från effekterna av odlingsbetingelser. Förutom skrivbn, eftersom läkemedelseffekter på celler som redan döende eller med en minskad lönsamhet kan skilja sig att effekterna av samma läkemedel på friska celler, rekommenderar vi att du använder P-HEI-OC1 celler för experiment som inte specifikt kräver differentierade celler.

Våra studier på effekten av olika farmakologiska läkemedel producerade också intressanta resultat. Till exempel, cisplatin, ett kemoterapeutiskt medel som ofta används för behandling av flera humana maligniteter, och paracetamol (APAP = N- en cetyl- pa ra-amino p henol), den mest sålda over-the-counter smärtstillande medel i USA, var både giftiga för HEI-OC1 celler (Figur 2). Men medan APAP minskade cellviabilitet och ökad kaspas 3/7 aktivering, det inducerade inte celldöd. Cisplatin, däremot ökat markant de tre svar (Figur 2). Intressant nog kaspaser 3/7 var mostly aktiveras vid lägre cisplatin koncentrationer, vilket antyder att celldöd inducerad av låga doser av cisplatin troligen förmedlad genom apoptos, medan höga doser dödliga effekter skulle kunna förknippas med oncosis / necroptosis. Medan oncosis har definierats som en pre-dödlig väg som leder till oreglerad celldöd åtföljs av cellulär och organell svullnad, blåsbildning, och ökad membranpermeabilitet 17,18, är necroptosis ett reglerat icke-apoptotisk celldöd mekanism aktiveras av samma stimuli som initierar apoptos men med morfologiska egenskaper som liknar dem i oncosis 19-22.

Ytterligare studier som syftar till att undersöka effekterna av AP AP och cisplatin på P-HEI-OC1 celler visade en tydlig, dosberoende effekt av APAP på celltillväxt som kan förklara spännande minskning av cellviabilitet utan celldöd som beskrivs i föregående stycke (Figur 3A). cisplatin als o minskad cellproliferation, och dess effekt kompletteras med tiden för exponering även för små doser (figur 3A), men dessutom minskade senescens vid alla koncentrationer och tid-punkter som ingår i vår studie (figur 3B). Den avsevärda minskningen av cellåldrande inducerad av cisplatin kunde förklaras av den ökning av celldöd, under antagande att åldrande celler skulle vara, förmodligen, benägna att dö snabbare än friska celler 23.

Viktigare är att dessa representativa resultat tyder på att HEI-OC1-celler svarar på olika farmakologiska läkemedel med en distinkt dos- och tidsberoende känslighet för åtminstone en av de mekanismer som studeras. Därför kommer en korrekt tolkning av något experimentellt resultat kräver en tydlig förståelse av de särskilda cellulära processer undersökta och de uppgifter som var och en av de tekniker som används för att utvärdera dem.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Confocal och flödescytometri experiment, å andra sidan, bekräftade Prestin expression i P-HEI-OC1 och NP-HEI-OC1-celler, med Prestin immunolocalizing mestadels på cytoplasman hos P-HEI-OC1-celler (figur 4A, pilar), och mer koncentrerad vid plasmamembranet i NP-HEI-OC1-celler (figur 4B, pilar). Flödescytometri studier visade en tydlig ökning av Prestin expression i NP-HEI -OC1 celler respektera till P-HEI-OC1-celler (figurerna 4C och 4D). antyder Den tidsberoende ökning i uttryck och plasmamembranlokalisering av Prestin i NP-HEI-OC1 celler som transloka åtföljdes av syntesen av fler Prestin molekyler. Men dessa försök inte ge ledtrådar för att avgöra huruvida Prestin molekyler som ursprungligen finns i cytoplasman flytta till plasmamembranet och nya molekyler ersätta dem, om de förblir i cytoplasman och endast den nya synthesized Prestin rör sig till plasmamembranet, eller en kombination av båda processerna.

Elektrofysiologiska studier visade en robust NLC i P-HEI-OC1-celler (figur 5B), med ett toppvärde som minskade och en spänning vid topp kapacitans som skiftas till mer depolariserade värden, när cellerna flyttades till icke tillåtliga betingelser för en och 2 veckor (fig 5C och 5D). På grund av den progressiva translokeringen av Prestin från cytoplasman till plasmamembranet, ursprungligen hypotes vi att NLC skulle vara högre i NP-HEI-OC1 än i P-HEI-OC1-celler, och att det ytterligare skulle öka med tiden för inkubation vid NP betingelser. Överraskande, resultaten av våra studier visade exakt emot svaret. Vi spekulerade att ökningen i densiteten för Prestin molekyler i plasmamembranet skulle kunna begränsa deras motoriska funktionerna.

hin-page = "1"> Notera i figur 5 depolarisationen av spänningen på topp kapacitans i HEI-OC1 celler respekterar de typiska värden som rapporteras i OHCs och i transfekterade HEK293-celler 24; Dessutom konstatera att den depolariserande skift ökar med tiden på NP förhållanden. Den gradvisa depolariserande skift liknar det som beskrivs i OHCs under mus och råtta utveckling 25,26, och det hade föreslagit att det kan vara relaterat till utvecklingen av andra cellstrukturer i samband med OHC s plasmamembranet 25, eller en mognadsprocess inneboende att Prestin 24.

Vi hoppas att denna korta omräkning av ett fåtal studier med HEI-OC1 celler ger tillräckligt med bevis för den potentiella nyttan av HEI-OC1 celler för att undersöka ett brett spektrum av cell- och molekylär svar.

ad / 54.425 / 54425fig1.jpg "/>
Figur 1: cellviabilitet och celldöd i P-HEI-OC1 och NP-HEI-OC1 celler. (A) Cellviabilitet utvärderades med MTT-analysen. Absorbansen mättes med en plattläsare, och den genomsnittliga OD i kontrollceller togs som 100% av viabilitet. (B) Celldöd utvärderades med en cytotoxicitetsanalys. Antalet positiva (döda) celler bestämdes genom flödescytometri med 488 nm excitation (blå laser) och FL1: 530 15 nm. Notera den mycket signifikant (P ≤0.001) minskning i cellviabilitet (A) och ökning av celldöd (B) som induceras av icke-tillåtande betingelser. Staplarna representerar standardfel av medel (SEM). Modifierad från referens 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

</ Html"Figur 2" src = "/ filer / ftp_upload / 54.425 / 54425fig2.jpg" />
Figur 2:. Svaren i HEI-OC1 celler exponerade för AP AP och cisplatin vid analys med MTT, Kaspaser 3/7 och cytotoxicitetsanalyser (A) Cellviabilitet utvärderades med MTT-analysen, och absorbansen mättes med en plattläsare. (B) Aktivering av bödel kaspaser 3/7. (C) Drog - inducerad celldöd utvärderades med en cytotoxicitet; antalet positiva (döda) celler bestämdes genom flödescytometri. Data i varje experiment normaliserades till respektive kontrollförhållanden (kontroll = 1) för att möjliggöra samtidig statistisk analys. * = P ≤0.05 avseende på kontroll. Staplarna representerar standardfel av medel (SEM). Modifierad fromreference 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Effekter av AP AP och cisplatin på HEI-OC1 Cells mitoshastighet och åldras. (A) Droginducerade ändringar på graden av mitotiska delning av HEI-OC1-celler, vid 24 och 48 h, utvärderades med en BrdU-analys. (B) Läkemedelsinducerad senescens i HEI-OC1-celler mättes genom flödescytometri och senescence- tillhörande β-galaktosidas (SA-Bgal) teknik. Data i varje experiment normaliserades till respektive kontrollförhållanden (kontroll = 1) för att möjliggöra samtidig statistisk analys. * = P ≤0.05 avseende på kontroll. Staplarna representerar standardfel av medel (SEM). Modifierad fromreference 8. Klicka här för att se en större version av thans gestalt.

figur 4
Figur 4:. Prestin Expression i P-HEI-OC1 och NP-HEI-OC1 Celler - celler märktes med Anti-Prestin Antikropp och observeras av konfokalmikroskopi och flödescytometri (A) I P-HEI-OC1-celler Prestin immunolocalized mestadels på cytoplasman (pilar). (B) I NP-HEI-OC1-celler, i motsats härtill var Prestin reaktivitet koncentrerades vid plasmamembranet (pilar). (C och D) Flödescytometri studier i HEI-OC1-celler odlade i 2 veckor på NP betingelser (D) visade en tydlig ökning av Prestin uttryck avseende på P-HEI-OC1-celler (C). (C) Inset är sekundär ab endast (negativ kontroll). Modifierad från referens 9.Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: NLC studier i P-HEI-OC1 och NP-HEI-OC1 celler (A) Patch-fastklämd HEI-OC1 cell.. (B - D) NLC i P-HEI-OC1 och NP-HEI-OC1 celler. Notera minskningen i topp på NLC och den gradvisa förskjutning av kurvorna till mer depolariserade värden i NP-HEI-OC1 celler. Modifierad från referens 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna rapport beskriver vi hur kulturen HEI-OC1 celler och använda dem för att utvärdera mekanismerna för läkemedelsinducerad cytotoxicitet och att undersöka funktionella egenskaper Prestin, molekylär motor cochlea OHCs. De tekniska förfaranden är dock allmänt nog att enkelt anpassas till olika studier.

Alla protokoll som beskrivs här kräver korrekt användning av väletablerade cellodlingsteknik 10. Precis som med alla andra cellinje, som arbetar med HEI-OC1 celler kräver en korrekt utrustad cellodlingsanläggning, med en certifierad biologiskt säkerhetsskåp, en kyld centrifug, ett vattenbad och en inverterat mikroskop för undersökning av cellkulturer och för att räkna celler om man använder hemocytometric tekniker. En unik krav är dock är tillgången på två fuktade inkubatorer, en uppsättning vid 33 ° C / 10% CO2 under P-HEI-OC1-celler och andra vid 39 ° C / 5% CO2 under NP-HEI-OC1-cells. Om de planerade studierna innebär endast P-HEI-OC1 celler, kan andra inkubatorn ställas in på 37 ° C / 5% CO2 för olika analyser.

Användningen av plast cellodlingsskålar är en viktig ytterligare förutsättning för att arbeta med HEI-OC1 celler. I själva verket, HEI-OC1 celler är mycket robust och de kommer tillväxten i olika ytor och under mycket olika förhållanden. Men kommer deras fenotyp och deras svar på läkemedel och andra stimuli starkt beroende på odlingsparametrarna (G Kalinec & F Kalinec, opublicerad). Som vi argumenterade i en tidigare uppsats 8, kan denna plasticitet i HEI-OC1-celler med fördel användas för att utforma nya experiment. Till exempel, är det väl känt att syrespänningen i cochlea perilymfa är mycket lägre (~ 2 kPa) än i en typisk inkubator vid havsnivå (~ 21,3 kPa) 27. Inkubation HEI-OC1 celler vid lägre O 2 halter kommer att ändra sina svar, kanske gör dem en bättre modell för revisionORY sensoriska celler.

Det bör betonas att de beskrivna protokollen för kultur och subkultur av HEI-OC1-celler också kan användas med andra hörsel cellinjer som utvecklats i vårt laboratorium från samma transgena musen, såsom OC-k3 från Cortis organ 11,12 och SV -K1 från stria vascularis 13,14. Dessutom kan dessa cellinjer vara användbara som kontroll för HEI-OC1 celler i utvalda experiment. Till exempel, har vi nyligen använt SV-K1-celler för att visa att den omvänt proportionellt immunoreaktivitet att Prestin och Na + K + ATPas-antikroppar vid plasmamembranet i HEI-OC1-celler var celltyp beroende respons snarare än i samband med den transgena musen från vilken dessa celler var härledda 9.

Andra kritiska krav för att arbeta med HEI-OC1 celler är det praxis att lämpliga aseptiska tekniker såsom rengöring av alla ytor inom säkerhetsskåpet med 70% ethanol eller isopropanol och sanering av material som krävs för förfaranden. Men medan andra däggdjurscellinjer ofta skyddas mot oavsiktlig bakteriekontamination genom att använda penicillin-streptomycin eller andra liknande kombinationer, antibiotika får aldrig användas med HEI-OC1 celler utom om syftet med studien är att undersöka deras effekter. HEI-OC1 celler genererades i antibiotikafria betingelser, och de måste undvikas för att minska uppkomsten av antibiotikaresistenta celler.

Slutligen vill vi åter betona en punkt som redan nämnts flera gånger i denna rapport: fenotypen och svaret från HEI-OC1 celler till droger och andra stimuli kommer starkt beroende på odlingsparametrarna. Därför är det mycket viktigt att de laboratorier som arbetar med HEI-OC1 celler använder liknande protokoll och cellodlingsbetingelser för att göra sina resultat riktigt jämförbara med dem som tillhandahålls av andra grupper. Dessutom är detmycket viktigt att komma ihåg att HEI-OC1 cellinje är bara en modell, med alla de begränsningar som en modell har. Förväntar sig att in vitro-experiment med HEI-OC1 celler kommer att ge uppgifter korrekt representerar svaren från verkliga hörselsinnesceller in vivo är orealistiskt. Vi tror dock starkt HEI-OC1 cellinje är en användbar modell för att undersöka funktionella svar av hörsel sensoriska celler och screening av den potentiella ototoxicitet av farmakologiska läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Tags

Cellulär Biology HEI-OC1-celler cellodling cytotoxicitet celldöd cellviabilitet cellåldrande Autophagy. FACS Prestin motorik patch-clamp icke-linjär kapacitans
Arbeta med Auditory HEI-OC1 celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., … More

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter