Summary
쥐의 transurethral 도관 법의 설립된 모델 등 요로 감염, 방광 병 리의 연구를 허용 하지만 여성에서 수행할 수 있습니다. 여기, 남성 transurethral 주입의 새로운 모델에는 남녀 간의 강한 임상 및 역학 다름에 의해 표시 된 지역에 연구 수 있게 된다.
Abstract
요로 감염 (UTI)는 매우 일반적인 전세계 중요 한 병 적 상태 및 의료 관련 비용을 들이지. 정확 하 게 반영 질병 및 진행, 작은 동물 모델, 호스트 병원 체 상호 작용의 해 부 및 감염에 면역의 생성을 허용 합니다. 마우스에서 uropathogenic 대장균, 커뮤니티의 85% 이상에서 원인이 되는 대리인의 intravesical 점 획득 요로 감염, 인간에서 관찰 된 감염의 단계의 많은. 그러나 최근 까지는,, 요로 수만 모델링 여성 동물에서. 이 제한 요로 감염, 암 등 다른 방광 병 리에 있는 성 관련 된 다름의 연구를 방해 했다. 여기, 우리는 여성 및 남성 동물 사이의 직접 비교를 허용 하는 남성 쥐를 주입 시키고 cytometry 방광 조직 감염 호스트 응답을 이해 하는 수단으로 평가 하는 상세한 프로토콜을 제공 하는 방법을 설명 합니다. 함께, 이러한 접근은 요로 감염 및 기타 방광 관련 질병에서 관찰 하는 섹스 편견을 호스트 요인의 식별에 도움이 됩니다.
Introduction
요로 감염 (UTI) 선진국1에서 가장 일반적인 감염 중 하나입니다. 감염 속도가 여성 및 신생아 및 노인2중 남성 사이 유사 하다. 그러나 Premenopausal 성인 여성,, 남자2,3에 비해 지역사회 획득 요로 감염의 발생률이 크게 증가 했습니다. 이 질병은 주로 여성 영향, 그 기본 및 임상 연구는 압도적으로 여성에서 요로 감염에 집중. 그러나, 남자에 요는 중요 하 고 understudied 의료 도전4. 실제로, 남자에 요 더 높은 사망률과 관련 있기 때문에,이 감염은 복잡 한4,5정기적으로 정의 됩니다.
생리학과 병 리에 섹스 편견의 중심 역할에 대 한 우리의 이해 발전, 새로운 메서드는 질병의이 이전 무시 측면을 탐구 하는 데 필요한. 성 차이에서 역할을 필수적인 면역과 감염; 여성 남성은 결핵, 말라리아, 에이즈6,7등 특정 감염에 더 취약 하는 동안 자기 면역 질환의 발생률이 높은 있다. 방광 암, 다른 비뇨기과 병 리, 여성 보다 남성에서 훨씬 더 널리 이며 여러 연구 androgens에 대 한 역할 종은8,,910,11의 개발에 ,12. 그러나 특히,, intravesical 방광 암에 대 한 치료의 조사 여성 동물, 반복적으로 남성 쥐13catheterize 하는 무 능력 때문에 독점적으로 수행 됩니다.
요로 감염 병의 연구 감염 (예를 들어, 쥐 및 쥐)의 설치류 모델에 크게 의존합니다. 요로 감염의 murine 모델을 고용할 수 있습니다 uropathogens 원래에서 고립 된 uropathogenic 대장균 (UPEC) 같은 인간 감염 Klebsiella, Enterococcus, 황색또는 프로 테우 스14. 일반적으로 박테리아의 요도 도관 법을 통해 방광으로 소개 된다. 감염, 방광 및 신장 감염, 세균성 식민, 조직 손상, 또는 호스트 면역 응답15,16등의 특정 매개 변수를 평가 하기 위해 제거할 수 있습니다. 그러나 보편적으로,, 여성 동물만 요로 연구에 사용 됩니다. 실제로, 많은 연구, 해 부의 이유로 남성 생쥐의 catheterization 아니다 가능13,17,,1819지적 했다. 더 최근에, 남성 주입 하는 수술 접근 방식을 설명 하 고에서 복 열, 방광, 복 부에 있는 개통에 부드러운 압력을 적용 하 여 외부에서 난민은 고 박테리아는20방광 주입. 이 방법은 외 과적 수술 비용 남성 감염 수 있습니다. 따라서,이 방법의 주요 경고21절 개는 항 염증 성 상처 치유 응답을 유도 하기 위해 잠재력 등 감염의 결과에서 염증의 영향을 포함 한다. 우리의 취미 성 질병에 대 한 응답에서 바이어스를 이해, 우리가 더 오래 된 비 수술 transurethral 접근 여성 설치류22에에서 사용 일치 남성 생쥐에서 세균성 intravesical 주입 하는 방법 개발 .
우리의 모델 설립된 방법에 따라 작성 하 고 직접 암컷과 수 컷 동물에 감염에 호스트 면역 반응을 비교 하는 기능을 제공 합니다. 이 방법은 감염에 섹스 기반 차이의 해 부를 허용 하 고 잠재적으로 민감성의 발음된 차이에 분자 및 세포 단서와 남녀 간의 감염에 응답을 제공. 또한,이 모델은 요로 감염 연구, 방광 암, 전립선, 아래 또는 초과 active 방광 증후군, 간 질 성 방광염 등 방광 관련 된 다른 질병을 조사 하는 모델의 설립 허용을 넘어 가치.
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Protocol
마우스 실험 위원회 회의 d 프로토콜 번호 2012-0024의 승인에 따라 실시 했다 ' éthique en expérimentation animale 파리 센터 동부 유럽 지침 2010/63의 응용 프로그램에서 수 드 (동물 실험의 윤리 위원회) 유럽 연합입니다.
1입니다. 카 테 터의 준비
- 한 소아 정 맥 접근 정 감염 되는 쥐의 각 그룹에 대 한 준비. 제조업체에서 지시 inbuilt 스프링 메커니즘을 사용 하는 바늘의 각 정 박탈. 바늘만 플라스틱 정 맥 정 맥 보존을 삭제 합니다.
- 한 자외선 (U.V.) 주기, 일반적으로 25-30 분에 대 한 층 류 두건에 카 테 터를 소독.
그러나 참고: 카 실험 그룹, 남녀, 또는 세균성 긴장 사이 새로운 카 테 터를 사용 해야 하는 더 이상 마우스에 대 한 사용할 수 있습니다.
2. 준비 Uropathogenic 대장균 의 감염에 대 한
- 최소 2 일 전에 행진 UPEC Luria 국물 (파운드) 한 천 격판덮개에 냉동된 세균성 주식에서 무 균 접종 루프를 사용 하 여 감염 경우 적절 한 항생제를 포함. 37 ° C에서 밤새 품 어. 플레이트 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.
- 100 ml 무 균 삼각 플라스 크, 접종 10 ml 파운드, 파운드 격판덮개에서 단일 식민지와 적절 한 항생제를 포함 하 고 37 ° C에서 하룻밤 (약 16-18 시간) 서 품 어.
참고: 서 문화 허용 형식의 식 감염23에 필요한 1 피리. 떨고 성장 문화 비효율적 pili 식 해야한다 그리고 그러므로, 감염의 일관성 없는 요금. - 광학 밀도 (OD)600 의 숙박 문화를 측정 하 고 미리 결정된 성장 곡선을 사용 하 여 ml 당 박테리아의 수를 계산. 예, UPEC 긴장 UTI89,600 명이 = 0.35은 2 x 108 CFU 당 ml, 따라서, OD600 와 야간 문화 = 2.4 13.7 x 10에 해당 될 것 이라고8 CFU / ml. 사이의 관계를 경험적으로 결정은 OD600 그리고 실행 가능한 박테리아 감염에 대 한 고용 하는 모든 새로운 긴장으로.
-
50 μ PBS에에서 감염 되는 동물의 수를 고려 하 여 박테리아의 양이 필요 하 고 각 마우스 약 107 콜로 니 형성 단위 (CFU) 받아야 결정 합니다. 카 테 터와 주사기 덩어리는 inoculum을 결정 하는 데 필요한 100 µ l의 ~ 130 µ l 죽은 볼륨을 계산에 포함 됩니다.
- 회전 탁상 microcentrifuge 17000 x g 1 분에 있는 세균 현 탁 액 그리고 2 x 108 CFU PBS에 ml 당 결과 세균성 펠 릿 resuspend. 순차적으로 희석이 현 탁 액의 경우 각 감염에 대 한 정확한 inoculum을 확인 하려면 적절 한 항생제로 파운드 agar에 접시는 약 수 있습니다.
- 1 ml 주사기로 세균 inoculum을 그릴 하 고 주사기의 끝에 카 테 터를 연결 합니다. 어떤 공기를 제거 하는 문제를 시작 하기 전에 테에서 죽은 공기 공간을 채우기 위해 플런저를 우울 하 게 주사기를 누릅니다.
3입니다. 마우스의 준비
- 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine의 복 주사를 통해 마우스 anesthetize 추가 열을 제공할 수 있습니다.
- 각 마우스 중간 압력으로 노상 강도 당기고 하 여 진정 완벽 하 게 확인 하십시오. 마우스는 완전히 반응 및 3-5 분이이 상태에 도달 하기를 요구 하지 않는 때 진정 됩니다.
- 마우스 부정사 놓고 소변의 방광을 비우기 위하여 더 낮은 복 부에 중간 압력을 적용 합니다. 전체 방광 ileac 볏 사이 피부 아래 완두콩 같은 느낌.
그러나 참고: 흡입된 isoflurane 여성 쥐15,22catheterize 하는 데 사용 되었습니다, 그리고, 그것은 테스트 되지 않았습니다 남성 쥐 충분히 흡입된 isoflurane이 절차에 의해 마 취 여부.
4. 여성 쥐의 transurethral 점
- 비 지배적인 손을 사용 하 여, 꼬리와 마우스의 복 부에 동일한 손의 손가락에 엄지손가락을 배치 하 고 반대 방향으로 단단히 자리에 마우스를 부드러운 압력을 적용.
-
마우스에 수직인 요도 구멍에서 카 테 터의 끝을 놓습니다. 허브 작업 표면에 평행 하 게 되도록 동시에 주사기를 낮추고 있는 동안 요도 구멍을 충족 될 때까지, 부드러운 압력으로 요도에 카 테 터를 밉니다. 테 아무 윤 활을 필요합니다. 밀거나 요도에 카 테 터를 강제로 하지 않습니다. 테는 약간 저항을 가진 요도에 원활 하 고 쉽게 슬라이드 한다.
- 한번 inoculum (4.3 단계)를 주입 하기 전에 테 장소, 아주 부드럽게 비 지배적인에서 손가락으로 마우스의 머리 쪽으로 복 부 피부를 손으로 당겨는 이미 마우스 (4.1 단계)의 복 부에은. 카 테 터, 요도에 있으면 요도 구멍을 구성 하는 조직 이동 하지 것입니다, 경우 테 잘못 하지 질에, 조직 및 카 테 터에서 이동 합니다 반면. 이 급속 한 시험 각 마우스에 수행 되어야 합니다.
- 카 테 터 허브 요도 구멍 때 천천히 50 µ l 세균성 inoculum의 분배. 천천히 주입 속도 신장으로 vesicoureteral 퇴조를 최소화합니다. 천천히 5 수에 누설을 방지 하기 위해 카 테 터를 제거 합니다. 부정사의 위치에서 그들의 감 금 소에 마우스를 놓습니다.
5. 남자 쥐의 transurethral 점
- 두 개의 엄지 집게 마우스의 외부 생식 기 다 cranially caudally 배치 합니다. 완전히 노출 귀 두 음 경 포 피를 철회. 성 기는 외부 위치, 일단 엄지 집게를 놓습니다.
- 부드럽게 하지만 엄격 하 게 장기를 들고 동물에 수직인 돌출 성 안정 집게를 재조 정할. 시각화 요도 도관을 신중 하 게 장기의 끝에 작은 오프닝으로 카 테 터를 소개 합니다. 부드럽게는 집게와 부드러운 긴장을 유지 하는 마우스의 몸 쪽으로 음 경으로 카 테 터를 안내. 테 아무 윤 활을 필요합니다. 성 기;으로 카 테 터를 강요 하지 마십시오 테는 정확한 위치를 나타내는 요도에 원활 하 게 슬라이드 한다.
- 카 테 터 허브 음 경 끝, 충족 되 면 성 기의 위치를 유지 하면서 inoculum의 50 µ l를 분배 매우 느리게. 그림 2에 표시 된 같은 미리 정해진된 문제 품질 평가 점수에 따라이 이번에는 주입의 품질 기재 됩니다.
- 5는 inoculum의 누설을 방지 하기 위해 수를 통해 천천히, 테를 철회. 부정사의 위치에서 그들의 감 금 소에 마우스를 놓습니다. 동물 마 취의 관리에 따라 30-45 분을 복구 하기 시작 한다.
6입니다. 감염된 장기에서 CFU의 결정
- 미리 정해진된 시간 포인트에서 희생 마우스 사용 하 여 표준 운영 절차 (예, 자 궁 경관 탈 구 또는 이산화탄소 과다) 승인. 모피 여 오염을 최소화 하기 위해 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부 축
- 2 cm 이상가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부의 더 낮은 세 번째에서 절 개를 만들고 aseptically 5 ml으로 방광 및 다른 원하는 기관를 포함 하 여 그에 국한 되지 않는, 신장, 고환, 정액 소포, 또는 preputial 동맥을 제거 1 ml 균 PBS를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 스냅 캡 튜브. 얼음에 모든 샘플을 유지.
- 휴대용 균질 화기와 균질 장기 거의 없는 단단한 조직 유지, 기관에 따라 약 15-60 초 때까지. 지방 잘, 균질 하지 않습니다 그리고 빛나는 베이지색 흰색 조직으로 쉽게 인식할 수 있다. 삭제 하기 전에 fat 또는 다음 균질. PBS 사이 뒤 에탄올에는 균질 화기를 씻어 각 실험 또는 기관 그룹.
참고: 일반적으로, 휴대용 균질 또는 비드 밀 균질을 사용 합니다. 이러한 시스템의 모든 감염 된 후 24 시간에서 세균 CFU의 직접적인 비교에 의해 결정으로 비슷한 결과 굴복 했다 하는 동안 세균 생존 능력을 유지 하면서 호스트 조직 균질에 최적의 조건은 결정 해야 한다 실험적으로 전에 이 프로토콜을 정기적으로 수행합니다. - 무 균된 기관 정지의 직렬 희석을 수행 합니다. 플레이트 파운드 한 천 배지, 포함 하는 경우, 항생제에 희석 하 고 품 어 37 ° c.에 하룻밤 (~ 15 시간) UPEC 변종 매우 빠른 배로 시간 있고 따라서, 한다 주의 하지 개별 식민지를 계산 하는 능력을 방해 것이 있기 때문에 너무 오래 한 천 배지를 품 어.
7. 방광 조직의 Cytometric 분석 흐름
- 34 단위/mL에서 콜라와 100 µ g/mL, PBS에서 DNase 들어 소화 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 계속. 분석할 동물 당 1 개의 15 ml 원뿔 튜브와 튜브 당 aliquot 1 ml 소화 버퍼를 준비 합니다.
- 미리 결정 된 timepoints에서 희생 마우스 사용 하 여 표준 운영 절차 (예: 자 궁 경관 탈 구 또는 이산화탄소 과다) 승인. 모피 여 오염을 최소화 하기 위해 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부 축
-
2 cm 이상가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부의 더 낮은 세 번째에서 절 개를 만들고 전체 방광을 제거. 2 크기의 조각, 일반적으로 약 8 조각 2-3 m m로 방광을 절단가 위 함께 잘 말하다.
- 포함 하는 소화 버퍼 튜브 당 1 다진된 방광을 추가 합니다. 소화 버퍼에 다진된 방광 조직 씻어 흔들. 모든 방광 해 부하 고 다진 때까지 얼음에 계속.
- 5 손으로 활기찬 동요와 37 ° C에서 60-75 분 다진된 방광을 품 어 s 매 15 분. 조직에 젖은 휴지를 닮은 유리 투명 한 모습을 소화 완료 됩니다. 장기간된 소화 식별에 필요한 세포 표면 단백질을 제거 하 고 피해 야 한다.
- 얼음 흐름 cytometry 버퍼 (PBS 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 0.2 m m EDTA 포함)의 2-3 mL를 추가 하 여 소화 효소를 비활성화 하 고 부드럽게 혼합. 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 단일 세포 현 탁 액을 보장 하 고 모든 결합 조직을 제거 하는 튜브의 내용을 15 mL 원뿔 튜브에 100 µ m 필터를 통과. 부드럽게 주사기 플런저의 끝으로 필터를 통해 어떤 나머지 조직을 누릅니다. 추가적인 2 mL 흐름 cytometry 버퍼와 필터를 세척. 얼음에 샘플을 계속.
- 200 x g, 4 ° c.에 7 분 동안 원심 분리 하 여 샘플을 씻어 블록에 있는 100 µ L 흐름 cytometry 버퍼 포함 Fc, 5 µ g/mL, 96-잘 바닥판 라운드에 희석 펠 릿을 resuspend. 10-15 분 후에 각 샘플 100 µ L 원하는 항 체 칵테일을 추가 합니다. 30-45 분, 얼음, 빛 으로부터 보호에 대 한 샘플을 품 어.
참고: Fc 블록 Fc 수용 체를 표현 하는 세포에 항 체의 Fc 부분은 바인딩 방지 하기 위해 사용 하는 시 약 이다. 그것의 목적은 일반적인 항 체 바인딩을 최소화 하입니다. 사용 하는 항 체의 결정 실험에서 시험 되는 가설에 의존 되며 문학에서 입력을 선택 해야 합니다. 그림 3, 전반적인 면역 세포 침투를 측정 하는 안티 CD45 항 체 고용 되었다, 팬-면역 세포 단백질은. - 200 x g, 4 ° c.에 7 분 동안 원심 분리 하 여 샘플을 씻어 200 µ L 흐름 cytometry 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend 고 교류 cytometer에서 취득 직전 5 ml 폴리스 티 렌 튜브에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플을 전달 합니다.
- 교류 cytometer에서 전체 샘플을 수집 합니다. 좋은 소화 200000-400000 세포, 8000-10000 CD45 보장할+ 에서 순진한 마우스 bladders, 감염 된 장기 더 포함 하는 동안 면역 세포 세포16 (그림 3).
참고: 샘플 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비 CFU 평가를 사용할 수 없습니다. 증거가 보여 그 UPEC 식민 존재 또는 면역 세포 침투는 조직에 걸쳐 균일 한 방광을 두 부분으로 분할 하는 권장 하지 않습니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 개발, 여성 및 남성 C57Bl/6 마우스의 동료 얻은, 그리고 세균 부담 1 시간에서 30 일에 이르기까지 시간 포인트에서 방광에 평가 했다 6 ~ 8 주 세. 이러한 연구 결과 다른 상세한 (Zychlinsky Scharff 외., 보류). 여기, 우리는 24 시간 감염에서 대표적인 데이터 제시. 특히, 세균성 부담 24 시간 게시물 감염 (그림 1)에서 남성과 여성 쥐 사이 해당 했다. 세균성 짐에 작은 변화는 각 그룹 24 시간 게시물 감염, 어떤 여성 쥐15,16보고 되었습니다 비슷한 내에서 관찰 되었다.
충분히 빈 방광 감염 전에 소변을 주의 하는 경우는 inoculum의 상당한 누설 거의 여성 쥐에서 관찰 됩니다. 그러나, 남성 쥐로 주입 결과 상당한 양의 세균 inoculum이이 프로토콜의 개발 단계 동안 특히 요도에서 새. 식민지 또는 감염의 설립 inoculum 감염 시의 손실 영향을 여부를 확인 하려면 우리는 각 문제에 대 한 평가 시스템을 고용. 각 점 1-5의 척도로 득점 했다, 1 되 가장 최적의 및 세균성 식민 결정된 24 시간 게시물 감염 (상자, 그림 2). 이 시스템은 탐정 종속, 따라서 잠재적으로 주관적이 연구의 주 저자 결정 문제, 감염된 방광에 세균성 짐의 평가 전 직후 모든 점수는 동안에. 평균 순위 다른 모든 열에는 각 열의 평균 순위를 비교 하는 비패라메트릭 Kruskal-월리스 테스트에 의해 평가와 다른 점, 동물에서 얻은 CFU 중 통계적으로 유의 한 차이가 존재 (p = 0.17) 그리고는 던의 테스트를 사용 하 여 여러 비교에 대 한 수정. 이 분석에서 그것은 종결 될 수 있다 그 차선 instillations (점수 > 3), 감염 시 세균 inoculum의 상당한 누설의 결과로, 크게 영향을 미치지 않습니다 24 시간 (그림 2, 그래프)에서 세균성 식민. 특히, 경험, 남성 쥐에서 새 기의 주파수 감소 크게.
마지막으로,이 모델을 개발 목표는 암컷과 수 컷 동물에 UPEC에 대 한 면역 응답을 직접 비교 했다. 세포질 침투 UTI, CD45의 수에 대 한 응답에서 남녀 사이 변경 여부를 테스트 하려면+ 순진한에 감염 된 동료 암컷과 수 컷 쥐의 면역 세포 cytometry에 의해 평가 했다. 순진한 동물에 면역 세포의 수는 암컷과 수 컷 쥐 사이 다른 하는 동안 (p = 0.95), 감염 된 여성 쥐에서 방광으로 침투에 통계적으로 유의 한 증가 (p = 0.0015) (그림 3A-B).
그림 1: UPEC 동등한 효율성과 여성 및 남성 방광 Colonizes. 6 8 주 오래 된 여성 및 남성 C57Bl/6 쥐 10으로 얻은 했다7 CFU의 UPEC. 24 시간 후 감염, 방광은 aseptically 열거 세균성 부담을 제거. 플롯은 CFU/방광을 묘사 한다. 각 도트는 하나의 마우스, 5 표시의 대표적인 실험 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 품질 점 24 시간 게시물 감염에서 세균 부담으로 연결 되지 않습니다. 6 8 주 오래 된 여성 및 남성 C57Bl/6 쥐 10으로 얻은 했다7 CFU의 UPEC. 각 점 직후 단일 연구원 특정 기준 (박스형된 텍스트)에 의해 정의 된 대로 점에 품질 평가 점수를 할당. 24 시간 후 감염, 방광은 aseptically 열거 세균성 부담을 제거. 줄거리는 할당 된 품질 점수 대 CFU/방광 묘사. 각 점 한 마우스, 5 풀링된 실험 표시 됩니다. p = 0.17, Kruskal-월리스 테스트 여러 비교 포스트 hoc 던의 테스트와 모든 다른 열의 평균 순위와 각 열의 평균 순위를 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 면역 세포 침투 요로 감염에 대 한 응답에서 여성 쥐에서 증가 된다. 6 8 주 오래 된 여성 및 남성 C57Bl/6 마우스 얻은 했다 또는 하지 107 CFU의 UPEC. 대표적인 점 플롯 묘사 CD45 총 방광 셀+ 면역 세포에서 순진한 핑크에서 문이 또는 쥐를 감염. CD45의 절대 수를 표시 하는 그래프+ 순진한 또는 24 시간 감염 쥐에서 방광에 면역 세포. 각 점 한 마우스, 2 풀링된 실험 표시 됩니다. p-값 맨-휘트니 테스트에 의해 결정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Transurethral 점 남성 쥐의 방광 점 막 질병에 섹스의 영향으로 많은 새로운 연구 기회를 제공 하지만 또한 몇 가지 과제를 선물 한다. 으뜸가, 한 가지 한계는는 점 처음 카 테 터 삽입 시 과도 한 염증의 결과로, 기술적으로 어려운 증명할 수 있습니다. 기술에서 개선 에반스 블루 염료 등 컬러 솔루션으로 죽은 쥐의 주입에 의해 얻을 수 있습니다. 하는 점 성공, 방광 시각적으로 검사 해야 하 고 얻은 액체의 볼륨 투베르쿨린 주사기로 추출 하 여 평가할 수 있다. 천천히, 부드러운 움직임의 중요성을 과장 수 없습니다: 저항 힘이 초과 염증과 조직 손상에서 발생, 카 테 터를 삽입 하는 데 사용 해야. 올바르게 수행 하는 경우 카 테 터는 요도에 여유롭게 슬라이드 합니다. 만약 저항이 나 방해는, 카 테 터를 제거 하 고 삽입을 다시 시도 하 최상 이다.
세균성 부담 24 시간 게시물 감염에 기지의 품질을 연관 하 여 우리는 적은 양의 세균 inoculum 끊기면 감염의 때에 불완전 한 기술 아직도의 강력한 식민지에서 결과 입증 된 방광입니다. 이 프로토콜을 활용, 조사 누출 무료 instillations를 달성 하기 위해 목표로 한다. 그러나, 절차의 견고성 유용한 데이터 및 해석할 결과 불완전 한 instillations 제공 여전히 것입니다 보장 합니다.
남성 방광 감염의 유일한 게시 된 다른 방법을 통해 우리의 기술의 큰 장점은 비-침략 적, 비 수술 접근 방식 이다. 우리의 접근 transurethral 주입을 사용 하 여 복 부의 구조적 무결성을 중단 하지 않고 방광, 요도 통해 생리 적인 경로 다음과 같습니다. 올 슨과 동료20, 설명 된 침략 적 기술, 염증, 치유, 지연 등 수술 절차 및 결과 흉터 조직에 내재 된 요소 포함 되어 있습니다. 특히 감염에 면역 반응의 연구와 관련 하 여 관련 된 수술 외상을 유기 체의 응답이 이다. 이 치유 과정의 일환으로 프로-염증 성 환경 및 잠재적인 조직 알갱이 만듦, 뿐만 아니라 항 염증 성 상처 치유 프로그램의 형성을 포함합니다. 이러한 요인 실험 설정 내에서 바람직하지 않은 영향을 나타냅니다.
마지막으로,이 연구의 목적은 요로, 방광 점 막 질환, 감염 등 섹스의 영향을 해결 하는 미래 연구에 적용 될 수 있는의 과정에서 남성과 여성의 면역 반응의 직접적인 비교를 허용 하는 방법을 개발 했다 그리고 암 생물학입니다. 두 번째 뚜렷한 장점으로 방법을 설명 여기 십 년간19에 대 한 여성 쥐에 사용 되는 거울. 따라서,이 기술을 남성 생쥐에서 수행 하는 실험 기존 연구의 넓은 시체를 비교할 수 있습니다. 우리의 실험에에서 차이가 존재 하 고 이러한 차이 점 막 감염, 방광의 다른 질병에 응답에 섹스 기반 격차를 이해 하는 단서를 제공할 수 있습니다 밝혀 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는이 프로토콜 및 프로젝트의 개발 기간 동안 원고와 그들의 도움에 대 한 수지상 Immunobiology 실험실의 중요 한 독서에 대 한 박사 Matthieu 루소를 감사합니다. 이 작품에서 유럽 연합 7 차 프레임 워크 프로그램 마리 퀴리 작업 (PCIG11-가-2012-3221170, 그리고 면역-종양학 LabEx (마이) 자금에 의해 부분적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
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