Summary
O modelo estabelecido de transuretral cateterismo de ratos permite o estudo das patologias de bexiga, incluindo a infecção do trato urinário, mas só pode ser realizado nas fêmeas. Um novo modelo de instilação transuretral masculino, apresentado aqui, permitirá a pesquisa em uma área marcada por fortes diferenças clínicas e epidemiológicas entre os sexos.
Abstract
Infecções do trato urinário (ITU) são extremamente comuns em todo o mundo, incorrer em despesas associadas a cuidados de saúde e Morbidade significativa. Modelos animais pequenos, que refletem com precisão a progressão e o estabelecimento da doença, permitam a dissecação das interações patógeno-hospedeiro e geração de imunidade à infecção. Em ratos, instilação intravesical de uropathogenic e. coli, o agente causador em mais de 85% da Comunidade adquiriu UTI, recapitula a muitos dos estágios de infecção observada em humanos. Até recentemente, no entanto, UTI pode somente ser modelado em fêmeas. Essa limitação tem dificultado o estudo das diferenças relacionadas ao sexo na UTI, bem como outras patologias de bexiga, como o câncer. Aqui, descrevemos um método para incutir ratos masculinos que permite a comparação direta entre animais masculinos e femininos e fornecer um protocolo detalhado para avaliar o tecido da bexiga por citometria de fluxo como meio para compreender melhor as respostas do hospedeiro à infecção. Juntas, estas abordagens ajudarão na identificação de fatores do hospedeiro que contribuem para sexo enviesamentos observados em UTI e outras doenças associadas a bexiga.
Introduction
Infecções do trato urinário (ITU) são uma das infecções mais comuns em países desenvolvidos1. Taxas de infecção são semelhantes entre as fêmeas e os machos entre os recém-nascidos e os idosos2. Mulheres adultas na pré-menopausa, no entanto, têm uma incidência muito maior de ITU adquirida na Comunidade em comparação com os homens,2,3. Dado que esta doença afeta principalmente as mulheres, de investigação fundamental e clínica centrou-se esmagadoramente na UTI nas fêmeas. No entanto, a ITU em homens é um desafio de saúde significativos e pouco estudado4. Com efeito, porque a ITU em homens estão associadas a maior morbidade, estas infecções rotineiramente são definidas como complicado4,5.
Como nosso entendimento do papel central de enviesamentos de sexo na fisiologia e patologia evolui, novos métodos são necessários para explorar este aspecto anteriormente negligenciado da doença. Diferenças de sexo desempenham um papel essencial na imunidade e infecção; as fêmeas têm maior incidência de doença auto-imune, enquanto os machos são mais suscetíveis a determinadas infecções, como tuberculose, malária e HIV6,7. Câncer de bexiga, outra patologia urológica, é significativamente mais prevalente em homens do que nas mulheres, e vários estudos têm demonstrado um papel de andrógenos no desenvolvimento de malignidade8,9,10,11 ,12. Nomeadamente, no entanto, investigação de terapias intravesical para câncer de bexiga é realizada exclusivamente em fêmeas, devido à incapacidade de cateterismo repetidamente camundongos machos13.
O estudo da patogênese da ITU confia pesadamente em modelos de roedores de infecção (por exemplo, ratos e ratazanas). Murino modelos de UTI podem empregar uropathogens originalmente isolados de infecções humanas, tais como uropathogenic e. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcusou Proteus14. Normalmente, as bactérias são introduzidas o bexiga através de cateterismo da uretra. Após a infecção, bexiga e rins podem ser removido para avaliar parâmetros específicos de infecção, tais como a colonização bacteriana, dano tecidual ou anfitrião resposta imune15,16. Universalmente, no entanto, apenas fêmeas são utilizadas para pesquisa de ITU. De fato, muitos estudos observaram que, devido a razões anatômicas, cateterismo de ratos masculinos não é possível13,17,18,19. Mais recentemente, tem sido descrita uma abordagem cirúrgica para instilação masculina, no qual o abdome é aberto, a bexiga é deslocada externamente aplicando uma pressão suave para a abertura no abdômen e bactérias são injetadas a bexiga20. Essa abordagem permite que a infecção masculina, ao custo de intervenção cirúrgica. Assim, uma ressalva importante desta abordagem inclui a influência da inflamação, sobre o resultado da infecção, como o potencial para induzir uma resposta anti-inflamatórios-cicatrização da incisão21. Como nossos interesses incluem compreender o viés sexual em resposta à doença, desenvolvemos um método de instilação de intravesical bacteriana em ratos masculinos que mais se aproxima da abordagem de transuretral não-cirúrgico bem estabelecida usada em roedores femininos22 .
Nosso modelo baseia-se uma metodologia estabelecida e fornece a capacidade de comparar diretamente a resposta imune do hospedeiro à ITU em animais do sexo femininos e masculinos. Este método irá permitir a dissecação das diferenças baseadas no sexo, na infecção e potencialmente oferecer pistas moleculares e celulares para as pronuncia-se diferenças na susceptibilidade e resposta à infecção entre os sexos. Além disso, este modelo tem valor para além de estudos UTI, permitindo a criação de modelos para investigar outras doenças associadas a bexiga, como o câncer de bexiga, próstata, sob ou sobre active síndrome da bexiga e cistite intersticial.
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Protocol
Mouse experimentos foram conduzidos em conformidade com a aprovação do protocolo número 2012-0024 pelo Comitê d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (Comitê de ética para experimentação animal), em aplicação da Directiva 2010/63 Europeu UE.
1. preparação de cateteres
- Prepare uma cânula de acesso intravenosa pediátrica para cada grupo de ratos para ser infectado. Usando o mecanismo de mola embutido, alienar cada cânula de sua agulha, conforme as instruções do fabricante. Descarte as agulhas, preservando apenas a plástica cânula intravenosa.
- Esterilize os cateteres em uma capa de fluxo laminar para o ciclo de um ultravioleta (UV), geralmente de 25 a 30 min.
Nota: Os cateteres podem ser usados para mais do que um rato, porém um novo cateter deve ser usado entre grupos experimentais, sexos ou estirpes bacterianas.
2. preparação de Uropathogenic e. coli para infecção
- Pelo menos dois dias antes da infecção, utilizando uma ansa de inoculação estéril, raia UPEC de um estoque de bactérias congelada em uma placa de ágar caldo Luria (LB), contendo antibióticos, se for o caso. Incube a 37 ° C durante a noite. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C por até uma semana.
- Em um Erlenmeyer 100 ml estéril, inocular 10 ml LB, contendo antibióticos, se for caso disso, com uma única colônia da placa LB e incubar a 37 ° C durante a noite (aproximadamente 16-18 hr) de pé.
Nota: Culturas permanentes permitem a expressão do tipo 1 pili, que são necessários para infecção23. Culturas cultivadas tremendo terá menos eficiente expressão de pili e, portanto, inconsistentes taxas de infecção. - Medir a densidade óptica (OD)600 da cultura durante a noite e calcular o número de bactérias / ml, utilizando uma curva de crescimento pré-determinado. Como um exemplo, para a tensão UPEC UTI89, OD600 = 0.35 é equivalente a 2 x 108 UFC / ml, assim, uma cultura durante a noite com uma OD600 = 2.4 seria equivalente a 13,7 x 108 UFC por ml. determinar empiricamente a relação entre o OD600 e bactérias viáveis com cada nova estirpe utilizada para a infecção.
-
Determine a quantidade de bactérias necessárias, considerando o número de animais para ser infectado, e que cada rato deve receber aproximadamente 107 formadoras unidades (CFU) em 50 µ l de PBS. Inclua no cálculo o volume morto ~ 130 µ l do cateter e a seringa nub e 100 µ l necessários para determinar o inóculo.
- Girar a suspensão bacteriana em mesa microcentrifuga a 17.000 x g por 1 min e ressuspender o precipitado resultante bacteriana em 2 x 108 UFC / ml de PBS. Serialmente Dilua uma alíquota desta suspensão e placa no ágar LB, com antibióticos, se for caso disso determinar o exato inóculo para cada infecção.
- Desenhar o inóculo bacteriano em uma seringa de 1 ml e fixe o cateter ao final da seringa. Toque a seringa para remover todo o ar e pressione o êmbolo para preencher o espaço de ar morto no cateter antes de iniciar a instilação.
3. preparação dos ratos
- Anestesia os ratos através de injeção intraperitoneal de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg de xilazina. Calor suplementar pode ser fornecido.
- Certifique-se de que cada rato é totalmente sedado apertando o Whitney com média pressão. Os ratos são totalmente sedados quando eles não reagir e exigir 3-5 min para chegar a este estado.
- Coloque os ratos em decúbito dorsal e aplique uma pressão média do abdômen inferior para esvaziar a bexiga de urina. Como uma ervilha debaixo da pele entre as cristas ileac bexigas completa?
Nota: Isoflurano inalado tem sido utilizado para cateterismo ratos fêmeas15,22, no entanto, ele não foi testado se ratos masculinos são suficientemente anestesiados por isoflurano inalado para este procedimento.
4. transuretral instilação de ratos fêmeas
- Usando a mão não dominante, coloque o polegar sobre a cauda e um dedo da mesma mão no abdômen do mouse e aplique uma pressão suave em opostas direções para segurar o mouse firmemente no lugar.
-
Coloque a ponta do cateter perpendicular ao rato no orifício uretral. Com uma pressão suave, deslize o cateter na uretra, até que o hub encontra o orifício uretral, reduzindo simultaneamente a seringa para que é paralela à superfície de trabalho. O cateter não necessita de lubrificação. Não empurre ou forçar o cateter na uretra. O cateter deve deslizar suavemente e facilmente na uretra, com pouca ou nenhuma resistência.
- Antes de instilar o inóculo (passo 4.3), uma vez o cateter está no lugar, muito gentilmente puxe a pele abdominal na direcção da cabeça do mouse com o dedo desde o não-dominante mão que já está no abdômen do mouse (passo 4.1). Se o cateter está na uretra, o tecido compondo o orifício da uretra não se moverá, Considerando que se incorretamente, o cateter é colocado na vagina, se moverá o tecido e afaste o cateter. Este teste rápido deve ser executado em cada rato.
- Quando o hub do cateter se encontra o orifício uretral, lentamente dispense 50 µ l de inóculo bacteriano. Uma taxa de instilação lenta minimiza refluxo vesico-ureteral para o rim. Remova lentamente o cateter para evitar fugas, ao longo de uma contagem de 5. Coloque os ratos em suas gaiolas em posição supina.
5. transuretral instilação de camundongos machos
- Coloque dois pinça de polegar cranialmente e caudalmente a genitália externa do rato. Retrai o prepúcio para expor totalmente a glande. Uma vez que o pênis é posicionado externamente, solte a pinça de polegar.
- Reposicione o fórceps para estabilizar o pênis saliente perpendicular ao animal, segurando o órgão suavemente, mas esticada. Visualize o meato uretral e introduzir o cateter cuidadosamente a pequena abertura na ponta do órgão. Gentilmente guia o cateter dentro do pênis, em direção ao corpo do mouse, mantendo uma tensão suave com a pinça. O cateter não necessita de lubrificação. Não force o cateter dentro do pênis; o cateter deve deslizar suavemente na uretra, indicando o correto posicionamento.
- Uma vez que o hub do cateter encontra a ponta do pênis, muito lentamente, dispense 50 µ l de inóculo, enquanto mantém a posição do pênis. A qualidade da instilação pode referir-se neste momento de acordo com um índice de qualidade de instilação predeterminado, como mostrado na Figura 2.
- Retrai o cateter lentamente, ao longo de uma contagem de 5, para impedir o escapamento do inóculo. Coloque os ratos em suas gaiolas em posição supina. Os animais devem começar a recuperar 30-45 min após a administração do anestésico.
6. determinação de UFC em órgãos infectados
- Nos pontos de tempo pré-determinado, sacrifício ratos usando aprovaram procedimentos habituais de funcionamento (por exemplo, deslocamento cervical ou overdose de dióxido de carbono). Umedeça o abdômen completamente com etanol a 70% para minimizar a contaminação pela pele.
- Fazer uma incisão através do terço inferior do abdome do rato de pelo menos 2 cm com uma tesoura e remover assepticamente a bexiga e quaisquer outros órgãos desejados, incluindo mas não limitado a, rins, testículos, vesículas seminais ou Glândulas Prepuciais, em 5 ml tubos de polipropileno snap cap contendo 1 ml PBS estéril. Mantenha todas as amostras no gelo.
- Homogeneizar os órgãos com um homogeneizador portátil até quase nenhum tecido sólido permanece, aproximadamente 15 a 60 segundos dependendo do órgão. Gordura não homogeneizar bem e é facilmente reconhecível como brilhante tecido Bege-branca. Descarte a seguir ou gordura antes de homogeneização. Lave o homogenizador em etanol seguido de PBS entre cada experimental ou grupo de órgãos.
Nota: Normalmente, use Homogeneizadores portátil ou Homogeneizadores de moinho do grânulo. Enquanto todos estes sistemas têm rendido resultados semelhantes, conforme determinado pela comparação direta de UFC bacteriana a pós-infecção 24h, as condições ideais para homogeneizar o tecido do hospedeiro, preservando a viabilidade bacteriana devem ser determinadas empiricamente, antes Este protocolo realizando rotineiramente. - Realize diluições em série de suspensões de órgão homogeneizada. Diluições em placas de ágar LB, contendo antibióticos, quando for caso disso, a placa e incubar durante a noite (~ 15 hr) a 37 ° C. UPEC estirpes têm vezes dobrando muito rápidos, e como tal, deve ter cuidado para não incubar as placas de ágar há muito tempo, porque isto vai dificultar a capacidade de contagem das colónias individuais.
7. fluxo Cytometric análise de tecido da bexiga
- Prepare a solução tampão de digestão com colagenase em 34 unidades/mL e DNase em 100 µ g/mL, em PBS. Manter-se no gelo. Prepare um tubo cônico de 15 ml por animal a ser analisado e alíquota 1 ml de tampão de digestão por tubo.
- Em momentos pré-determinados, sacrifício ratos usando aprovaram procedimentos habituais de funcionamento (por exemplo, deslocamento cervical ou overdose de dióxido de carbono). Umedeça o abdômen completamente com etanol a 70% para minimizar a contaminação pela pele.
-
Fazer uma incisão através do terço inferior do abdome do rato de pelo menos 2 cm com uma tesoura e remover a bexiga inteira. Pique bem com uma tesoura, corte a bexiga em 2-3 mm2 tamanho peças, normalmente cerca de 8 peças.
- Adicione uma bexiga picada por tubo contendo tampão de digestão. Agite para lavar o tecido da bexiga picada para o buffer de digestão. Mantenha-se no gelo até todas as bexigas são dissecadas e picadas.
- Incubar a picada bexigas por 60-75 min a 37 ° C, com agitação vigorosa à mão por 5 s cada 15 min. Quando o tecido tem uma aparência transparente vítrea, papel de tecido molhado, assemelhando-se a digestão é completa. Digestão prolongada irá remover proteínas de superfície das células necessárias para a identificação e deve ser evitado.
- Inativar as enzimas de digestão pela adição de 2-3 mL de tampão de citometria de fluxo gelada (PBS contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,2 mM EDTA) e misture delicadamente. Coloque os tubos em gelo.
- Para garantir uma suspensão de célula única e remover todo o tecido conjuntivo, passe o conteúdo do tubo através de um filtro de 100 µm, colocado em um tubo cônico de 15 mL. Pressione suavemente qualquer tecido restante através do filtro com o fim de um êmbolo da seringa. Lave o filtro com um adicional 2 mL de tampão de citometria de fluxo. Mantenha as amostras no gelo.
- Lavar as amostras por centrifugação durante 7 min a 200 x g, 4 ° C. Resuspenda pelotas em 100 µ l fluxo cytometry contendo Fc bloco amortecedor, diluído a 5 µ g/mL e transferir para um 96-poço redondo placa inferior. Após 10-15 min, adicione 100 µ l desejado cocktail de anticorpo para cada amostra. Incube as amostras por 30-45 min, no gelo, protegido da luz.
Nota: O bloco Fc é um reagente usado para prevenir a ligação da porção Fc dos anticorpos para as células que expressam receptores de Fc. Seu objetivo é minimizar a ligação de anticorpos inespecíficos. Determinação de anticorpos para usar será dependente a hipótese que está sendo testada no experimento e deve ser seleccionada com a entrada da literatura. Na Figura 3, para medir a infiltração de células imunes no geral, um anticorpo anti-CD45 foi empregado, que é uma proteína celular pan-imune. - Lavar as amostras por centrifugação durante 7 min a 200 x g, 4 ° C. Resuspenda pelotas de célula em 200 buffer de citometria de fluxo µ l e passar as amostras através de um filtro de célula 40 µm em um tubo de 5 ml de poliestireno apenas antes da aquisição de um citômetro de fluxo.
- Colete a amostra inteira sobre o citômetro de fluxo. Uma boa digestão irá produzir 200.000-400.000 células, com 8.000-10.000 CD45+ células do sistema imunológico de bexigas de rato ingênuo, enquanto órgãos infectados irão conter mais células16 (Figura 3).
Nota: As amostras preparadas para análise de fluxo cytometric não podem ser usadas para avaliar CFU. Não é aconselhável dividir a bexiga em duas partes como nenhuma evidência existe para demonstrar essa colonização UPEC ou infiltração de células imunes é uniforme em todo o tecido.
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Representative Results
No desenvolvimento do presente protocolo, coortes de camundongos C57Bl/6 de feminino e masculinos com idade entre 6 a 8 semanas eram encargos inculcado e bacterianos avaliados em bexigas em pontos de tempo variando de 1 hora a 30 dias. Os resultados destes estudos são detalhados em outro lugar (Zychlinsky Scharff et al., pendente). Aqui, apresentamos dados representativos de infecções 24 hr. Notavelmente, a carga bacteriana foi equivalente entre ratos masculinos e femininos em 24 hr pós-infecção (Figura 1). Dentro de cada grupo 24 hr pós infecção, semelhante ao que tem sido relatado em ratos fêmeas15,16, observou-se pouca variação na carga bacteriana.
Se é tomado de bexigas suficientemente vazias de urina antes da infecção, vazamento significativo do inóculo é raramente observado em ratos fêmeas. No entanto, instilação em ratos masculinos resultou em quantidades significativas de inóculo bacteriano vazando da uretra, particularmente durante a fase de desenvolvimento do presente protocolo. Para determinar se a perda de inóculo no momento da infecção impactado colonização ou do estabelecimento de infecção, utilizamos um sistema de classificação para cada instilação. Cada instilação foi marcado em uma escala de 1 a 5, com 1 sendo a colonização bacteriana e mais ideal era determinado 24h pós-infecção (Figura 2, caixa). Enquanto este sistema foi investigador dependente, e portanto, potencialmente subjetiva, o autor principal deste estudo determinou todas as pontuações, imediatamente após a instilação, antes da avaliação da carga bacteriana em bexigas infectadas. Não houve diferença estatisticamente significativa existiu entre o UFC proveniente de animais com pontuações diferentes instilação, avaliada por um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis comparando a classificação média de cada coluna com a classificação média de todas as outras colunas (p = 0.17) e corrigindo para comparações múltiplas, usando o teste de um Dunn. A partir desta análise, pode concluir-se que suboptimal instillations (Pontuação > 3), resultando em perda substancial de inóculo bacteriano durante a infecção, não impactam significativamente a colonização bacteriana em 24 horas (Figura 2, gráfico). Nomeadamente, com a experiência, a frequência de vazamento em camundongos machos diminuiu significativamente.
Finalmente, o objetivo no desenvolvimento deste modelo foi comparar diretamente a resposta imune de UPEC em animais do sexo femininos e masculinos. Para testar se a infiltração celular é alterada entre os sexos em resposta à UTI, o número de CD45+ células do sistema imunológico em ingênuo e coortes infectados de ratos masculinos e femininos foram avaliadas por citometria de fluxo. Enquanto o número de células do sistema imunológico presentes em animais ingênuo não foi diferente entre os ratos masculinos e femininos (p = 0,95), houve um aumento estatisticamente significativo na infiltração das bexigas de ratos fêmeas infectadas (p = 0,0015) (Figura 3A-B).
Figura 1: UPEC coloniza bexigas femininas e masculinas com igual eficiência. 6 a 8 semanas de idade femininos e masculinos C57Bl/6 ratos estavam imbuídos 107 UFC de UPEC. pós-infecção 24 hr, bexigas foram assepticamente removido para enumerar a carga bacteriana. Trama retrata CFU/bexiga. Cada ponto é um rato, experiência representativa de 5 mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: a qualidade da instilação não correlaciona com carga bacteriana em 24 hr pós infecção. 6 a 8 semanas de idade femininos e masculinos C57Bl/6 ratos estavam imbuídos 107 UFC de UPEC. Imediatamente após cada instilação, um único pesquisador atribuída uma pontuação de qualidade para a instilação, tal como definido pelos critérios específicos (text box). pós-infecção 24 hr, bexigas foram assepticamente removido para enumerar a carga bacteriana. Trama retrata a qualidade atribuída Pontuação contra CFU/bexiga. Cada ponto é um rato, 5 experimentos em pool são mostrados. p = 0.17, teste de Kruskal-Wallis, comparando a classificação média de cada coluna com a classificação média de todas as outras colunas com teste post hoc de Dunn para comparações múltiplas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Infiltração de células imunes é aumentada em ratos fêmeas, em resposta à UTI. 6 a 8 semanas de idade femininos e masculinos C57Bl/6 ratos foram instilados ou não com 107 UFC de UPEC. Lotes do ponto representativo retratam as células da bexiga total com CD45+ células imunitárias condomínio fechado em rosa de ingênuo ou infectados de ratos. O gráfico mostra o número absoluto de CD45+ células do sistema imunológico em bexigas de ingênuo ou 24 hr infectado de ratos. Cada ponto é um rato, 2 experimentos em pool são mostrados. p-valores determinados pelo teste de Mann-Whitney. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Instilação transuretral de ratos masculinos oferece muitas novas oportunidades de pesquisa para a influência do sexo sobre a doença da mucosa da bexiga, mas também apresenta vários desafios. Acima de tudo, uma limitação é que a instilação inicialmente pode provar para ser tecnicamente difícil, resultando em inflamação excessiva durante a inserção do cateter. Melhoria na técnica pode ser conseguida a instilação de ratos mortos com uma solução colorida, como corante de azul de Evans. Para confirmar que a instilação é bem sucedida, bexigas devem ser inspecionadas visualmente e o volume de líquido instilado pode ser avaliado por extração com uma seringa de tuberculina. A importância dos movimentos lentos, suaves, não pode ser exagerada: deve haver nenhuma resistência e nenhuma força usada para inserir o cateter, pois isso resultará em excesso inflamação e dano tecidual. Quando realizada corretamente, o cateter irá deslizar facilmente na uretra. Se sentir resistência ou obstrução, é melhor remover o cateter e inserção, tente novamente.
Correlacionando a qualidade da instilação de infecção pós de carga bacteriana 24 hr, temos demonstrado que uma técnica imperfeita, em que uma pequena quantidade do inóculo bacteriano é perdida no momento da infecção, ainda resulta em colonização robusta do na bexiga. Na utilização deste protocolo, um investigador deve procurar alcançar instillations vazamentos. No entanto, a robustez do procedimento garante que instillations imperfeitos ainda fornecerá dados úteis e resultados interpretáveis.
A grande vantagem de nossa técnica sobre o único método alternativo publicado de infecção urinária masculina é sua abordagem não-invasivo, não-cirúrgico. Nossa abordagem usando instilação transuretral segue a rota fisiológica através da uretra para a bexiga, sem interromper a integridade estrutural do abdômen. A técnica invasiva, descrita por Olson e colegas20, inclui fatores inerentes aos procedimentos cirúrgicos, incluindo inflamação, adiada a cura e tecido de cicatriz resultante. Especialmente relevante no que diz respeito a estudos de resposta imune à infecção é a resposta do organismo ao trauma cirúrgico. Isso inclui a formação de um ambiente pro-inflamatórios e granulação potenciais do tecido, bem como um programa de cura ferida anti-inflamatórios como parte do processo de cura. Esses fatores representam influências indesejáveis dentro do ambiente experimental.
Finalmente, o objetivo deste estudo foi desenvolver um método que permite a comparação direta de respostas imunes de masculinas e femininas durante o curso de UTI, que pode ser aplicado para futuros estudos abordando a influência do sexo sobre a doença da mucosa da bexiga, como infecção e biologia do câncer. Como uma segunda vantagem distinta, o método descrito aqui espelhos que usado em ratos fêmeas por décadas19. Assim, experimentos realizados em camundongos machos com esta técnica são comparáveis a um vasto corpo de pesquisa existente. Nossos experimentos revelaram que existem diferenças na resposta e que essas diferenças podem fornecer pistas para a compreensão das disparidades baseada no sexo, em resposta a infecções da mucosa, bem como outras doenças da bexiga.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr Matthieu Rousseau pela leitura crítica do manuscrito e o Laboratory of Immunobiology dendríticas para suas introspecções úteis durante o desenvolvimento do presente protocolo e projeto. Este trabalho foi financiado em parte por fundos da União Europeia sétimo programa Marie Curie acção-quadro (PCIG11-GA-2012-3221170 e o LabEx imuno-Oncologia (AMI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
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