Summary
Etablerte modell av transurethral catheterization mus tillater studiet av blæren patologi, inkludert urinveisinfeksjon, men kan bare utføres i kvinner. En ny modell av mannlige transurethral instillasjon, presenteres her, vil gjøre forskning i et område preget av sterk klinisk og epidemiologisk forskjeller mellom kjønnene.
Abstract
Urin skrift infeksjoner (UVI) er svært vanlig på verdensbasis pådra seg betydelig sykelighet og helse-assosiert utgifter. Små dyr modeller, som nøyaktig gjenspeiler sykdom etablering og progresjon, tillater Disseksjon av vert-patogen interaksjoner og generasjon av immunitet til infeksjon. I mus, intravesical instillasjon av uropathogenic E. coli, den utløsende agenten i mer enn 85% av samfunnet kjøpte UTI, viser mange av stadiene av infeksjon observert hos mennesker. Inntil nylig har imidlertid kan UTI bare være modellert i kvinnelige dyr. Denne begrensningen har hindret studiet av sex forskjeller i UTI, samt andre blæren patologi, som kreft. Her beskriver vi en metode for å innpode mannlige mus som lar direkte sammenligning mellom kvinnelig og mannlig dyr og gi en detaljert protokoll for å vurdere blæren vev av flowcytometri å forstå vert Svar å infeksjon. Sammen vil disse tilnærmingene hjelpe i identifikasjon av vert faktorer som bidrar til kjønn biases observert i UTI og andre blæren-assosiert sykdommer.
Introduction
Urin skrift infeksjoner (UVI) er en av de vanligste infeksjonene i utviklede land1. Infeksjon priser er like mellom kvinner og menn blant nyfødte og eldre2. Premenopausale voksne kvinner, men har en betydelig økt forekomst av markedsstøtte ervervet UTI sammenlignet med menn2,3. Gitt at denne sykdommen påvirker hovedsakelig kvinner, har grunnleggende og klinisk forskning overveldende fokusert på UTI i kvinner. UTI i menn er imidlertid en betydelig og lite studert helsevesenet challenge4. Faktisk fordi UTI i menn forbundet med høyere sykelighet, er disse infeksjonene rutinemessig definert som komplisert4,5.
Som vår forståelse av sentral rolle i sex skjevheter i fysiologi og patologi utvikler seg, er nye metoder pålagt å utforske dette tidligere forsømte aspektet av sykdom. Kjønnsforskjeller spiller en viktig rolle i immunitet og infeksjon; kvinner har høyere forekomst av autoimmun sykdom, mens menn er mer utsatt for visse infeksjoner, som tuberkulose, malaria og HIV6,7. Blærekreft, en annen Urologiske patologi, er betydelig mer utbredt i menn enn hos kvinner, og flere studier har vist en rolle for androgener i utviklingen av malignitet8,9,10,11 ,12. Spesielt, men utføres undersøkelse av intravesical behandling for blærekreft utelukkende i kvinnelige dyr, på grunn av manglende evne til å gjentatte ganger catheterize mannlige mus13.
Studiet av UTI patogenesen stoler tungt på gnager modeller av infeksjon (f.eks, mus og rotter). Murine modeller av UTI kan ansette uropathogens opprinnelig isolert fra menneskelige infeksjoner, som uropathogenic E. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcuseller Proteus14. Vanligvis innføres bakterier i blæren via catheterization av urinrøret. Etter infeksjon, blæren og nyrene kan fjernes for å vurdere spesifikke parametrene av infeksjon, som bakteriell kolonisering, vevsskade eller vert immunrespons15,16. Universelt, men brukes bare kvinner dyrene for UTI forskning. Faktisk har mange studier anført at anatomiske årsaker, catheterization mannlige mus ikke er mulig13,17,18,19. Nylig en kirurgisk tilnærming til mannlige instillasjon har blitt beskrevet i som magen åpnes, blæren er eksternt fordrevet ved å bruke lett trykk på åpningen i magen og bakterier som injiseres i blæren20. Denne tilnærmingen gjør mannlige infeksjon, på bekostning av kirurgiske inngrep. Derfor inkluderer en stor påminnelse av denne tilnærmingen innflytelsen av betennelse, på utfallet av infeksjon som potensial til å indusere en anti-inflammatorisk sårhelende respons snitt21. Som våre interesser inkluderer forstå sex skjevhet i respons på sykdom, utviklet vi en metode for bakteriell intravesical instillasjon i mannlige mus som passer bedre veletablert ikke-kirurgisk transurethral fremgangsmåten som brukes i kvinnelige gnagere22 .
Vår modell bygger på en etablert metode og gir muligheten til å direkte sammenligne vert immunforsvaret til UTI i kvinnelig og mannlig dyr. Denne metoden vil tillate Disseksjon av sex-baserte forskjeller i infeksjon, og potensielt tilby molekylære og mobilnettet ledetråder uttales forskjellig mottakelighet og respons på infeksjon mellom kjønnene. I tillegg har denne modellen verdi utover UTI studier, slik at etableringen av modeller for å undersøke andre blæren-assosiert sykdommer, som blærekreft, prostatitt, under - eller over - aktiv blæren syndrom og interstitiell cystitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen eksperimenter ble utført i samsvar med godkjenning av Protokollnummer 2012-0024 av Comité d'éthique no expérimentation animale Paris sentrum et Sud (etikk komiteen for dyr eksperimentering), i anvendelsen av det europeiske direktivet 2010/63 EU.
1. utarbeidelse av katetre
- Forberede en pediatric intravenøs tilgang kanyle for hver gruppe med mus er infisert. Ved hjelp av innebygget våren mekanisme, selge hver kanyle av sin nål, som instruert av produsenten. Kast nåler, beholder bare de plast intravenøs kanyle.
- Sterilisere katetre i laminær strømning hette for en ultrafiolett (UV) syklus, vanligvis 25-30 min.
Merk: Katetre kan brukes for flere musen, men en ny kateter som skal brukes mellom eksperimentelle grupper, kjønn eller bakteriell stammer.
2. forberedelse av Uropathogenic E. coli for infeksjon
- Minst to dager før infeksjon, bruker en sterilt inokuleringen sløyfe, strek UPEC fra en frossen bakteriell lager på en Luria kjøttkraft (LB) agar tallerken, som inneholder antibiotika eventuelt. Ruge på 37 ° C over natten. Platene kan lagres på 4 ° C i opptil en uke.
- I en 100 ml steril Erlenmeyer kolbe, vaksinere 10 ml LB, som inneholder antibiotika behov med en enkelt koloni fra LB platen og ruge står på 37 ° C over natten (ca 16-18 hr).
Merk: Stående kulturer tillater uttrykk for type 1 pili, som er nødvendige for infeksjon23. Kulturer vokst risting vil ha mindre effektiv pili uttrykk, og derfor inkonsekvent utbredelsen av smitte. - Måle optisk tetthet (OD)600 av natten kultur og beregne antall bakterier per ml bruker en forhåndsbestemt vekstkurve. Som et eksempel for UPEC belastning UTI89, OD600 = 0,35 tilsvarer 2 x 108 CFU per ml, dermed en overnatting kultur med et OD600 = 2.4 skulle tilsvare 13.7 x 108 CFU per ml. empirisk bestemme forholdet mellom den OD600 og levedyktig bakterier med hver ny stamme ansatt for infeksjon.
-
Bestemme hvor mye bakterier nødvendig med tanke på antall dyr er infisert, og at hver musen skal få ca 107 colony-forming enheter (CFU) 50 μl PBS. Ta med i beregningen ~ 130 µl døde volumet av kateter og sprøytebytteprogrammer nub og 100 µl nødvendig for å avgjøre inoculum.
- Spinn bakteriell suspensjon i en tabletop microcentrifuge 17000 x g for 1 min, og resuspend den resulterende bakteriell pellet på 2 x 108 CFU per ml i PBS. Serielt fortynne en aliquot av denne suspensjon og plate LB agar, med antibiotika om nødvendig å bestemme den nøyaktige inoculum for hver infeksjon.
- Tegn på bakteriell inoculum 1 ml sprøyter til og knytte kateter til slutten av sprøyten. Tapp sprøyten for å fjerne all luft og trykk ned stempelet slik at tomrommet dead air i kateter før du starter instillasjon.
3. forberedelse av mus
- Bedøve mus via intraperitoneal injeksjon av 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazine. Ekstra varme kan angis.
- Kontroller at hver musen er fullt bedøvet ved å klemme footpad med middels press. Mus er fullt bedøvet når de ikke reagere og trenger 3-5 minutter å oppnå denne tilstanden.
- Plasser mus supine og bruke middels press på nedre del av magen tømme blæren av urin. Full blærer føler en ert under huden mellom ileac toppene.
Merk: Inhalert isoflurane er brukt til å catheterize kvinnelige mus15,22, men det har ikke blitt testet om mannlige mus er tilstrekkelig anesthetized av inhalert isoflurane for denne prosedyren.
4. transurethral instillasjon kvinnelige mus
- Bruker ikke-dominante hånd, plassere tommelen på halen og en finger på den samme hånden på bakkroppen av musen og bruke lett trykk i motsatte retninger å holde musen fast på plass.
-
Plassere kateter vinkelrett på musen på urethral orifice. Med lett press, skyv kateter inn i urinrøret, til huben møter urethral munnstykket, mens samtidig redusere sprøyten slik at den blir parallell til arbeidsgruppen overflaten. Kateter krever ingen smøring. Ikke presse eller tvinge kateter inn i urethra. Kateter bør Skyv jevnt og lett inn i urinrøret, med liten eller ingen motstand.
- Før instilling inoculum (trinn 4.3), en gang er kateter på plass, veldig forsiktig Trekk mage huden mot hodet av musen med fingeren fra det ikke-dominant hånd som er allerede på magen av mus (trinn 4.1). Hvis kateter i urinrøret, vevet komponere urinrøret munnstykket vil ikke flytte, mens hvis kateter plasseres feil i skjeden, vevet flyttes opp og unna kateter. Denne raske testen skal utføres på hver musen.
- Når navet av kateter urethral munnstykket, sakte dispensere 50 µl av bakteriell inoculum. En langsom instillasjon rate minimerer vesicoureteral reflux i nyrene. Fjern sakte kateter for å forhindre lekkasje, over antallet 5. Plasser mus inne deres burene i supine posisjon.
5. transurethral instillasjon mannlige mus
- Plass to tommelen tang cranially og caudally til musen er eksterne genitalia. Trekke prepuce å fullt avsløre glans penis. Når penis er eksternt plassert, slipp tommelen tang.
- Omplasser tang for å stabilisere stikker penis vinkelrett dyret, holde orgelet forsiktig, men tautly. Visualisere urethral kjøtt og nøye introdusere kateter inn i små åpningen på spissen av orgelet. Lysbildefremvisningen i kateter inn i penis, mot selve musen, opprettholde mild spenning med tang. Kateter krever ingen smøring. Ikke Tving kateter inn i penis; kateter skal gli mykt inn i urinrøret, som angir riktig plassering.
- Når navet av kateter oppfyller tuppen av penis, veldig sakte dispensere 50 µl av inoculum, samtidig som plasseringen av penis. Kvaliteten på instillasjon kan noteres på denne tiden i henhold til en forhåndsbestemt instillasjon kvalitetspoeng, som vist i figur 2.
- Trekke tilbake kateter langsomt, over antall 5, for å forhindre lekkasje av inoculum. Plasser mus inne deres burene i supine posisjon. Dyr burde begynne å gjenopprette 30-45 minutter etter administrasjon av anesthetic.
6. fastsettelse av CFU i infiserte organer
- Ved forhåndsbestemt tid-poeng godkjent offer mus ved hjelp av standard operasjonsprosedyrer (f.eks, cervical forvridning eller karbondioksid overdose). Fukt magen grundig med 70% etanol å redusere forurensning av pels.
- Gjør et snitt over nedre tredjedel av musen er magen på minst 2 cm med saks og tas aseptisk fjerne blæren og andre ønskede organer, inkludert men ikke begrenset til, nyrer, testikkel, sædblærene eller preputial kjertler, i 5 ml polypropylen snapin cap rør som inneholder 1 ml steril PBS. Holde alle prøvene på is.
- Homogenize organer med en håndholdt homogenizer til nesten ingen solid vev gjenstår, ca 15-60 sek avhengig av orgelet. Fett homogenize ikke godt, og er lett gjenkjennelig som skinnende beige-hvit vev. Kaste fett før eller etter homogenisering. Legg til homogenizer i etanol etterfulgt av PBS mellom hver eksperimentelle eller orgel.
Merk: Vanligvis bruk håndholdt homogenizers eller perle mill homogenizers. Mens alle disse systemene har gitt lignende resultater, som bestemmes av direkte sammenligning av bakteriell CFU på 24 hr etter infeksjon, bør optimale forhold til homogenize vert vev samtidig bevare bakteriell levedyktighet fastsettes empirisk før utfører denne protokollen rutinemessig. - Utføre føljetong fortynninger av homogenisert orgel suspensjoner. Plate fortynninger på LB agar plater, som inneholder antibiotika, om nødvendig, og ruge over natten (~ 15 hr) på 37 ° C. UPEC stammer har svært rask dobling ganger og som sådan, bør man være forsiktig å ikke ruge agar platene lenge fordi dette vil hindre muligheten til å telle personlige kolonier.
7. flyt Cytometric analyse av blæren vev
- Forberede fordøyelsen bufferen som inneholder collagenase på 34 enheter/mL og DNase på 100 µg/mL, i PBS. Hold på is. Forberede en 15 ml konisk tube per dyr å bli analysert og aliquot 1 ml fordøyelsen buffer per rør.
- På forhåndsbestemte timepoints godkjent offer mus ved hjelp av standard operasjonsprosedyrer (f.eks cervical forvridning eller karbondioksid overdose). Fukt magen grundig med 70% etanol å redusere forurensning av pels.
-
Gjør et snitt i nedre tredjedel av musen er magen på minst 2 cm med saks og fjerne hele blæren. Hakke med saks, kutte blæren i 2-3 mm2 størrelse stykker, vanligvis omtrent 8 brikker.
- Legge til en hakket blæren per rør som inneholder fordøyelsen buffer. Rist for å vaske hakket blæren vevet inn i fordøyelsen buffer. Hold på is til alle blærer er dissekert og hakket.
- Inkuber hakket blærer i 60-75 min ved 37 ° C, med energisk skjelvende hånd for 5 s hvert 15 min. Når vevet har glassaktig gjennomsiktig utseende, ligner vått papir, er fordøyelsen fullført. Langvarig fordøyelsen fjerner overflaten proteiner fra cellene trengs for identifikasjon og bør unngås.
- Deaktiver fordøyelsen enzymer ved å legge til 2-3 mL iskald flyt cytometri buffer (PBS som inneholder 2% fosterets bovin serum (FBS) og 0.2 mM EDTA) og bland forsiktig. Plasser rør på isen.
- Sikre en enkeltcelle suspensjon og fjerne alle bindevev, passere innholdet i røret gjennom en 100 µm filter plassert i et 15 mL konisk rør. Trykk forsiktig eventuelle gjenværende vev gjennom filteret med slutten av en sprøytestempelet. Filteren vaskes med en ekstra 2 mL flyt cytometri buffer. Holde prøvene på is.
- Vask prøver med sentrifugering i 7 min 200 x g, 4 ° C. Resuspend pellets i 100 µL flyt cytometri buffer med Fc blokk, utvannet til 5 µg/mL og overføre til en 96-brønns rundt bunnplaten. Etter 10-15 min, kan du legge 100 µL ønsket antistoff cocktail til hvert utvalg. Inkuber prøver for 30-45 min, på is, beskyttet mot lyset.
Merk: Fc er en reagens brukt til å forebygge binding av Fc delen av antistoffer mot celler uttrykke Fc reseptorer. Formålet er å minimere uspesifikke antistoff bindende. Fastsettelse av antistoffer bruke vil være avhengig av hypotesen blir testet i eksperimentet og bør velges med innspill fra litteraturen. I Figur 3, for å måle samlet immun celle infiltrasjon, ble et anti-CD45 antistoff ansatt, som er et protein som pan-immune cellen. - Vask prøver med sentrifugering i 7 min 200 x g, 4 ° C. Resuspend celle pellets 200 µL flyt cytometri buffer og går prøver gjennom en 40 µm celle sil på en 5 ml polystyren tube like før oppkjøpet på en flyt cytometer.
- Samle hele prøven på flyt-cytometer. En god fordøyelse vil gi 200.000-400 000 celler, med 8000-10.000 CD45+ immunceller fra naiv musen blæren, mens infiserte organer inneholder flere celler16 (Figur 3).
Merk: Prøver forberedt flyt cytometric analyse kan ikke brukes til å evaluere CFU. Det anbefales ikke å dele blæren i to deler, finnes det ingen bevis for å demonstrere at UPEC kolonisering eller immun celle infiltrasjon uniform gjennom vevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utviklingen av denne protokollen alderen kohorter av kvinnelige og mannlige C57Bl/6 mus 6 til 8 uker ble innpodet og bakterielle belastningen i blærer på tidspunkt alt fra 1 time til 30 dager. Resultatene fra disse studiene er detaljert andre steder (Zychlinsky Scharff et al., ventende). Her presenterer vi representant data fra 24 hr infeksjoner. Spesielt, var bakteriell byrden tilsvarende mellom mannlige og kvinnelige mus på 24 hr etter infeksjon (figur 1). Liten variasjon i bakterielle belastningen ble observert i hver gruppe 24 timer etter infeksjon, ligner det har blitt rapportert i kvinnelige mus15,16.
Hvis care er tatt for å tilstrekkelig tom blærer urin før infeksjon, er betydelig lekkasje av inoculum sjelden observert i kvinnelige mus. Imidlertid resultert instillasjon i mannlige mus i betydelige mengder bakteriell inoculum lekker fra urinrøret, spesielt under utviklingsfasen av denne protokollen. For å fastslå om tap av inoculum samtidig med infeksjon påvirket kolonisering eller etablering av infeksjon, ansatt vi ratingsystem for hver instillasjon. Hver instillasjon ble scoret på en skala fra 1-5, med 1 som den mest optimale og bakteriell koloniseringen var bestemt 24 timer etter infeksjon (figur 2, boks). Mens dette systemet var etterforsker avhengige, og derfor potensielt subjektive, den primære forfatteren av denne studien fastsatt alle score etter instillasjon, før evaluering av bakteriell byrden på infiserte blærer. Ingen statistisk signifikante forskjeller fantes blant CFU fra dyr med forskjellige instillasjon score, som vurdert av en parametriske Kruskal-Wallis-test sammenligner mener rangeringen av hver kolonne med mener rangeringen av hver andre kolonnen (p = 0,17) og korrigere for flere sammenligninger når du bruker en Dunn test. Fra denne analysen, kan det konkluderes at suboptimal instillations (score > 3), som resulterer i betydelig lekkasje av bakteriell inoculum under infeksjon, ikke betydelig ha bakteriell kolonisering på 24 hr (figur 2, grafen). Spesielt med erfaring, hyppigheten av lekker i mannlige mus redusert betydelig.
Endelig var målet i å utvikle denne modellen direkte sammenligne immunforsvaret til UPEC i kvinnelig og mannlig dyr. Å teste om cellular infiltrasjon er endret mellom kjønnene svar på UTI, antall CD45+ immunceller i naiv og infiserte kohorter av kvinnelige og mannlige mus ble vurdert av flowcytometri. Mens antall immunceller i naiv dyr ikke var forskjellig mellom kvinnelige og mannlige mus (p = 0,95), var det en statistisk signifikant økning i infiltrasjon i blærer infiserte kvinnelige mus (p = 0.0015) (Figur 3A-B).
Figur 1: UPEC Colonizes kvinnelige og mannlige blærer med lik effektivitet. Seks til 8 uker gamle kvinnelige og mannlige C57Bl/6 mus ble innpodet med 107 CFU av UPEC. 24 timer etter infeksjon, blæren var tas aseptisk fjernet for å nummerere bakteriell byrden. Plottet viser CFU/blære. Hvert punkt er en mus, representant eksperiment 5 vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvalitet av instillasjon ikke samsvarer med bakteriell byrden på 24 hr etter infeksjon. Seks til 8 uker gamle kvinnelige og mannlige C57Bl/6 mus ble innpodet med 107 CFU av UPEC. Umiddelbart etter hver instillasjon tildelt en enkelt forsker kvalitetspoeng instillasjon, som definert av bestemte kriterier (innrammet tekst). 24 timer etter infeksjon, blæren var tas aseptisk fjernet for å nummerere bakteriell byrden. Handlingen viser den tilordnede kvalitet score versus CFU/blære. Hvert punkt er ett museklikk, 5 gruppert eksperimenter vises. p = 0,17, Kruskal-Wallis test sammenligner mener rangeringen av hver kolonne med mener rangeringen av hver andre kolonnen med post hoc Dunn test for flere sammenligninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immune celle infiltrasjon økes i kvinnelige mus svar på UTI. Seks 8 ukers gamle kvinnelige og mannlige C57Bl/6 mus ble innpodet eller ikke med 107 CFU av UPEC. Representant dot tomter viser totalt blæren celler med CD45+ immunceller gated rosa fra naiv eller infisert mus. Grafen viser absolutte antallet CD45+ immunceller i blærer naiv eller 24 hr infiserte mus. Hvert punkt er en mus, 2 gruppert eksperimenter vises. p-verdier bestemmes av Mann-Whitney test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transurethral instillasjon mannlige mus gir mange nye forskningsmuligheter til påvirkning av sex på blæren mucosal sykdom, men også presenterer flere utfordringer. Fremst, en begrensning er at instillasjon utgangspunktet kan vise seg for å være teknisk vanskelig, noe som resulterer i overdreven betennelse under kateter innsetting. Forbedring i teknikken kan oppnås ved instillasjon død mus med en farget løsning, for eksempel Evans blå farge. For å bekrefte at instillasjon er vellykket, blærer bør være visuelt inspisert og volumet av innpodet væske kan evalueres av utvinning med tuberkulin sprøyte. Betydningen av treg, mild bevegelser kan ikke overvurderes: det skal ingen motstand og uten kraft brukes til å sette inn kateter, dette fører til overflødig betennelse og skade på vev. Når utført korrekt, vil kateter Skyv uanstrengt inn i urethra. Hvis føles motstand eller hindring, er det best å fjerne kateter og reattempt innsetting.
Ved å samkjøre kvaliteten på instillasjon bakteriell byrden 24 timer etter infeksjon, vi viste at en imperfektum teknikk, der en liten mengde av bakteriell inoculum går tapt ved infeksjon, fortsatt gir robust kolonisering av den blæren. I å utnytte denne protokollen, bør en etterforsker sikte på å oppnå lekkasje instillations. Men sikrer robust prosedyren at imperfektum instillations vil fortsatt tilby nyttige data og interpretable resultater.
Den store fordelen av våre teknikk over den eneste publiserte alternative metoden for mannlige blæren infeksjon er dens ikke-invasiv, ikke-kirurgisk tilnærming. Vår tilnærming med transurethral instillasjon følger fysiologiske ruten gjennom urinrøret til blæren, uten å forstyrre den strukturelle integriteten av magen. Invasiv teknikken, beskrevet av Olson og kolleger20, omfatter faktorer iboende kirurgiske prosedyrer, inkludert betennelse, forsinket healing, og resulterende arrvev. Spesielt relevant med hensyn til studier av immunrespons for infeksjon er organismens svar på kirurgisk traumer. Dette inkluderer dannelsen av en pro-inflammatoriske miljøet og potensielle vev korning, samt en anti-inflammatorisk sår helbredelse programmet som en del av helbredelsesprosessen. Disse faktorene representerer uønskede påvirkninger i innstillingen eksperimentelle.
Endelig var målet med denne studien å utvikle en metode som tillater direkte sammenligning av mannlige og kvinnelige immunreaksjoner i løpet av UTI, som kan brukes til fremtidige studier påvirkning av sex på blæren mucosal sykdom, for eksempel infeksjon og kreft biologi. Som en andre klar fordel beskrevet metoden her speil som brukes i kvinnelige mus for tiår19. Dermed er eksperimenter utført i mannlige mus med denne teknikken sammenlignbare med bred brødtekst eksisterende forskning. Vår eksperimenter har avdekket at forskjeller i svaret finnes og at disse forskjellene kan gi ledetråder for å forstå sex-baserte forskjeller svar på slimhinnene infeksjoner, samt andre sykdommer av blæren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Matthieu Rousseau for kritisk lesning av manuskriptet og laboratoriet av dendrittiske Immunobiology for deres nyttig innsikt i utviklingen av denne protokollen og prosjekt. Dette arbeidet var støttes delvis av finansiering fra EU syvende Framework Programme Marie Curie handlingen (PCIG11-GA-2012-3221170 og immun-onkologi LabEx (MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N.
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
