Summary
Das etablierte Modell der transurethrale Katheterisierung von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Erkrankungen der Blase, einschließlich urinausscheidende Fläche Infektion, aber kann nur bei Frauen durchgeführt werden. Ein neues Modell der männlichen transurethrale Instillation, das hier vorgestellte wird Forschung in einem Gebiet, geprägt von starken klinischen und epidemiologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu ermöglichen.
Abstract
Harnwegsinfektionen (HWI) sind sehr häufig weltweit entstehen erhebliche Morbidität und krankenhausbedingten Ausgaben. Kleiner Tiermodelle, die Krankheit Einrichtung und Progression widerspiegeln, erlauben Dissektion der Wirt-Pathogen Interaktionen und Erzeugung von Immunität gegen Infektionen. Bei Mäusen intravesikale Instillation von adhärent E. Coli, das auslösende Agens in mehr als 85 % der Gemeinschaft erworben UTI, rekapituliert viele von den Stadien der Infektion beim Menschen beobachtet. Bis vor kurzem jedoch könnte UTI nur bei weiblichen Tieren modelliert werden. Diese Einschränkung hat die Studie von Sex-bezogene Unterschiede in UTI sowie andere Blase Krankheiten, wie Krebs verhindert. Hier beschreiben wir eine Methode, um männliche Mäuse, der direkte Vergleich zwischen weiblicher und männlicher Tiere erlaubt zu vermitteln und bieten ein detailliertes Protokoll um Blase Gewebe durch Durchflusszytometrie als ein Mittel, um besser zu verstehen, Host Antworten auf Infektion zu beurteilen. Zusammen, helfen diese Ansätze bei der Identifizierung von Host Faktoren, die zum Sex Neigungen in UTI und anderen Blase-assoziierten Erkrankungen beobachtet beitragen.
Introduction
Harnwegsinfektionen (HWI) sind eine der häufigsten Infektionen in entwickelten Ländern1. Infektionsraten sind ähnlich zwischen Weibchen und Männchen unter Neugeborene und ältere2. Erwachsene Frauen vor den Wechseljahren, haben jedoch eine stark erhöhte Inzidenz von ambulant erworbenen UTI im Vergleich zu Männern2,3. Angesichts der Tatsache, dass diese Krankheit in erster Linie Frauen auswirkt, konzentriert Grundlagenforschung und klinische Forschung überwiegend UTI bei Frauen sich auf. Harnwegsinfektionen bei Männern ist jedoch eine deutliche und erforschten Gesundheitswesen Herausforderung4. In der Tat, da UTI bei Männern sind mit höheren Morbidität verbunden, diese Infektionen routinemäßig als komplizierte4,5gelten.
Wie entwickelt sich unser Verständnis von der zentralen Rolle der Sex-Verzerrungen in Physiologie und Pathologie, müssen neue Methoden dieser bisher vernachlässigten Aspekt der Krankheit zu erforschen. Geschlechtsunterschiede spielen eine wesentliche Rolle in Immunität und Infektion; die Weibchen haben höhere Inzidenz von Autoimmun-Krankheit, während Männchen anfälliger für bestimmte Infektionen wie Tuberkulose, Malaria und HIV6,7 sind. Blasenkrebs, eine weitere urologische Pathologie ist deutlich häufiger bei Männern als bei Frauen, und mehrere Studien für Androgene eine Rolle bei der Entwicklung von malignen Erkrankungen8,9,10,11 ,12. Insbesondere erfolgt ausschließlich bei weiblichen Tieren aufgrund der Unfähigkeit, wiederholt männliche Mäuse13Katheterisieren jedoch Untersuchung intravesikale Therapien für Blasenkrebs.
Die Studie von UTI Pathogenese stützt sich stark auf Nager-Modelle der Infektion (z.B., Mäuse und Ratten). Murine Modelle von Harnwegsinfektionen können beschäftigen Uropathogens ursprünglich von Infektionen beim Menschen, wie z. B. adhärent E. Coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcusoder Proteus14isoliert. In der Regel werden Bakterien in die Blase über Katheterisierung der Harnröhre eingeführt. Nach Infektion, Blase und Nieren kann entfernt werden, um bestimmte Parameter der Infektion, wie bakterielle Besiedlung, Gewebeschäden oder Host Immunantwort15,16zu bewerten. Universell, sind jedoch nur weibliche Tiere für UTI Forschung verwendet. In der Tat haben viele Studien festgestellt, dass, aus anatomischen Gründen, Katheterisierung von männlichen Mäusen nicht möglich13,17,18,19. In jüngerer Zeit, ein chirurgisches Vorgehen zu männlichen Instillation ist beschrieben worden, in dem der Bauch geöffnet ist, die Blase wird durch sanften Druck auf die Öffnung in den Bauch nach außen verdrängt und Bakterien in die Blase20eingespritzt werden. Dieser Ansatz ermöglicht es männliche Infektion, auf Kosten der chirurgischen Intervention. So enthält eine wichtige Einschränkung dieses Ansatzes die Beeinflussung der Entzündung, das Ergebnis einer Infektion wie z. B. das Potenzial, eine entzündungshemmende Wundheilung Antwort auf die Schnitt-21zu induzieren. Da unsere Interessen Sex Bias als Reaktion auf die Krankheit zu verstehen gehören, entwickelten wir eine Methode der bakteriellen intravesikale Instillation bei männlichen Mäusen, die seit langem bestehenden nicht-chirurgische transurethrale Vorgehensweise bei weiblichen Nagern22 mehr entspricht .
Unser Modell basiert auf einer bewährten Methodik und bietet die Möglichkeit, die Host-Immunantwort auf UTI bei weiblichen und männlichen Tieren direkt zu vergleichen. Diese Methode wird Dissektion der geschlechtsspezifische Unterschiede in der Infektion zu ermöglichen und potenziell bieten molekularen und zellulären Hinweise auf die ausgeprägte Unterschiede in der Empfindlichkeit und Reaktion auf die Infektion zwischen den Geschlechtern. Darüber hinaus hat dieses Modell Wert jenseits UTI Studien, ermöglicht die Einrichtung von Modellen zur anderen Blase-assoziierten Erkrankungen, z. B. Blasenkrebs, Prostatitis, unter oder über der proaktiven Blase Syndrom und interstitielle Zystitis zu untersuchen.
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Protocol
Maus-Experimente wurden im Einklang mit Genehmigung des Protokoll-Nummer 2012-0024 vom Comité d'Éthique de Expérimentation Animale Paris Centre et Sud (der Ethikkommission für Tierversuche), in Anwendung der Europäischen Richtlinie 2010/63 EU.
1. Vorbereitung von Kathetern
- Bereiten Sie eine pädiatrische intravenösen Zugang Kanüle für jede Gruppe von Mäusen, angesteckt zu werden. Veräußern Sie mit Hilfe des eingebauten Federmechanismus, jede Kanüle von der Nadel, wie vom Hersteller angewiesen. Entsorgen Sie die Nadeln, erhalten nur die Kunststoff intravenöse Kanüle.
- Sterilisieren Sie Katheter in einer Laminar-Flow-Haube für eine Ultraviolett (UV) Zyklus, in der Regel 25-30 min..
Hinweis: Katheter können für mehrere Mäuse verwendet werden, jedoch ein neuen Katheter zwischen Versuchsgruppen, Geschlechtern oder Bakterienstämme verwendet werden soll.
2. Vorbereitung von adhärent E. Coli Infektion
- Mindestens zwei Tage vor der Infektion mit einer sterilen Inokulation Schleife, Streifen UPEC aus einem gefrorenen bakterielle bestand auf einer Agarplatte Luria Brühe (LB), Antibiotika-haltigem gegebenenfalls. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Platten können bis zu eine Woche lang bei 4 ° C gelagert werden.
- In eine sterile 100 ml-Erlenmeyerkolben 10 ml LB, Antibiotika, gegebenenfalls mit einer einzigen Kolonie von der LB-Platte mit impfen und Inkubation bei 37 ° C über Nacht (ca. 16-18 h).
Hinweis: Stehende Kulturen erlauben die Expression von Typ 1 Pili, die zur Infektion23erforderlich sind. Kulturen angebaut, schütteln werden weniger effizient Pili Ausdruck haben und daher inkonsistent Rate der Infektion. - Messen Sie die optische Dichte (OD)600 der Nacht Kultur und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml mit einer vorab festgelegten Wachstumskurve. Als ein Beispiel für UPEC-Stamm UTI89, OD600 = 0,35 ist gleichbedeutend mit 2 x 108 KBE pro ml, also eine Übernachtung Kultur mit einer OD600 = 2,4 wäre gleichbedeutend mit 13,7 x 108 KBE pro ml. empirisch bestimmen das Verhältnis zwischen der OD600 und lebensfähige Bakterien mit jeder neuen Stamm für Infektion eingesetzt.
-
Bestimmen Sie die Menge der Bakterien erforderlich unter Berücksichtigung der Zahl der Tiere infiziert sein und, dass jede Maus ca. 107 Koloniebildenden Einheiten (KBE) erhalten sollten in 50 µl PBS. Einbeziehen Sie die ~ 130 µl Totvolumen der Katheter und Spritze Kern und 100 µl benötigt, um das Inokulum bestimmen in die Berechnung.
- Drehen der Bakteriensuspension in eine Tischplatte Microcentrifuge 17.000 x g für 1 min und Aufschwemmen der resultierenden bakterielle Pellets 2 x 108 KBE pro ml mit PBS-Puffer. Seriell verdünnen Sie eine aliquote dieser Aussetzung und Platte auf LB-Agar, mit Antibiotika, wenn angebracht, um das genaue Inokulum für jede Infektion festzustellen.
- Ziehen Sie das bakterielle Inokulum in eine 1 ml Spritze und befestigen Sie den Katheter am Ende der Spritze. Tippen Sie auf die Spritze um Luft zu entfernen, und drücken den Kolben um den Toten Luftraum in den Katheter zu füllen, vor Beginn der Instillation.
3. Vorbereitung der Mäuse
- Mäuse über intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin zu betäuben. Zusätzliche Wärme kann zur Verfügung gestellt werden.
- Stellen Sie sicher, dass jede Maus voll sediert ist, durch Zusammendrücken der Straßenräuber mit mittlerem Druck. Mäuse sind voll sediert, wenn sie nicht reagieren und ca. 3-5 min benötigen, um diesen Zustand zu erreichen.
- Legen Sie Mäuse Rückenlage und mittlere Druck auf den Unterleib, die Blase Urin zu entleeren. Volle Blase fühlen Sie sich wie eine Erbse unter der Haut zwischen den ileac Wappen.
Hinweis: Inhalative Isofluran verwendet wurde, um weibliche Mäuse15,22Katheterisieren, jedoch wurde es nicht getestet, ob männliche Mäuse durch eingeatmete Isofluran für dieses Verfahren ausreichend betäubt sind.
(4) transurethrale Instillation von weiblichen Mäusen
- Mit der nichtdominanten Hand, legen Sie den Daumen auf das Heck und einen Finger der gleichen Hand auf dem Bauch der Maus und üben Sie sanften Druck in entgegengesetzter Richtung um die Maus fest in Position zu halten.
-
Setzen Sie die Spitze des Katheters an der Harnröhrenmündung senkrecht auf die Maus. Schieben Sie mit sanftem Druck den Katheter in die Harnröhre bis Hub der Harnröhrenmündung entspricht und gleichzeitig senken die Spritze, so dass es parallel zur Arbeitsfläche. Der Katheter ist keine Schmierung erforderlich. Nicht drücken oder den Katheter in die Harnröhre zu erzwingen. Der Katheter sollte glatt und leicht in die Harnröhre, mit wenig bis keinen Widerstand schieben.
- Vor dem Einträufeln des Inokulums (Schritt 4.3), einmal ist der Katheter in Platz, sehr sanft ziehen die Bauchhaut in Richtung des Kopfes von der Maus mit dem Finger von der nicht-dominanten hand, die bereits auf dem Bauch der Maus (Schritt 4.1) ist. Wenn der Katheter in der Harnröhre, ist das Gewebe die Harnröhre Öffnung komponieren bewegt sich nicht, während wenn der Katheter nicht korrekt in der Vagina platziert wird, das Gewebe oben und Weg von den Katheter bewegen wird. Dieser Schnelltest sollte jede Maus erfolgen.
- Wenn der Hub des Katheters der Harnröhrenmündung trifft, verzichten Sie langsam 50 µl des bakteriellen Inokulums. Eine langsame Instillation Rate minimiert vesikoureteralem Reflux in die Niere. Langsam entfernen des Katheters um austreten, über eine Anzahl von 5 zu vermeiden. Legen Sie die Mäuse in ihren Käfigen in Rückenlage.
(5) transurethrale Instillation von männlichen Mäusen
- Platzieren Sie zwei Daumen Pinzetten cranially und kaudal an der Maus äußeren Genitalien. Zurückziehen der Vorhaut um die Eichel vollständig offen zu legen. Sobald der Penis nach außen positioniert ist, lassen Sie die Daumen-Zange.
- Positionieren Sie die Zange um den abstehenden Penis senkrecht auf das Tier, halten die Orgel, sanft, aber straff zu stabilisieren. Visualisieren Sie die urethralen Meatus zu und führen Sie vorsichtig des Katheters in die kleine Öffnung an der Spitze der Orgel ein. Sanft führt des Katheters in den Penis, auf den Körper der Maus, sanfte Spannung mit der Zange aufrechtzuerhalten. Der Katheter ist keine Schmierung erforderlich. Zwingen Sie den Katheter nicht in den Penis; der Katheter sollte reibungslos in die Harnröhre, die Angabe korrekten Platzierung schieben.
- Sobald die Nabe des Katheters die Spitze des Penis trifft, verzichten Sie sehr langsam 50 µl des Inokulums, unter Beibehaltung der Position des Penis. Die Qualität der Instillation kann zu diesem Zeitpunkt nach einem vorgegebenen Instillation Qualitätsfaktor, wie in Abbildung 2dargestellten beachtet werden.
- Ziehen Sie den Katheter langsam, über eine Anzahl von 5 verhindert Auslaufen des Inokulums. Legen Sie die Mäuse in ihren Käfigen in Rückenlage. Tiere sollten beginnen sich zu 30-45 min nach Verabreichung von der Narkose erholen.
6. Bestimmung der KBE in infizierten Organen
- Zu vorgegebenen Zeitpunkten genehmigt Opfer Mäuse mit Standardarbeitsanweisungen (z.B., zervikale Dislokation oder Kohlendioxid Überdosierung). Befeuchten Sie den Bauch gründlich mit 70 % Ethanol, Kontamination von Fell zu minimieren.
- Machen Sie einen Einschnitt in das untere Drittel der Maus Bauch von mindestens 2 cm mit einer Schere und aseptisch entfernen Sie der Blase und jede andere gewünschte Organe, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Nieren, Hoden, Samenbläschen oder Präputial Drüsen, in 5 ml Polypropylen-Snap Cap Röhrchen mit 1 ml sterile PBS. Halten Sie alle Proben auf Eis.
- Homogenisieren der Organe mit einem Handheld-Homogenisator, bis fast keine festen Gewebe bleibt, ca. 15-60 Sek. je nach Organ. Fett ist nicht gut homogenisieren und ist leicht erkennbar, wie glänzend Beige-weiß-Gewebe. Vor dem Fett oder folgenden Homogenisierung zu verwerfen. Waschen Sie den Homogenisator in Ethanol gefolgt von PBS zwischen jede experimentelle oder Orgel-Gruppe.
Hinweis: In der Regel verwenden Sie handheld Homogenisatoren oder Korn Mühle Homogenisatoren. Während alle diese Systeme ähnliche Ergebnisse wie festgelegt durch direkten Vergleich der bakteriellen KBE in 24 Stunden nach der Infektion ergab haben, sollte die optimalen Bedingungen für Wirtsgewebe zu homogenisieren, unter Beibehaltung der bakteriellen Lebensfähigkeit empirisch vor bestimmt werden Dieses Protokoll durchführen routinemäßig. - Führen Sie serielle Verdünnungen von homogenisierten Orgel Suspensionen. Verdünnungen auf Agarplatten LB, gegebenenfalls Antibiotika-haltigem Platte und inkubieren Sie über Nacht (ca. 15 Std.) bei 37 ° C. UPEC Stämme haben sehr schnelle Verdoppelung Zeiten und als solche sollte darauf geachtet werden, nicht zu lange Agarplatten inkubieren, weil dadurch die Fähigkeit, einzelne Kolonien zählen behindert wird.
(7) durchflusszytometrischen Analyse der Blase Gewebe
- Bereiten Sie Verdauung-Puffer mit Kollagenase 34 Einheiten/ml und DNase 100 µg/ml, mit PBS-Puffer vor. Halten Sie auf dem Eis. Bereiten Sie ein 15 ml konische Röhrchen pro Tier zu analysierenden und aliquoten 1 ml Verdauung Puffer pro Röhre.
- An vorgegebenen Zeitpunkten genehmigt Opfer Mäuse mit Standardarbeitsanweisungen (z. B. zervikale Dislokation oder Kohlendioxid Überdosierung). Befeuchten Sie den Bauch gründlich mit 70 % Ethanol, Kontamination von Fell zu minimieren.
-
Machen Sie einen Einschnitt in das untere Drittel der Maus Bauch von mindestens 2 cm mit einer Schere und entfernen Sie die gesamte Blase. Hackfleisch gut mit der Schere, die Blase in 2-3 mm2 große Stücke, in der Regel ca. 8 Stücke schneiden.
- Fügen Sie eine gehackte Blase pro Röhre, die Verdauung Puffer enthält. Schütteln Sie um Hackfleisch / Blase Gewebe in der Verdauung-Puffer zu waschen. Halten Sie auf Eis, bis alle Harnblasen seziert und gehackt sind.
- Inkubieren Sie Hackfleisch / Blase 60-75 Minuten bei 37 ° C, mit kräftig schütteln von hand für 5 s alle 15 Minuten. Wenn das Gewebe eine transparente glasig hat, ähnlich nassen Tissue-Papier, ist die Verdauung abgeschlossen. Verlängerte Verdauung wird von den Zellen benötigt zur Identifizierung Oberflächenproteine entfernen und sollte vermieden werden.
- Inaktivieren Sie die Verdauung Enzyme zu, durch Zugabe von 2-3 mL eiskaltes Flow Cytometry Puffer (PBS, enthält 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 0,2 mM EDTA) und mischen Sie vorsichtig. Legen Sie Rohre auf Eis.
- Um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewährleisten und alle Bindegewebe zu entfernen, durchlaufen Sie den Inhalt des Röhrchens eine 100 µm-Filter in einem 15 mL konische Röhrchen platziert. Drücken Sie vorsichtig alle übrigen Gewebe durch den Filter mit dem Ende des einen Spritzenkolbens. Waschen Sie den Filter mit einer zusätzliche 2 mL Flow Cytometry Puffer. Halten Sie die Proben auf Eis.
- Waschen Sie Proben durch Zentrifugation für 7 min bei 200 X g, 4 ° C. Aufzuwirbeln Sie Pellets in 100 µL Flow Cytometry Puffer mit Fc Block, verdünnt 5 µg/mL und Übertragung auf eine 96-Well Runde Bodenplatte. Fügen Sie nach 10-15 min 100 µL gewünscht Antikörper Cocktail zu jeder Probe hinzu. Inkubieren Sie Proben für 30-45 min auf Eis, vor Licht geschützt werden.
Hinweis: Fc-Block ist ein Reagenz verwendet, um zu verhindern, dass die Bindung von den Fc-Teil der Antikörper gegen Zellen, die mit dem Ausdruck Fc-Rezeptoren. Es soll unspezifische Antikörperbindung zu minimieren. Bestimmung der Antikörper zu verwenden, wird die Hypothese getestet im Experiment abhängig gemacht werden und sollte mit Input aus der Literatur ausgewählt werden. In Abbildung 3um die Infiltration insgesamt Immunzelle zu messen Antikörpers Anti-CD45 arbeitete die ist ein Pan-Immune Zelle Protein. - Waschen Sie Proben durch Zentrifugation für 7 min bei 200 X g, 4 ° C. Aufschwemmen Sie Zelle Pellets in 200 µL Flow Cytometry Puffer und eine 5 ml Polystyrol Röhre kurz vor dem Erwerb auf einem Durchflusszytometer weitergeben Sie Proben durch ein 40 µm Zelle Sieb.
- Sammeln Sie die gesamte Probe auf das Durchflusszytometer. Eine gute Verdauung ergibt 200.000-400.000 Zellen mit 8.000-10.000 CD45+ Immunzellen aus naiven Maus Blase, während infizierte Organen mehr enthält Zellen16 (Abbildung 3).
Hinweis: Beispiele für durchflusszytometrischen Analyse vorbereitet können nicht zum KBE bewerten. Es empfiehlt sich die Blase in zwei Teile aufgeteilt, da keine Beweise vorliegen, um das UPEC Besiedlung nachweisen oder Immunzelle Infiltration einheitlich das Gewebe ist nicht.
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Representative Results
Bei der Entwicklung dieses Protokolls Kohorten von weiblichen und männlichen C57Bl/6 Mäusen im Alter 6 bis 8 Wochen eingeflößt und bakterielle Belastung im Harnblasen zu Zeitpunkten von 1 Stunde bis 30 Tagen ausgewertet wurden. Die Ergebnisse aus diesen Studien sind an anderer Stelle detailliert (Zychlinsky Scharff Et Al., anhängig). Hier präsentieren wir Ihnen repräsentative Daten von 24-Stunden-Infektionen. Vor allem entsprach die bakterielle Belastung zwischen männlichen und weiblichen Mäusen in 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 1). Kleine Variation in bakterielle Belastung beobachtet innerhalb jeder Gruppe 24 Stunden nach der Infektion, ähnlich was in weiblichen Mäusen15,16berichtet worden ist.
Wenn genügend leere Blase Urin vor der Infektion geachtet wird, ist selten nennenswerten Leckagen des Inokulums bei weiblichen Mäusen beobachtet. Instillation in männlichen Mäusen führte jedoch erhebliche Mengen an bakterielle Inokulum Austritt aus der Harnröhre, besonders während der Entwicklungsphase dieses Protokolls. Um festzustellen, ob der Verlust des Inokulums zum Zeitpunkt der Infektion Kolonisierung oder die Einrichtung einer Infektion betroffen, haben wir ein Bewertungssystem für jede Instillation beschäftigt. Jeder Instillation erzielte er auf einer Skala von 1 bis 5, wobei 1 die optimalste und bakterielle Besiedlung war entschlossen 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2, Box). Während dieses System Ermittler angewiesen war, und daher potentiell subjektiv, Hauptautor der Studie bestimmt alle Ergebnisse unmittelbar nach Instillation vor Auswertung der bakteriellen Belastung in infizierten Harnblasen. Keine statistisch signifikanten Unterschiede existierte unter die KBE von Tieren mit verschiedenen Instillation Partituren, gewonnen durch eine nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test vergleicht den mittleren Rang jeder Spalte im mittleren Rang eines jeden anderen Spalte (p = 0,17) und für multiple Vergleiche mit einem Dunn Test korrigieren. Aus dieser Analyse kann gefolgert werden, dass suboptimale arbeiten (Partitur > 3), was zu erheblichen Austreten von bakterielle Inokulum während der Infektion, bakterielle Besiedlung um 24 h (Abbildung 2, Grafik) nicht wesentlich. Vor allem mit Erfahrung, die Häufigkeit von undichten bei männlichen Mäusen deutlich vermindert.
Schließlich war das Ziel bei der Entwicklung dieses Modells, die Immunantwort auf UPEC bei weiblichen und männlichen Tieren direkt zu vergleichen. Zu prüfen, ob zwischen den Geschlechtern als Reaktion auf UTI, die Anzahl der CD45 zelluläre Infiltration geändert wird+ Immunzellen im naiven und infizierten Kohorten von weiblichen und männlichen Mäusen wurden vom Durchflusszytometrie bewertet. Während die Zahl der Immunzellen in naiven Tieren nicht anders zwischen weiblichen und männlichen Mäusen war (p = 0,95), gab es ein statistisch signifikanter Anstieg der Infiltration in die Blase der infizierten weiblichen Mäusen (p = 0,0015) (Abbildung 3A-B).
Abbildung 1: UPEC kolonisiert weibliche und männliche Blase mit gleicher Effizienz. 6 bis 8 Wochen alten weiblichen und männlichen C57Bl/6 Mäusen mit 10 eingeflößt wurden7 KBE UPEC. 24 Stunden nach der Infektion, Blase aseptisch wurden entfernt, um die bakterielle Belastung aufzuzählen. Plot zeigt KBE/Blase. Jeder Punkt ist eine Maus, repräsentative Experiment 5 gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Die Qualität der Instillation korreliert nicht mit bakterielle Belastung im 24-Stunden nach der Infektion. 6 bis 8 Wochen alten weiblichen und männlichen C57Bl/6 Mäusen mit 10 eingeflößt wurden7 KBE UPEC. Unmittelbar nach jeder Instillation zugewiesen ein einzelnen Forschers einen Qualitätsfaktor der Instillation nach bestimmten Kriterien (Box Text) definiert. 24 Stunden nach der Infektion, Blase aseptisch wurden entfernt, um die bakterielle Belastung aufzuzählen. Plot zeigt die zugewiesene Qualität Partitur versus KBE/Blase. Jeder Punkt ist eine Maus, 5 gepoolten Experimente gezeigt. p = 0,17, Kruskal-Wallis-Test vergleicht den mittleren Rang jeder Spalte im mittleren Rang eines jeden anderen Spalte mit post-hoc-Dunn Test für multiple Vergleiche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Immun Zelle Infiltration steigt bei weiblichen Mäusen als Reaktion auf UTI. 6 bis 8 Wochen alte weibliche und männliche C57Bl/6 Mäusen eingeflößt wurden oder nicht mit 107 KBE UPEC. Repräsentativen Punkt plottet zeigen insgesamt Blase Zellen mit CD45+ Immunzellen gated in Pink von naiv oder infizierte Mäuse. Diagramm zeigt die absolute Anzahl von CD45+ Immunzellen im Harnblasen von naiv oder 24 hr infizierte Mäuse. Jeder Punkt ist eine Maus, 2 gepoolten Experimente gezeigt. p-Werte von Mann-Whitney-Test bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Transurethrale Instillation von männlichen Mäusen bietet viele neue Recherchemöglichkeiten in der Einfluss des Geschlechts auf Blase Schleimhaut Krankheit, aber auch einige Herausforderungen. Eine Einschränkung ist, dass der Instillation zunächst technisch schwierig erweisen, was zu übermäßiger Entzündungen beim Einführen des Katheters an erster Stelle. Verbesserung der Technik kann durch die Instillation von Toten Mäusen mit einer farbigen Lösung, wie Evans blauen Farbstoff erreicht werden. Bestätigen Sie, dass der Instillation erfolgreich ist, Harnblasen visuell kontrolliert werden sollte und das Volumen der Flüssigkeit eingeflößt durch Extraktion mit einer Tuberkulin-Spritze ausgewertet werden kann. Die Bedeutung von langsamen, sanften Bewegungen kann nicht genug betont werden: Es darf kein Widerstand und keine Kraft verwendet, um den Katheter, da das überschüssige Entzündungen und Gewebeschäden führen wird. Wenn richtig durchgeführt, wird der Katheter in der Harnröhre mühelos gleiten. Wenn Widerstand oder Hindernis empfunden wird, empfiehlt es sich, den Katheter entfernen und erneut einstecken.
Durch Korrelation von der Qualität der Instillation, bakterielle Belastung 24 Stunden nach der Infektion, wir gezeigt, dass eine unvollkommene Technik, in der eine kleine Menge des bakteriellen Inokulums verloren zum Zeitpunkt der Infektion ist, noch robuster Besiedlung der führt die Blase. Bei der Nutzung dieses Protokolls, soll ein Ermittler leckagefreie arbeiten zu erreichen. Die Robustheit des Verfahrens stellt jedoch sicher, dass unvollständige Installationen noch nützliche Daten und interpretierbaren Ergebnisse liefern.
Der große Vorteil unserer Technik über die einzige veröffentlichte alternative Methode der männlichen Blasenentzündung ist der nicht-invasive, nicht-chirurgische Ansatz. Unser Ansatz mit transurethrale Instillation folgt der physiologischen Route durch die Harnröhre in die Blase, ohne Unterbrechung die strukturelle Integrität des Bauches. Die invasive Technik, beschrieben von Olson und Kollegen20, umfasst Faktoren, chirurgische Eingriffe, einschließlich Entzündung, verzögerte Heilung, und daraus resultierende Narbengewebe. Besonders relevant in Bezug auf Studien der Immunantwort auf eine Infektion reagiert der Organismus auf chirurgische Trauma. Dazu gehören die Bildung von Pro-inflammatorischen Milieu sowie potenzielle Gewebe Granulation und eine entzündungshemmende Wunde heilende Programm als Teil des Heilungsprozesses. Diese Faktoren stellen unerwünschte Einflüsse innerhalb der experimentellen Einstellung.
Schließlich war das Ziel dieser Studie, eine Methode zu entwickeln, die männlichen und weiblichen Immunreaktionen im direkten Vergleich im Laufe des UTI, wodurch auf zukünftige Studien den Einfluss des Geschlechts auf Blase Schleimhaut Krankheiten, wie Infektionen angewendet werden können und der Krebsbiologie. Als ein zweiter Vorteil beschriebenen der Methode hier Spiegel, die bei weiblichen Mäusen für Jahrzehnte19verwendet. Experimente bei männlichen Mäusen mit dieser Technik sind also vergleichbar mit einem Großraumflugzeug der bestehenden Forschung. Unsere Experimente haben gezeigt, dass Unterschiede in der Reaktion vorhanden sind und, dass diese Unterschiede möglicherweise Hinweise auf geschlechtsspezifische Unterschiede in der Reaktion auf Schleimhaut Infektionen sowie andere Krankheiten der Blase zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Matthieu Rousseau für kritische Lektüre des Manuskripts und das Labor von dendritischen Immunbiologie für ihre hilfreiche Erkenntnisse bei der Entwicklung dieses Protokoll und Projekt. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch Mittel aus der siebten Rahmen Programm Marie-Curie-Maßnahmen der Europäischen Union (PCIG11-GA-2012-3221170 und die Immuno-Onkologie LabEx (MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
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