Udskudt Vækst inhiberingsassay at kvantificere virkningen af ​​Bakterier-afledte antimikrobielle stoffer på Konkurrence

Protocol

Den følgende fremgangsmåde tilpasses ^7,8 teste konkurrerende stammer med inhibitor-producerende stammer.

BEMÆRK: Denne protokol indebærer aerosol generation med bakteriekulturer. Dette kan kun udføres i et indesluttet rum med implementering af lokalt godkendte sikkerhedshensyn. Sprøjtning af kulturen på agarpladerne inden for en niveau 2 sikkerhedsskab vil minimere kontaminering af agarpladerne og det omgivende miljø. Dette vil også beskytte forsker fra aerosol indånding af de sprøjtede bakterier, dette er et stort problem, hvis forskeren bruger indeslutningsniveau 2 organismer. Egnede personlige værnemidler skal bæres. Området omkring petriskålen er bedst dækket med absorberende væv. Post-spray dekontaminering med UV-lys tilrådes.

1. Forberedelse agarpladerne

1. Forbered Brain Heart Infusion (BHI) agar i overensstemmelse med den manutens anvisninger.
2. Autoklaver BHI agar ved 121 ° C, 15 psi i 20 min, eller ifølge autoklave producentens anbefalinger, for at sterilisere.
3. Hæld 15 ml portioner af steriliseret BHI agar i sterile petriskåle og lad det sætte.
   BEMÆRK: Sørg hver agarplade, der skal anvendes inden assayet stammer fra den samme bestand af agar og at der er den samme mængde agar i hver plade. Dette begrænser variationen i tilgængelige næringsstoffer og hæmmer diffusion mellem plader tillader sammenlignelighed.

2. Forberedelse Sterile Broth

1. Forbered BHI-bouillon i overensstemmelse med producentens anvisninger.
2. Der tilsættes 10 ml portioner af BHI til 28 ml glas universelle flasker.
3. Autoklaver BHI-bouillon ved 121 ° C, 15 psi i 20 min, eller ifølge autoklave producentens anbefalinger, for at sterilisere.
   BEMÆRK: Sørg for alle bouillon bruges i analysen stammer fra samme parti bouillon autoclaved samtidig at begrænse variation på næringsstoffer, som kan forårsage variation i resultaterne.

3. Forberedelse Sterile vaporizer Bottle (r)

1. Afmonter vapourizer flasken.
2. Spray 5% overfladeaktivt rengøringsmiddel gennem vapourizer at fjerne interne forureninger, suge vapourizer flasken, låg og vapourizer i 5% overfladeaktive rengøringsmiddel natten over.
   BEMÆRK: Handsker og egnede personlige værnemidler bør anvendes ved håndtering af overfladeaktive rengøringsmiddel.
3. Tør vaporizer, låg og flasker under sterile luftstrøm hætte.
4. Fyld flasken med 70% ethanol, vedhæfte vapourizer og sprøjte nogle af ethanol gennem vapourizer.
5. Læg låg på fordamperen og opbevares sammen med ethanolen inde indtil brug.
6. Umiddelbart før anvendelse, aseptisk skylle flasken med steril BHI-bouillon og spray bouillon gennem vapourizer.
   BEMÆRK: Dette forhindrer ethanol affecting podestoffet tilsat til flasken i afsnit 6.3.

4. Forberedelse af Bakteriel Overnight Kultur (r)

1. Streak konkurrenten og hæmmer stammer på en steril BHI agarplade og inkuberes ved 37 ° C aerobt i ca. 18 timer (natten over).
   BEMÆRK: Denne plade danner en bestand af bakterier, der kan anvendes til flere gentagelser inden for samme uge ved opbevaring ved 4 ° C.
2. Inokulere 10 ml steril BHI-bouillon med en enkelt koloni af den krævede konkurrent bakteriestamme i en 28 ml universel flaske.
3. Inkubér den universelle flaske ved 37 ° C aerobt natten over ved omrystning ved 250 rpm i en orbitalryster.

5. Spot Culture af Inhibitor-producerende Isoler

1. Forbered overnight kultur (er), som beskrevet i afsnit 4.
2. Sikre agarplader er helt tørre, uden kondens på låget, før inokulering (fx ved at inkubere plate i 60 minutter ved 37 ° C); dette forhindrer inokulum i at sprede sig på tværs af pladen fra podningsstedet.
3. Pipetter 25 pi overnatskulturen på midten af ​​agarpladerne. Undgå helt at trykke pipette stemplet for at forhindre luftbobler, sprøjte kultur på tværs af agar.
4. Tillad kulturen at tørre ved stuetemperatur for at begrænse spredningen af ​​kulturen. Inkubér agarpladerne ved 37 ° C aerobt natten over.

6. Forberedelse af Spray Inoculum af Test Konkurrent Strain (r)

1. Forbered overnight kultur som beskrevet i afsnit 4. Fortynd overnatskultur 10 gange i BHI bouillon til at give ca. 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1, og en suspension af OD ₆₀₀ 0,3 ± 0,05.
   BEMÆRK: En 10 ganges fortynding vil ikke give 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 for alle bakteriearter, beregne den nødvendige fortyndingsfaktor ved spredning plating serielle fortyndinger på mellem 1 x 10 -6.
2. Hæld den fortyndede kultur i en steril plastik parfume vaporizer flaske.
   BEMÆRK: Det samlede rumfang skal være mere end nødvendigt for antallet af agarplader, der sprøjtes. Ca. 250 pi per plade er velegnet til en diameter på 9 cm petriskål.

7. Udskudt Vækst inhiberingsassay

1. Spray kulturen gennem hver af vaporizer flasker til at sikre, at kulturen er lagt i spray mekanisme før sprøjtning på agaren.
2. Fra en afstand af ca. 15 cm over agar, spray ca. 250 pi fortyndet kultur (3 sprøjt af en typisk 50 ml vaporizer) over hele agaroverfladen. Inkubér agarpladerne ved 37 ° C aerobt natten over. Gentag for andre plader med samme antal sprays.

8. Tolkning udskudte Growth Inhibition assayresultater

1. Mål vækstinhibering zone af den sprøjtede konkurrencetor stamme (figur 1A - C, "X" til "X") i mm, subtrahere diameteren af den centrale sted af inhibitoren-producent (figur 1A - C, "Y" til "Y").
   BEMÆRK: Figur 1E viser, hvordan disse data kan præsenteres
2. Optag klarhed score for hæmningszoner.
   BEMÆRK: Dette angiver graden af ​​inhibering observeret. Eksempler er vist i figur 1A - D, stammer, som kan anvendes til standardisering er foreslået i afsnittet repræsentative resultater. Følgende skala kan anvendes til klarheden scoring: en klarhed score på 0 for at beskrive en zone af fuldstændig inhibering af konkurrentens stamme vækst. En score på 1 for at beskrive en zone med næsten fuldstændig inhibering af vækst, med kun individuelle kolonier til stede i den zone af clearing. En score på 2 for at beskrive en synlig zone med reduceret vækst, vækst inden for denne zone er conflydende eller i nærheden sammenflydende, men reduceret i tæthed med> 50%. En score på 3 til at beskrive kun minimal reduktion vækst, vækst er sammenflydende og reduceret med mindre end 50%, en zone er stadig synlige og målbare. En score på 4 for at beskrive nogen synlig hæmning af væksten. En score på 5 til at beskrive, at væksten af ​​konkurrenten stammen blev forøget i nærheden af ​​den test inhibitor-producerende stamme. Se figur 1 for eksempler. Disse scoringer er subjektive til forsøgslederen.

9. Gentagelser

1. Gentag analyser mindst i biologisk tre eksemplarer til at bestemme reproducerbarheden af ​​de opnåede resultater.
   BEMÆRK: Hvis gentagelser udføres på forskellige dage, tage målinger og score plader umiddelbart efter fjernelse fra inkubation derefter enten gemme plader ved 4 ° C eller tage kvalitet fotografier af plader højt inden kassering dem. Opbevaring eller fotografier af plader gør det nemt at sammenligne resultater mellem forskellige dage, thans er især vigtigt for bekræftelse reproducerbar scoring tværs dage / eksperimenter. Vær opmærksom på at opbevaring af pladerne har potentialet til at ændre resultaterne.
   BEMÆRK: For klare billeder sted plader oprejst uden deres låg på en mat sort baggrund i et område med diffust lys, bruge en høj opløsning kamera (≥8 MP) i stand til at fokusere på objekter tæt på objektivet (makro-tilstand). Alternativt kan nogle gel kameraer med trans-illuminator sat til hvidt lys producere høj kvalitet, meget reproducerbare billeder.

Representative Results

Analyseresultaterne bør kunne ses som en forskel i overlejret konkurrent stammen nær centralt plettede inhibitor-producerende stamme (figur 1). Disse forskelle kan tolkes som fuld hæmning (figur 1A), partiel hæmning (figur 1B og 1C), ingen hæmning (Figur 1D) eller positiv association. Den bredt tilgængelige laboratorium stammer S. epidermidis Tü3298 og S. epidermidis Rp62A, og S. epidermidis Rp62A og S. aureus Newman anvendtes i fig 1B og 1D hhv. Vi foreslår, at disse stammer kunne anvendes til at teste denne protokol.

Afhængig af testede arter, fuld hæmning og delvis hæmning er mest sandsynligt et resultat af antimikrobielle peptider, antibiotika eller andre diffusible vækst inhibitors produceret af inhibitoren-producerende stamme. Delvis inhibering er også blevet forbundet med nedsat tilgængelighed af næringsstoffer for konkurrenten pres, fordi optagelse eller sekvestrering af næringsstoffer efter inhibitoren stamme ^6.

Sammenligning af størrelsen af ​​zonen for inhibering mellem forskellige inhibitor-producerende isolater testet over samme konkurrent stamme indikerer forskelle i et af følgende: mængden af ​​antimikrobielt produceret af inhibitoren-producerende stamme; evnen af ​​inhibitoren til at diffundere gennem medierne; typen af ​​inhibitor produceret og belastningsgraden af ​​konkurrenten stamme til inhibitorerne, der fremstilles. Sammenligning af størrelsen af ​​zonen for inhibering mellem forskellige testes efter samme inhibitor-producerende stamme konkurrerende stammer er indikativ for modstand niveauer af konkurrerende stammer til den inhibitor, der produceres.

Hvis inkonsekvent anvendelse af bakterier er opstået bør ikke anvendes pladerne. For eksempel, hvis testen konkurrent kultur er for fortyndet hæmningszonen vises større og med en mindre klart defineret kant, end der typisk observeres (figur 2A); dette vil påvirke pålideligheden af ​​sammenlignende målinger zone. Hvis inhibitoren-producerende stamme stedet ikke var fuldt tørret før inkubering natten over, inhibitoren stammen sandsynligvis vil sprede og ikke danner en klart defineret plet (figur 2B), som typisk påvirker målinger zone, men kan også påvirke klarheden scoring. Hvis konkurrenten stammen erikke sprøjtes jævnt dette kan føre til en ulige fordeling af bakterier (Figur 2C). Hvis deltageren stamme også er koncentreret, er det muligt at konkurrenten stamme kan vokse på toppen af inhibitoren stamme (figur 2C), i ekstreme tilfælde kan føre til en vis inversion af konkurrent / inhibitor-stamme roller.

Figur 1:. Rækken af kvalitative og kvantitative resultater, der kan opnås fra det udskudte væksthæmning assay Resultater for væksthæmning kan variere fra (A) komplet hæmning (score på 0), (B) delvis hæmning (score på 1) , (C) delvis inhibering (score 2) til (D) ingen inhibering (score på 4). Etiketten angive kanterne af vækst af inhibitoren stammer (Y) og den yderste kant af inhiberingenzoner (X). Størrelsen af hæmningszonen intervallet fra 0 mm til over 10 mm, som vist i (E), som viser målinger til pladerne fotograferet i A, B, C og D. Resultater vist for seneste staphylococ isolater (A , C) eller fælles lab stafylokokker isolerer S. epidermidis Tü3298 (inhibitor) og S. epidermidis Rp62A (konkurrent) (B), og S. epidermidis Rp62A (inhibitor) og S. aureus Newman (konkurrent) (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksempler på inkonsistente resultater på grund af dårlig teknik Resultater kan se anderledes ud end forventet, hvis (A. (B) hæmmer stammen var ikke helt tør, før inkubation / plader var ikke tør eller (C), hvis konkurrenten stammen ikke blev sprøjtet jævnt og blev også koncentreret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Et kritisk trin i denne bakteriel konkurrence arter protokol, som adskiller den fra andre, er det natten over inkubation af inhibitoren isolere før tilsætning af konkurrent isolat. Inhibitoren stamme kræver denne vækst periode at frembringe inhibitoriske forbindelser. Som konkurrenten stamme overlejres oven på det samme medium, denne fremgangsmåde tillader forskeren at iagttage det fulde potentiale af inhibitoren stamme til at interferere med væksten af ​​konkurrenten stamme. Som et resultat, dette assay afspejler, hvad der sker med naturen; ét isolat er fuldt etableret i en niche, og den anden skal være i stand til at modvirke eventuelle inhibitoriske variabler til at kunne slå invadere niche.

Der er to dele i denne protokol, der er mest tilbøjelige til at forårsage fejlagtige resultater, hvis udført forkert. For det første kan ufuldstændig sterilisering af fordamperen flasker indføre forurenende bakterier i assayet. INCUbation af bouillonen bruges til skylning af vaporizer flaske i trin 3.6 i en steril beholder kan anvendes til at bekræfte flasker blev fuldstændigt steriliseret. Yderligere vask i desinficerende opløsninger, såsom Virkon, kan anvendes forud for vask i overfladeaktivt rensemiddel, der er beskrevet i trin 3.2, hvis yderligere sterilisation er nødvendig.

Et andet trin, der kan forårsage fejlagtige resultater er fortyndingen af ​​konkurrent-stammen (trin 6.1). Hvis fortyndingen ikke er optimal, klare målinger af inhibering kan ikke let bestemmes. Dette assay blev optimeret under anvendelse af forskellige nasale isolater som inhibitor-producerende stammer tværs af en bred vifte af Gram-positive og Gram-negative arter versus S. aureus SH1000 som konkurrent stammen ^7,8. Det er efterfølgende blevet testet ved hjælp af forskellige koagulase-negative og koagulase-positive stafylokokker som konkurrent og inhibitor-producerende stammer. Når andre end de ovenfor beskrevne som konkurrent slægterstamme, kan en vis optimering af fortyndingen for inokulum være nødvendig.

Hvis klarhed scoringer varierer betydeligt mellem gentagelser, kan det være nødvendigt at standardisere konkurrenten stammen inokulum ved at sætte den til en bestemt optisk tæthed. Dette vil dog øge den tid, analysen tager at sætte op, og det er sandsynligt at reducere antallet af stammer er det muligt at behandle per eksperiment. Visuelt tilpasning kulturen til en passende OD under anvendelse af en McFarland standard kan tilvejebringe en hurtig alternativ.

En begrænsning ved denne teknik er, at det kun kan anvendes på dyrkbare bakterier. Derfor er mange undersøgelser bruger 16S rRNA sekventering til at forudsige konkurrencedygtige udelukkelse interaktioner ^3,4,13. Dog kan genetiske og metagenomisk teknikker kun skelne medlemmer community til artsniveau, og / eller tager ikke højde for særlige intraspecifikke træk variation. Det er muligt at screene for associering af en particular gen, som koder for en egenskab med tilstedeværelsen eller fraværet af en bakterieart ^5, men dette kræver forudgående kendskab til et gens sandsynligvis være forbundet med udelukkelse af en art.

En sikkerhed overvejelse af denne teknik er, at på grund af aerosoldannelse af bakterier, kan det kun anvendes i laboratorier med en niveau 2 sikkerhedsskab eller med lignende sikkerhedsforanstaltninger. Der er alternative teknikker til at teste for konkurrence mellem isolater, der tegner sig for intraspecifikke træk variation og ikke genererer aerosoler af bakterier. En sådan metode er den samtidige antagonisme Assay ^2. Ved denne fremgangsmåde er et inokulum på ét isolat udspredt på en agarplade, og en anden isolat inokulum er plettet eller stukket ned oven, når den første er tørret. Dette ville producere et miljø, hvor de stammer er i direkte konkurrence (samtidig antagonisme), både konkurrerer om at producere hæmmende forbindelser og scavenge næringsstoffer først. Den advantage af den udskudte væksthæmning assay over samtidige antagonisme analysen er, at inhibitoren isolat altid skal have den konkurrencemæssige fordel af at blive etableret helt, før invasionen af ​​konkurrenten isolat. Dette er mere reflekterende af hvad der ville ske i miljøet, som i de fleste nicher vil ét isolat blive etableret før der tilsættes anden stamme, snarere end to isolater bliver tilføjet på samme tid ^8.

Et andet alternativ for at undgå aerosoldannelse af bakterier ville være at tilføje konkurrenten isolere i topagar, der kunne hældes i stedet sprøjtes over inhibitoren isolat. volumenet af topagar tilsættes, ville imidlertid nødt til at være ca. 3 ml at sikre jævn dækning af pladen. Inden for denne volumen, ville konkurrenten isolat ikke vokser på samme medier som inhibitor isolatet, så ville ikke lider reducerede næringsstoffer. Konkurrenten ville heller ikke være i direkte kontakt med eventuelle hæmmende forbindelser until de diffunderet ind i topagar. En sådan analyse kunne ikke betegnes som udskudt hæmning eller samtidig antagonisme.

En lignende fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at vurdere niveauerne af bacitracin resistens blandt klinisk S. aureus isolater ^10. Den væsentligste forskel mellem den her beskrevne protokol og der er beskrevet med ^10, er sidstnævnte kun klassificerede konkurrerende stammer som følsomme (komplet inhibition- klarhed score 0) eller resistente (delvise til ingen inhibition- klarhed score 1-5). Den udskudte væksthæmning assay kan derfor også anvendes til at screene for niveauer af resistens til producenter af bestemte antibiotika, eller endda at søge efter nye antimikrobielle stoffer er aktive mod multiresistente patogener.

Det er blevet foreslået, at værten mikroflora kunne manipuleres til at eliminere uønskede medlemmer af den bakterielle samfund ^9. Anvendelse af corynebakterier eller Staphylococcus epidermidis har allerede vist sig at eliminere S. aureus kolonisering i næsebor i en betydelig del af befolkningen ^11,12. Undersøgelser specifikke stammer som kompetitivt kan udelukke uønskede medlemmer af værten flora gennem teknikker som den her beskrevne, kan derfor føre til fremtidige lægemidler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent