Protocol
Aşağıdaki yöntem önleyicisi üreten suşlar ile rakip suşları test etmek için 7,8 uyarlanmıştır.
NOT: Bu protokol, bakteri kültürleri ile aerosol nesil içerir. Bu, sadece lokal onaylı güvenlik konuları uygulanması ile kapalı bir alanda gerçekleştirilebilir. Bir seviye 2 güvenlik kabini içinde agar plakaları üzerine kültür Püskürtme agar plakaları kirlenmesini ve çevresini en aza indirecektir. Bu aynı zamanda püskürtülen bakterilerin aerosol inhalasyon gelen araştırmacı koruyacak, bu araştırmacı çevreleme seviyesi 2 organizmaların kullanıldığı takdirde önemli bir husustur. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. petri çevresi en atılabilir emici dokusu ile kaplıdır. UV ışığı kullanarak post-sprey dekontaminasyon tavsiye edilir.
1. Agar Plakaları hazırlanması
- manu uygun olarak beyin kalp infüzyon (BHI) agar hazırlayınfacturer talimatları.
- sterilize etmek için, 121 ° C, otoklav, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak 15 ila 20 dakika boyunca psi, ya da BHI agar otoklava.
- Steril petri kutularının içine sterilize BHI agar 15 ml hacimde dökün ve ayarlamanızı sağlar.
Not: Deney agar aynı stok kaynaklı olan her agar kullanılmak üzere olun ve her plaktaki agar aynı miktarda olduğu. Bu mevcut besin ve karşılaştırılabilirlik sağlayan plakalar arasındaki inhibitör difüzyon değişkenliği sınırlar.
2. Steril Broth hazırlanması
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, BHI suyu hazırlayın.
- 28 ml'lik bir cam şişe genel BHI 10 ml alikotları ekleyin.
- sterilize etmek için, 15 psi, 20 dakika, ya da otoklav üreticinin tavsiyelerine göre 121 ° C'de BHI suyu otoklav.
NOT: suyu aut aynı partiden kaynaklanan deneyde kullanılan tüm suyu sağlayınsonuçlar varyasyonu neden olabilir besin varyasyonu sınırlamak için, aynı zamanda oclaved.
3. Hazırlanması Steril Vaporizer Şişe (ler)
- vapourizer şişe sökün.
- Iç yabancı maddelerin temizlenmesi gece boyunca% 5 bir yüzey aktif temizleme ajanı vapourizer şişe kapağı ve vapourizer emmek için vapourizer ile% 5 yüzey aktif temizlik maddesi püskürtün.
NOT: Yüzey aktif temizlik maddesi tutarken eldiven ve uygun kişisel koruyucu donanımlar kullanılmalıdır. - steril hava akış kaputun altında buharlaştırıcı, kapak ve şişe kurutun.
- % 70 etanol ile şişeye doldurun, vapourizer yeniden takın ve vapourizer yoluyla etanol bazı sprey.
- buharlaştırıcı kapağı koymak ve kullanıma kadar iç etanol ile saklayın.
- aseptik olarak Steril BHI et suyu ile durulayın ve şişe vapourizer yoluyla suyu püskürtmek için hemen önce.
NOT: Bu etanol aff önlerbölüm 6.3 şişeye ilave inokulum ecting.
Bakteriyel Gece Kültür hazırlanması 4. (ler)
- Şerit yarışmacı ve suşlar önleyicisi steril BHI agar plakası üzerine yerleştirin ve yaklaşık 18 saat (bir gece) aerobik olarak 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Bu plaka, 4 ° C'de depolandığında aynı hafta içinde birden çok kopya için kullanılabilen bakteri stok üretir. - 28 mi, evrensel şişe içinde gerekli rakip bakteri suşunun tek bir koloni ile steril BHI et suyu 10 ml inoküle.
- orbital çalkalayıcı 250 rpm'de çalkalanarak aerobik olarak gece boyunca 37 ° C de genel şişe inkübe edin.
Önleyici üreten İzolatı 5. Nokta Kültürü
- 4. bölümde tarif edildiği gibi, gece boyunca kültürün (ler) hazırlayın.
- Agar plakaları kapağındaki yoğunlaşma olmadan, tamamen kuru olduğundan emin olun, aşılamadan önce (pla kuluçka örneğin37 ° C'de 60 dakika) için TE; Bu aşılama sitesinden plaka üzerinde yayılmasını inokulum engeller.
- Pipet agar plakaları merkezi üzerine gece boyunca bir kültürü 25 ul. tamamen agar boyunca kültür sprey hava kabarcıklarını önlemek için pipet Medyumu kaçının.
- kültür yayılmasını sınırlamak için kültür oda sıcaklığında kurumaya bırakın. aerobik bir gece boyunca 37 ° C 'de agar inkübe edin.
6. Hazırlama Testi Rakip Strain Sprey Aşı (lar)
- Yaklaşık 4 x 10 6 CFU ml -1 vermek üzere BHI suyu bölüm 4. SEYRELTİK gecede kültür 10 kat açıklandığı gibi gecede kültür hazırlayın ve OD 600 0.3 ± 0.05 süspansiyonu.
NOT: 10 kat seyreltme, 4 x 10 6 CFU ml -1 tüm bakteri türlerinin vermek 1 x 10 arasında seri dilüsyonları kaplama yayılması gerekli seyreltme faktörünü hesaplamak olmaz - steril plastik parfüm buharlaştırıcı şişeye seyreltilmiş kültür dökün.
NOT: toplam hacim agar plakaları sayısı püskürtülen için gerekli olandan daha fazla olmalıdır. Yaklaşık plaka başına 250 ul 9 cm çaplı bir petri çanağı için uygundur.
7. Ertelenmiş büyüme inhibisyonu analizi
- Kültür önceden agar üzerine püskürtme için püskürtme mekanizması yerleştirildiğinden emin olmak için buharlaştırma şişelerin her birinden kültür püskürtülür.
- agar üzerinde yaklaşık 15 cm'lik bir mesafeden, tüm agar yüzeyi üzerine seyreltilmiş kültür yaklaşık 250 ul (tipik 50 mi buharlaştırıcı 3 spreyler) püskürtülür. aerobik bir gece boyunca 37 ° C 'de agar inkübe edin. spreyler aynı sayıda diğer plakaları için tekrarlayın.
8. Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Sonuçları Yorumlama
- püskürtülen alanda ülkemizde büyüme inhibisyon zonu ölçüntor suşu (Şekil 1A - C, "X", "X" için) (- C, "Y" ile "Y" Şekil 1A) inhibitörü yapımcısı merkez nokta çapı çıkarılarak milimetre.
NOT: Şekil 1E bu veriler sunulabilir nasıl gösterir - inhibisyon bölgeleri için netlik puan kaydedin.
Not: Bu görülen inhibisyon derecesi gösterir. Örnekler Şekil 1A gösterilmiştir - D, standardizasyon için kullanılabilir suşları temsilcisi sonuçları bölümünde önerilmektedir. Aşağıdaki ölçek, berraklığı puanlama için kullanılabilir: 0 bir berraklığı mı rakip suşun büyüme önlemesine bir bölge tanımlamak için. 1 puan temizleme bölümü içinde mevcut olan, sadece tek tek koloniler ile büyüme hemen hemen tam inhibisyon bölgesini tanımlamak için. 2 puan azaltılmış bir büyüme görülebilir bölge tanımlamak için, bu bölge içinde büyüme conakıcı veya yapışık yakın ama>% 50 oranında yoğunluk azalır. 3 puan çok az büyüme azaltma açıklamak için, büyüme birleşen ve daha az% 50 oranında azaltılır, bir bölge hala görünür ve ölçülebilir. 4 puan, büyüme görünür bir inhibisyon ortaya koymaktır. 5 puan ise rakip suşunun büyüme testi önleyicisi üreten soyun yakın artış olduğunu ortaya koymaktır. Örnekler için Şekil 1'e bakınız. Bu puanlar deneyci için subjektiftir.
9. çoğaltır
- Biyolojik en az üç kez tekrar deneyler elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini belirlenmesi.
NOT: çoğaltır farklı günlerde yapılması durumunda, ölçüm yapmak ve 4 ° C'de, daha sonra inkübasyon çıkarıldıktan hemen sonra ya mağaza plakaları plakaları puan veya onları atmadan önce plakaların yüksek kaliteli fotoğraflar çekmek. Depolama veya plakaların fotoğrafları farklı günlerde arasındaki sonuçların kolay karşılaştırma sağlar, tonun gün / deneyler arasında tekrarlanabilir puanlama teyit için özellikle önemlidir. plakaların depolama sonuçlarını değiştirme potansiyeline sahip olduğunu unutmayın.
NOT: net fotoğraflar yer plakaları için dik dağınık ışık bir alanda mat siyah arka plan üzerine kapaksız, yakın objektif (makro modu) nesneler üzerinde odaklama yeteneğine sahip yüksek çözünürlüklü bir kamera (≥8 MP) kullanın. Alternatif olarak, beyaz ışığa ayarlanır trans-ışığı ile bazı jel görüntüleme cihazları, yüksek kalite, yüksek tekrarlanabilir görüntüler üretebilir.
Representative Results
Deney sonuçları, merkezi benekli önleyicisi üreten bir suş (Şekil 1) yakınındaki Kaplanmış rakip suşu bir fark olarak gözlemlenebilir olmalıdır. Bu farklılıklar, tam inhibisyon (Şekil 1A), kısmi inhibisyonu (Şekil 1B ve 1C), herhangi bir inhibisyonu (Şekil 1D) veya pozitif bir birlik olarak yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılan laboratuvar S. suşları epidermidis Tü3298 ve S. epidermidis Rp62A, ve S. epidermidis Rp62A ve S. aureus Newman sırasıyla Şekil 1b ve 1d kullanılmıştır. Biz bu suşlar bu protokolü test etmek için kullanılır olabileceğini düşündürmektedir.
Test edilen türler bağlı olarak, tam inhibisyon ve kısmi inhibisyon muhtemelen antimikrobiyal peptitler, antibiyotiklere veya diğer yayılabilir bir büyüme inhibitör sonucudurinhibitör üreten bir suş tarafından üretilen rs. Kısmi inhibisyon da inhibitör suşu 6 ile rakip alımı nedeniyle gerginlik ya da besin ayrımı için azaltılmış besin durumu ile bağlantılı olmuştur.
Aynı rakip suşuna karşı test edilen farklı inhibitör üreten suşlar arasında inhibisyon zonunun boyutu karşılaştırılması aşağıdakilerden herhangi farklılıkları gösterir: inhibitörü üreten bir suş tarafından üretilen antimikrobiyal miktarı; ortam içinden difüze inhibitörün özelliği; inhibitör tip üretilen ve inhibitörleri ile rakip suşu direnç seviyesi üretilmektedir. Aynı önleyicisi üreten suşuna karşı test edilen farklı rakip suşları arasında inhibisyon bölgesinin boyutu karşılaştırması önleyicisi üretilen için rakip karşı direnç seviyelerinin göstergesidir.
Bakterilerin eksik uygulanması oluştu plakları kullanılmamalıdır. Örneğin test rakip kültürden ise inhibisyon bölgesinin daha büyük görünür ve tipik olarak (Şekil 2A) görülmektedir daha az belirgin bir kenar olacak seyreltilmiş; Bu herhangi bir karşılaştırmalı bölge ölçümlerinin güvenilirliğini etkileyecektir. Inhibitör üreten suş nokta tam bir gecede inkübasyon önce kuru değil ise, inhibitör zorlanma yaymak ve tipik bölge ölçümleri etkiler ama aynı zamanda netlik puanlama etkileyebilir açıkça tanımlanmış nokta (Şekil 2B), oluşturmayacak muhtemeldir. rakip suşu iseeşit biçimde, bu bakterilerin düzgün olmayan bir yayılma (Şekil 2C) yol açabilir püskürtülür. Rakip suşu çok konsantre olursa bu rakip suşu inhibitörü suşu (Şekil 2C) üstünde büyümeye olasıdır, aşırı durumlarda bu yarışmacı / inhibitör gerilme rolleri bazı ters yol açabilir.
Şekil 1:. Büyüme inhibisyonuna ertelenmiş büyüme inhibisyonu analizi elde edilebilir niteliksel ve niceliksel sonuçların aralığı Sonuçlar (A) 'tam inhibisyon aralığında olabilir (0 puan), (B), kısmi inhibisyonu (1 puan) (D) hiçbir inhibisyon (4 puan) ile (C) kısmi engelleme (2 puan). Etiketler (Y) inhibitörü soylarının büyüme kenarları ve inhibisyon en dış kenarı gösterirbölgeleri (X). A fotoğraflandı levhalar için ölçümlerini göstermektedir, (E) 'de gösterildiği gibi 0 mm ilâ 10 mm'den fazla inhibisyon aralığında alanın boyutu, A, B, C ve D Sonuçlar Son stafilokok izolatı (A ile gösterilmiştir C) ya da ortak laboratuar stafilokok S. izolatlarının epidermidis Tü3298 (önleyici) ve S. epidermidis Rp62A (rakip) (B), ve S. epidermidis Rp62A (önleyici) ve S. aureus Newman (rakip) (D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: zayıf tekniğine tutarsız sonuçlar örnekleri Sonuçları eğer beklenenden farklı görünebilir (A. (B) inhibitörü suşu inkübasyon / plakaları önce tamamen kuru değildi kuru veya (C) değildi. büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
Discussion
Diğerlerinden ayıran, bu bakteri türleri rekabet protokolünün kritik bir safha, inhibitörün bir gece boyunca inkübasyon rakip izolatı eklenmesinden önce izole olduğu. Önleyicisi soyu önleyici bileşikleri üretmek için bu büyüme dönemi gerektirir. rakip suşu aynı ortamda üstüne bindirilmiş gibi, bu yöntem tam potansiyelini gözlemlemek için araştırmacı izin verir önleyicisi soyunun rakip suşunun büyüme müdahale etmek. Bunun bir sonucu olarak, bu deney, doğa ile ne yansıtmaktadır; bir izole tamamen niş yılında kurulmuş, ve diğer başarılı niş işgal edebilmek için herhangi bir inhibitör değişkenleri karşı gerekir.
Yanlış yapıldığı takdirde hatalı sonuçlara neden büyük olasılıkla bu protokol iki bölümü vardır. Birincisi, buharlaştırıcı şişe eksik sterilizasyon tahlil içine bakteri kirlenmesine neden tanıtabilirsiniz. incusteril bir kap içinde aşama 3.6 buharlaştırıcı şişe yıkamak için kullanılan broth Bation tamamen sterilize edildi şişe teyit etmek için kullanılabilir. Ek sterilizasyon gerekli ise, örneğin, Virkon® dezenfekte edici çözeltiler Ek yıkama, aşama 3.2'de tanımlanan yüzey etkili temizleme maddesinin yıkama, önce kullanılabilir.
hatalı sonuçlara neden olabilir ikinci aşama rakip suşu (adım 6.1) seyreltme olduğunu. Seyreltme uygun değilse, inhibisyon net ölçümler kolayca tespit edilemez. Bu deney, önleyici üreten S. karşı Gram-pozitif ve Gram-negatif türler geniş bir yelpazesinde suşları gibi çeşitli nazal izolatları kullanılarak optimize edildi rakip suşu 7,8 olarak aureus SH1000. Bu daha sonra rakip ve inhibitörü üreten suşlar gibi çeşitli-koagülaz negatif ve koagulaz pozitif stafilokok kullanılarak test edilmiştir. rakip olarak yukarıda tarif edilenler dışındaki cins test ederkensuşu, inokulum için seyreltme bazı optimizasyon gerekli olabilir.
berraklık puanları tekrarlar arasında anlamlı farklılık varsa, belirli bir optik yoğunluk olarak ayarlayarak rakip gerilme inokulum standardize etmek gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu deney ayarlamak için gereken ve deney için işlem mümkündür suşları sayısının azaltılması olası zaman artar. Görme hızlı bir alternatif sağlayabilir bir McFarland standardı kullanılarak uygun bir OD kültürünü ayarlayarak.
Bu tekniğin bir sınırlama sadece kültürlenebilir bakterilerin uygulanabilir bunun olmasıdır. Birçok çalışmada rekabet dışlama etkileşimleri 3,4,13 tahmin 16S rRNA sıralamasını kullanmak nedeni budur. Ancak, genetik ve metagenomic teknikler sadece tür düzeyinde topluluk üyelerini ayırt edebilir ve / veya belirli bir tür içi özellik varyasyonu için hesaba katmıyor. Bir özelde, dernek taranması mümkünBir bakteri türlerinin 5 varlığında ya da yokluğunda bir özelliği kodlamaktadır ar geni, ancak bu tür hariç ile bağlantılı olması muhtemel bir genin ön bilgi gerektirir.
Bu tekniğin bir güvenlik dikkate bakterilerin aerosol üretimi nedeniyle, sadece bir seviye 2 güvenlik kabini ile laboratuarlarda kullanılan ya da benzer güvenlik önlemleri ile olabilir olmasıdır. intraspecific özellik değişimi için hesap ve bakteri aerosollerin üretemeyen izolatlar arasındaki rekabet test etmek için alternatif teknikler vardır. Böyle bir yöntem, aynı anda antagonizma deney 2 'dir. Bu yöntemde, bir izolatın, bir aşı, bir agar plakası üzerine yayılır, ve birinci kuruduktan sonra, ikinci bir izole aşı En lekeli veya yaralanmıştır. Bu, hem inhibitör bileşikler üretirler ve ilk besin temizlemek için yarışan, suşlar doğrudan rekabet (eşzamanlı antagonizma) olarak bir ortam üretecektir. advantageşzamanlı antagonizma tahlil üzerinden ertelenmiş büyüme inhibisyonu testinin e inhibitörü izolatı her zaman tam rakip izolatı işgalinden önce kurulmakta olan rekabet avantajına sahip olmasıdır. Başka bir suş yerine iki izolat aynı anda 8 ilave olmaktan çok, ilave edilmeden önce, bir izolatın kurulacak çoğu niş olarak bu, çevrede ne olacağını daha yansıtıcı olduğunu.
Başka bir alternatif döktü ziyade önleyici izolatı üzerinde püskürtülür olabilir üst agar izole rakibi eklemek olacaktır bakterilerin aerosol oluşumunu engellemek için. Bununla birlikte, üst agar eklenmiş hacmi plaka da kapsama sağlamak için yaklaşık olarak 3 ml olması gerekir. Bu hacim içinde, rakip izolat inhibitörü izolatı aynı ortam üzerinde büyüyen olmaz, bu yüzden azalmış besin muzdarip olmaz. Yarışmacı, aynı zamanda UNT bir önleyici bileşikler ile doğrudan temas halinde olmazil onlar üst agar içine yayılmış. Böyle bir deney, ertelenmiş inhibisyonu veya aynı anda antagonizmi olarak tarif edilememiştir.
Benzer bir yöntem, daha önce klinik S. arasında basitrasin direnci düzeylerini değerlendirmek için kullanılmıştır aureus 10 ayırır. 10 tarif burada tarif edilen protokol ve arasındaki temel fark, duyarlı (0 puan inhibisyon netlik tamamlamak) ya da dirençli ikinci sadece gizli rakip suşları (hiçbir inhibisyon netlik kısmi skor 1-5). Ertelenmiş bir büyüme önleme deneyi Bu yüzden, aynı zamanda, çok ilaca dirençli patojenlere karşı aktif yeni antimikrobiyal aramak için daha özel bir antimikrobiyal, veya üretici direnç seviyeleri taranması için kullanılabilir.
Ev sahibi mikroflora bakteriyel eden 9 istenmeyen temsilcilerinin ortadan kaldırmak için manipüle edilebilir olduğu ileri sürülmüştür. Corynebacterium türü ya Staph Uygulamaylococcus epidermidis önce S. ortadan kaldırmak için gösterilmiştir Nüfusun 11,12 önemli bir oranda burun içinde aureus kolonizasyonu. rekabetçi, burada anlatılan gibi teknikler vasıtasıyla ev sahibi bitki istenmeyen temsilcilerinin, dahil belirli suşlarından içine çalışmalar bu nedenle gelecekteki terapötik yol olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
JCM Unilever Plc (BB / L023040 / 1) ile BBSRC-IPA ödülü tarafından finanse edilmektedir. YY Yükseköğretim Doktora öğrencilik bir Suudi Arabistan Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Plastic perfume vaporizer | not known | - | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
References
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
