Summary
Nous décrivons un haut-débit, multiplex, et le liquide céphalorachidien protéomique ciblée (CSF) test développé avec le potentiel pour la traduction clinique. Le test peut quantifier des marqueurs potentiels et les facteurs de risque pour la neurodégénérescence, telles que les variantes de l'apolipoprotéine E (E2, E3 et E4), et mesurer leur expression allélique.
Abstract
De nombreuses maladies neurodégénératives manquent encore de traitements efficaces. biomarqueurs fiables pour identifier et classer ces maladies seront importantes dans le développement de nouvelles thérapies futures. Souvent, de nouveaux biomarqueurs potentiels ne font pas dans la clinique en raison des limites de leur développement et des coûts élevés. Cependant, la protéomique ciblées en utilisant la réaction Multiple Surveillance chromatographie liquide-tandem / spectrométrie de masse (MRM LC-MS / MS), en utilisant spécifiquement triple spectromètres de masse quadripolaires, est une méthode qui peut être utilisée pour évaluer rapidement et valider des biomarqueurs pour la traduction clinique dans les laboratoires de diagnostic . Traditionnellement, cette plate-forme a été largement utilisée pour la mesure de petites molécules dans les laboratoires cliniques, mais il est le potentiel d'analyser les protéines, qui en fait une alternative intéressante à la technique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) méthodes basées. Nous décrivons ici comment protéomique ciblée peut être utilisée pour mesurer les marqueurs multiplexés de démence, y compris la détection et la quantification du facteur de risque connu apolipoprotéine E isoforme 4 (ApoE4).
Afin de rendre le dosage approprié pour la traduction, il est conçu pour être rapide, simple, hautement spécifique et rentable. Pour ce faire, chaque étape dans le développement de l'essai doit être optimisé pour les protéines et les tissus individuels, ils sont analysés dans. Cette méthode décrit un flux de travail typique, y compris divers trucs et astuces pour le développement d'une cible protéomique MRM LC-MS / MS pour la traduction .
Le développement de la méthode est optimisée en utilisant des versions personnalisées de synthèse de peptides tryptiques quantotypic, qui calibrent MS pour la détection, puis enrichi en CSF pour déterminer l'identification correcte du peptide endogène dans la séparation chromatographique avant l'analyse dans les MS. Pour y parvenir absolute quantification, versions standard interne isotopes stables marqué des peptides avec peu acides marqueurs de séquence d'acide et contenant un site de clivage de la trypsine, sont inclus dans l'essai.
Introduction
L'impact croissant des maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la démence Lewy corps et la maladie de Parkinson, devient un enjeu socio - économique dans de nombreux pays 1. Il existe un besoin de marqueurs supplémentaires qui peuvent être utilisés pour identifier et classer les patients dans les premiers stades de la maladie, et de surveiller tous les nouveaux traitements potentiels. L'objectif global de cette méthode est de créer un pipeline générique pour une manière simplifiée, économique et plus rapide de la validation de marqueurs de CSF potentiels de neurodégénérescence. La raison est d'utiliser la protéomique ciblées ou peptide MRM LC-MS / MS comme une méthode facilement amendable pour évaluer plusieurs biomarqueurs protéiques potentiels à partir d'expériences de découverte. Ceux-ci peuvent encore être multiplexes sur une séparation rapide chromatographique (<10 min) et évalués. Dans cet écran multiplex pour les biomarqueurs neurodégénératives, nous avons inclus la démence facteur de risque connu apolipoprotéine isoforme E4 (ApoE4) donc nous CAn déterminer simultanément son statut et son niveau d'expression, par ce qui élimine la nécessité pour les tests de génotypage séparés 2. LC MS / MS est couramment utilisé comme la méthode de choix pour quantifier avec précision de petites molécules sur d'autres méthodes telles que ELISA ou dosage radio-immunologique (RIA). Ce changement dans l'utilisation de la technologie MS aux protéines d'analyse, a été tirée principalement par des problèmes avec les technologies immunodéprimés. Ceux-ci comprennent spécificité croisée, le lot à la variation de lot, durée de vie limitée, et le coût élevé. Par conséquent, la protéomique ciblées est en train de devenir une alternative de plus en plus à des méthodes d'anticorps à base tels que Western blot, RIA et ELISA. Cependant, la capacité de multiplexer plusieurs marqueurs dans une analyse est le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur immuno-3. La technique est applicable à de nombreux tissus et a été utilisé en tant que stratégie de validation de nombreuses études protéomiques , y compris le plasma et l' urine 4 5,6.
Le technique peut être appliqué à tout laboratoire qui a accès et de l'expertise dans l'utilisation de spectromètres de masse triple quadripôle. design Peptide est relativement simple avec l'utilisation croissante de bases de données open source. Le marché concurrentiel de la synthèse sur mesure des peptides rend beaucoup plus abordable. peptides lourds, cependant, sont chers et donc les marqueurs doivent être évalués sur une petite cohorte avant de passer à une plus grande échelle. Il existe un potentiel de croissance pour la technique à utiliser dans les paramètres cliniques de diagnostic, avec la plupart des grands hôpitaux ayant des plates-formes triples quadripôles à base qui peuvent être facilement adaptés pour exécuter des analyses protéomiques ciblées. Une telle application de la méthode, ce qui en fait dans le cadre de diagnostic de routine, est son application récente au dépistage de tache de sang nouveau - né pour l' anémie falciforme 7.
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Protocol
NOTE:. Un schéma du protocole global décrit ici est donnée dans le Fi gurer 1 Tous les échantillons utilisés pour le développement de cette méthode sont des échantillons cliniques de diagnostic excédentaires et avoir l' approbation éthique du comité de Londres Bloomsbury éthique.
Figure 1. Schéma illustrant le processus global de création d' un CSF ciblées MRM LC-MS / MS. Assay peptides marqueurs du candidat pour l' évaluation sont choisis parmi les protéines cibles. Grâce à l'utilisation de peptides synthétisés sur mesure, un procédé de multiplexage LC-MS / MS cible est créée. Après évaluation, le test peut être utilisé pour évaluer l'efficacité des marqueurs potentiels de la neurodégénérescence.
1. Peptide Sélection et Design
NOTE: Les critères pour un peptide marqueur est qu'il doit être unique (protéotypique (quantotypic). Pour déterminer si un peptide est unique ou non, le 'explosion' outil de recherche sur le site Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/) peut être utilisé.
- Définir une liste de protéines cibles (marqueurs), à savoir, ApoE (voir le tableau 2).
NOTE: Si le marqueur a été identifié à partir de précédentes expériences de profilage protéomique 8, puis sélectionnez le peptide qui donne la meilleure réponse de cet ensemble de données. - Si cette information est disponible, utiliser les sites Web open source, tels que in silico trypsine digestion des protéines cibles, en utilisant un outil logiciel comme MS-Digest.
- Choisissez le peptide qui est tryptique et non susceptible d'afficher des modifications traductionnelles.
NOTE: Cette information peut être vérifiée sur le site Uniprot www.uniprot.org. Évitez peptides sujettes à modification chimique pendant LC-MS préparation des échantillons. <li> Commander la synthèse personnalisée des peptides choisis.
NOTE: peptides marqueurs peuvent être synthétisés sur mesure par diverses sociétés commerciales. Pour le peptide ApoE quantotypic utilisé pour mesurer les niveaux d'ApoE totaux a été déterminée à AATVGSLAGQPLQER. Les séquences de peptides protéotypiques utilisées pour déterminer les variantes E2 et E4 sont les peptides tryptiques de la position 158 (RLAVYQAGAR et CLAVYQAGAR) et la position 112 (LGADMEDVCGR et LGADMEDVR), respectivement.
2. Préparation des Peptides standard
Remarque: Afin de sélectionner les meilleures transitions quantitative, la détection de la matrice rachidien (LCR) doit être optimisée. La façon la plus efficace d'optimisation de peptides multiplexés est de créer des pools de peptides à des concentrations connues. Ces piscines peuvent ensuite être utilisés pour le développement de la méthode et des courbes standards.
- Resuspendre peptides synthétiques (détails peptidiques sont donnés dans le tableau 2) à 1 mg / stock mlconcentration selon les instructions du fabricant. Par défaut, si les instructions ne sont pas disponibles, les peptides resuspendre dans 50:50 (v / v) acétonitrile (ACN) / H 2 O.
- Préparer les dilutions 1:10 du peptide à partir de la concentration en stock et piscine 1000 pmol de chaque peptide dans un tube de microcentrifugeuse de liaison faible. Sécher dans un concentrateur Speed-vac la piscine finale et conserver à -20 ° C. Préparer plusieurs piscines pour une utilisation future.
- Aliquoter 100 pi de CSF dans des tubes de liaison faible. Lyophiliser la CSF.
- Resuspendre une aliquote de mise en commun de 1000 pmol peptides dans un tampon de digestion (HCl 100 mM Tris, pH 7,8, 6 M d'urée, 2 M Thiourea, 2% ASB14) pour obtenir des concentrations de 10 et 1 pmol / ul.
- De Spike les peptides regroupés dans les 100 aliquotes lyophilisées de CSF à 0, 1, 2, 5, 10 et 15 concentrations de particules. Ajouter 20 ng de protéine non apparentée comme la levure intacte énolase pour agir en tant que standard interne et de contrôle pour la digestion de l'efficacité trypsin.
- Compléter les aliquotes CSF avec tampon de digestion à un montant final de 20 pi. Vortex.
- Ajouter 1,5 pl de dithiothréitol (30 mg dans 1 ml de Tris HCl 100 mM, pH 7,8) et agiter à la température ambiante pendant 1 h.
- Ajouter 3 pi de iodoacétamide (35 mg dans 1 ml de Tris HCl 100 mM, pH 7,8) et agiter à la température ambiante pendant 45 minutes dans l'obscurité.
- Ajouter 165 ul de ddH 2 O.
- Ajouter 10 pl de 0,1 pg / pl de solution de trypsine modifiée de qualité séquençage remis en suspension dans 50 mM de tampon de bicarbonate d'ammonium, pH 7,8. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° CO / N et arrêter la digestion par la congélation des échantillons. Magasin digère à -20 ° C jusqu'au moment de l'analyse.
3. Optimisation de la sclérose en plaques Peptide de détection
- Copiez et collez la séquence du peptide à optimiser, dans un logiciel approprié, par exemple, Skyline 9. Cliquer sur la séquence peptidique pour obtenir les informationsdes ions de masse d'ions précurseurs et des produits attendus.
- Diluer les peptides de concentration en stock (voir section 2.1) suite à 1 ng / ml de concentration pour MS développement de méthodes.
- infuser directement les peptides dans le spectromètre de masse à débit optimisé (généralement 0,1 à 0,8 ml / min) et 0-5% d'énergie de collision.
- Acquérir le spectre MS afin d'identifier les ions précurseurs à charges multiples expérimentales 8. Choisissez l'ion précurseur (m / z) qui donne le plus d'intensité (ou une liaison double ions précurseurs triplement chargés sont conseillés).
- Réinjecter le peptide et appliquer une énergie de collision de fragmenter le peptide par induite par collision de dissociation (CID). Optimiser les énergies de cône et de collision pour obtenir le meilleur modèle de fragmentation (ions fragments seuls ou doublement chargés, et la masse de fragment ionique de préférence plus grand que l'ion parent, il est conseillé).
- Vérifiez que les transitions obtenues expérimentalement correspondent transitions générées in silico </ Em> (comme décrit à l'étape 3.1). Enregistrer la liste de transition dans le fichier de méthode MRM en utilisant au moins 2 transitions les plus intenses par ion précurseur. Inclure 2 transitions: 1 pour la quantification et 1 pour confirmation dans l'essai final.
NOTE: Certains fabricants MS ont une fonction (c. -à- Waters Intellistart) pour MRM automatisé ou l' optimisation d'analyse SRM. Si possible infuser des peptides avec des phases mobiles combinées à 50 - 70% d'ACN avec 0,1% FA.
4. Méthode LC-MRM Développement
NOTE: Analyser le mélange de peptides synthétiques par une chromatographie en phase liquide système (UPLC) couplé à spectromètre de masse triple quadripôle Ultra Performance. Vérifiez que la source est propre. Solvant A est ddH 2 0 avec 0,1% FA; Solvant B est ACN avec 0,1% FA.
- Utiliser le système LC-MS équipé d'une colonne garnie UPLC C-18 phase (1,6 um de diamètre, de 90 pores A, 2,1 mm x 50 mm de longueur) et fixée à une pré-colonne de la même phase. </ Li>
- Décongelez digests CSF sur la glace, centrifugeuse à 16.000 g pendant 10 min et de transfert de 60 ul dans 300 ul flacons d'insertion de verre et stocker le dossier à -20 o C.
- Injecter la plus forte concentration du point de la courbe standard en utilisant 10 min 1-40% gradient ACN linéaire (voir le tableau 1 pour les paramètres de gradient)
- Ouvrez le chromatogramme et la note le temps de rétention résultant et les deux principaux les plus intenses transitions (quantitatives) par peptide avec toutes les transitions créées à l'étape 3.
- Sur la base de cette information, mettre à jour une méthode de MRM 10 min (créé à l' étape 3.6) avec des canaux chronométrés pour mesurer des peptides (voir la figure 2 pour un exemple). Pour maintenir la sensibilité, gardez chaque canal avec des points par pic supérieur à 8 et le temps de séjour supérieur à 0,01 s pendant au moins une transition pour chaque peptide.
- Inclure «retards solvant» dans la méthode MRM: une au début jusqu'à 10 secondes avant la première élution de pic etl'autre à la fin du procédé, 20 secondes après le dernier pic d'élution. Pour ce faire, en sélectionnant «retards solvant» dans les événements de la méthode dans MS fichier de méthode.
- Exécutez la courbe standard grâce à la méthode de MRM chronométré et veiller à ce qu'il n'y a pas d'interférence avec des pics non spécifiques transitions (générés à l'étape 3.6) par la vérification de la linéarité.
- Déterminer si les peptides sont détectables en exécutant le contrôle groupé non dopés et le LCR de la maladie grâce à la méthode.
- Retirer les peptides qui sont inférieurs à la limite de détection du dosage.
Figure 2. Exemple de MS Méthode dynamique MRM. Timed canaux de transitions peptidiques peuvent être regroupées en fonction des temps de rétention établis. L'activation de MRM à incorporer de façon synchronisée avec les peptides marqueurs sélectionnés éluent de la colonne de chromatographie, qui minimise le nombre de transitions sur une période de temps et augmente la sensibilité de l'essai. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
5. Ajout de normes internes
NOTE: Comme décrit précédemment 10, les normes internes stables marqués d'un isotope peuvent être inclus dans l'essai. En raison de la charge de ces normes, il est conseillé de d'abord évaluer les peptides dans la matrice.
- Déterminer les peptides idéaux optimisés pour la détection dans le LCR: choisir les peptides qui sont les plus récurrents, avec la plus forte intensité et sans pics d'interférence.
- Conception des peptides correspondant à des étiquettes lourdes comprennent 13 C 15 N d'acides aminés qui augmentent la masse du peptide d'au moins 6 Da par rapport au peptide endogène. En outre, ajouter une balise de 4 - 6 acides aminés supplémentaires à l'extrémité N ou C-terminale de la pep lourdemarée pour contrôler la digestion tryptique.
- Diluer normes internes stables marqués d'un isotope dans un tampon de digestion (voir étape 2.4). Déterminer la quantité idéale de stable étalon interne marquée par un isotope qui sera enrichi dans le LCR par dopage dans différents niveaux en fonction des abundancies précédemment observées au cours du développement. But pour atteindre environ 1: 1 de la norme marquée par un isotope stable au peptide endogène.
NOTE: Les normes internes des isotopes stables marqué peuvent être synthétisés par diverses sociétés commerciales.
6. LC-MRM Dosage de CSF Des échantillons de patients
- De Spike optimisé quantité de normes marqués par des isotopes stables dans 100 pi de CSF et lyophiliser le mélange.
- Reprendre le CSF dans 20 pi de tampon de digestion et effectuer la digestion comme décrit aux points 2.7 - 2.10.
- Analyser les échantillons en utilisant la méthode LC-MRM développé à l'étape 4.
- Pour l'analyse quantitative, exécutez la pep normemarées à des concentrations de 0 à -15 pmol une courbe standard. Voir l'étape 2.5 pour la préparation de la courbe standard.
Analyse 7. Données
NOTE: quantitative des données est basée sur le rapport d'intensité des normes internes de pointe de référence (peptides lourds marqués). Des informations détaillées concernant / MRM analyse des données de SRM a déjà été décrite 10. données Ratio peuvent ensuite être utilisés dans une courbe standard pour déterminer les niveaux absolus ou les calculer à partir de la concentration ajoutée de peptide lourd marqué.
- Analyser les données LC-MRM en utilisant un logiciel standard de 10 fabricants les spectromètres de masse de. Vous pouvez également utiliser le logiciel Skyline pour analyser les données quantitatives MRM 10.
- Vérifiez la sensibilité de la course en vérifiant la réponse d'un étalon interne tel que le énolase de levure à pointes ou à une norme marquée par un isotope stable dans chaque série. Veiller à ce que le coefficient de variation (CV) ne dépasse pas25%.
- examiner manuellement l'annotation de données pour assurer l'exactitude. Analysez chaque peptide et le rapport à une norme marquée par un isotope stable interne appropriée, à savoir, utiliser la version stable marquée par un isotope du peptide si elle est disponible.
- Pour obtenir des valeurs absolues de pmol pour 100 ul de CSF, exécutez les données de rapport dans les courbes standard appropriées qui ont été exécutés en même temps.
- Calculer le coefficient de variation (CV). CV pour chaque peptide doit être inférieure à 25% et inférieur à 15% pour les peptides abondants élevés.
NOTE: pmol de valeur absolue pour 100 valeurs de CSF pi peut être utilisé dans l'analyse statistique aval subséquente.
8. apolipoprotéine E isoforme Status
Remarque: Pour déterminer l'état de l'ApoE isoforme, la présence des peptides correspondants peut être effectuée en déterminant la présence de chaque isoforme.
- Considérons le ApoE dans 100 pi de seuil de CSF de> 1000 signaux-à-bruit positif pour ce peptide. Voir la figure 5 pour les peptides requis / absent pour déterminer le statut des isoformes d'un patient. Déterminer l'expression allélique en calculant le% de chaque isoforme au total expression ApoE.
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Representative Results
En utilisant le procédé décrit ci - dessus, un dosage multiplex à haut débit 10 min constitué de 74 peptides à partir de 54 protéines a été mis au point, en tant que dosage de marqueurs des maladies neurodégénératives maladies et à corps de Lewy (LBD) d'Alzheimer 8. La figure 3 montre un chromatogramme de multiplexage publiée 8 précédemment des marqueurs peptidiques significatifs de l'analyse. Les peptides inclus dans l'essai et de leurs transitions quantitatives sont donnés dans le tableau 2. Les données générées par cette méthode donne des rapports normalisés à la norme stable correspondant marqué avec un isotope interne. Ces valeurs peuvent ensuite être mis à travers une courbe standard pour déterminer pmol / 100 concentrations ul CSF absolues. Ces valeurs peuvent ensuite être analysées statistiquement pour les changements dans les échantillons cliniques.
Comme décrit précédemment 8, la quantification des 74 peptides inclus dans cet essai de CSF ont révélé que 25 de ces marqueurs ont été modifiés de manière significative dans le LCR de patients atteints de démence. Afin d' illustrer l'efficacité de cet essai, les résultats de marqueurs précédemment décrits démentiels Pro-orexine et YKL chitinase 3-like protein (YKL-40) 11,12 sont donnés à la figure 4. Le dosage ApoE intégré identifie l'état isoforme d' ApoE / allele le patient aussi bien. Apo E4 est un facteur de risque connu pour la maladie d'Alzheimer, donc l'intégrer dans l'essai fournira des informations précieuses. La détection des isoformes d' ApoE est expliqué dans la Figure 5 et est basé sur la détection des peptides correspondant à des changements d'acides aminés pour les isoformes E2 (R158C) et E4 (C112R). La figure 5A montre le diagramme de pic attendu pour chaque combinaison de isoforme et la figure 5B montre le résultat d'un LCR testé avec le test sur des échantillons de patients.
Figure 3. Représentant couvrit MRM chromatogrammes. Réimpression de Heywood et al. 8 Biomarkers important pour les troubles neurodégénératifs Lewy démence à corps et la maladie 8 d'Alzheimer sont présentées sur un gradient de LC 10 min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Exemple de données. Réimpression de Heywood et al. 8 graphiques montrent comment le MRM méthode décrite LC-MS / MS peut fiable de quantifier et de distinguer des contrôles les marqueurs neurodégénératifs connus tels que YKL chitinase protéine 3-like (YKL-40) 11 , 12 et le Pr marqueur AD o-13 orexine. AD = maladie d'Alzheimer, LBD = Lewy démence à corps et la maladie de Parkinson = PD. Les données précédemment publiées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Illustration Comment le statut Apo E isoforme d'un patient peut être déterminée. A. Indique les peptides couvrant la 112 amino LGADMEDVCGR séquence d'acide pour le neutre (E3a) ou LGADMEDVR pour la présence de E4 et pour la position 158 pour détecter RLAVYQAGAR neutre (E3b) ou CLAVYQAGAR pour l'E2 isoforme. B. peptides de la séquence ApoE sont présentés dans le panneau de gauche. Les différentes combinaisons des peptides détectés dans le LCR peuvent indiquer l'état de isoforme ApoE.fichiers / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Temps | Débit (ml / min) | % UNE | % B | Courbe |
| Initiale | 0,8 | 97 | 3 | initiale |
| 0,2 | 0,8 | 97 | 3 | 6 |
| 0,8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7.01 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8.01 | 0,8 | 97 | 3 | 1 |
| dix | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Tableau 1. Paramètres du dégradé UPLC pour une méthode de 10 min. A = ddH 2 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA
Tableau 2. Peptides Inclus dans le CSF MRM LC MS / MS Assay. Montré sont tous les peptides inclus utilisés dans le procédé, qui sont décrites et publiées 8. Indiquer si le marqueur a été détecté de façon fiable dans 100 pi de CSF est indiqué. Transitions marquées en gras sont ceux utilisés pour les données quantitatives. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Comme avec tous les tests basés sur la SEP, les étapes critiques du procédé sont la détermination des quantités appropriées et précises des normes internes. Si la quantification absolue est utilisée, alors les quantités correctes de peptides enrichis dans la courbe standard sont également critiques.
Notre test ne nécessite pas la précipitation du CSF ou l'utilisation de tout type d'étapes de nettoyage vers le haut ou dessalage avant l'analyse de MS - il est un procédé de réaction tout à fait en un seul pot. En raison du faible volume de LCR et de sa complexité limitée (par rapport au plasma), il a été constaté que ces étapes peuvent être retirés du protocole final, ce qui simplifie le dosage et le rendre plus approprié pour la traduction en paramètre de diagnostic. Les inclusions d'une pré-colonne à la colonne analytique principal et des retards de solvant dans la méthode MS, semblent être suffisante pour maintenir la sensibilité au cours de la MS courir pour plus de 500 échantillons. Comme le test-UPLC runnitemps ng est courte, il est important d'identifier sans équivoque le bon pic dans le LCR digérer matrice.
Ceci ne peut être obtenu avec l'utilisation de peptides synthétisés à picot et une courbe standard. S'il y a une incertitude d'un peptide adapté au pic chromatographique correcte, alors il peut être utile pour exécuter l'exemple à travers de multiples transitions et vérifier le modèle de l'intensité des transitions avec les normes synthétiques. Toutes nos essais contiennent au moins 2 peptides transitions pour confirmer l'identité du peptide.
L'essai a été développé pour les marqueurs détectés dans jusqu'à 100 ul de la peste porcine classique. Pour d'autres marqueurs de la démence, un plus grand volume de LCR peut être nécessaire. Une autre limitation de l'essai est la question de la dynamique de l'expression protéique. Certains marqueurs abondants doivent être injectés dans le spectromètre de masse dans un des quantités plus faibles tandis que certains marqueurs de faible abondance ont besoin d'un plus gros volumes d'injection. Par conséquent, le sample peut avoir besoin d'être injecté deux fois.
La signification de cette technique est la possibilité de multiplexer et de la spécificité accrue des 3 niveaux d'identification par rapport aux anticorps (temps de rétention, le précurseur et le produit m / z). Du point de vue de la traduction clinique, le plus grand avantage est le économiser sur les anticorps coût potentiel, mais un investissement initial pour l'équipement de spectrométrie de masse et de personnel qualifié est nécessaire. Un autre atout est la vitesse à laquelle la méthode peut être traduit sur les systèmes à base triple quadripôle. Cela accélère de manière significative la capacité de traduire et valider un test par rapport à toutes les techniques à base immunodéprimés. Enfin, comme cette plate-forme et de l'expertise a été régulièrement utilisé pour mesurer de petites molécules cliniquement, de nombreux centres hospitaliers grands ont déjà cette infrastructure en place. Dans le domaine de la neurodégénérescence, il y a beaucoup d'attention et de besoin de nouveaux biomarqueurs dans le LCR et le sérum. Cette méthode permet fermtform pour un dosage à haut débit où des marqueurs futurs peuvent être ajoutés (et retirés) à évaluer pour l' efficacité, etc. Cette technique présente en outre l' application à d' autres tissus pour l' ApoE identification des isoformes, telles que le plasma qui a déjà été décrit 2 et même des taches de sang.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
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