Summary
Se describe un alto rendimiento, múltiplex, y el ensayo de líquido cefalorraquídeo proteómica dirigida (CSF) desarrollado con potencial para la traducción clínica. La prueba se puede cuantificar marcadores potenciales y factores de riesgo para la neurodegeneración, tales como las variantes de la apolipoproteína E (E2, E3 y E4), y medir su expresión alélica.
Abstract
Muchas enfermedades neurodegenerativas todavía se carece de tratamientos eficaces. biomarcadores fiables para la identificación y clasificación de estas enfermedades serán importantes en el desarrollo de futuras terapias novedosas. A menudo, los posibles nuevos biomarcadores no llegan a la clínica debido a las limitaciones en su desarrollo y altos costos. Sin embargo, la proteómica dirigidos utilizando monitorización de reacción múltiple Liquid Chromatography-tandem / espectrometría de masas (MRM LC-MS / MS), usando específicamente espectrómetros de masas de triple cuadrupolo, es un método que se puede utilizar para evaluar rápidamente y validar biomarcadores para la traducción clínica en los laboratorios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma se ha utilizado ampliamente para la medición de pequeñas moléculas en laboratorios clínicos, pero es el potencial para analizar las proteínas, que hace que sea una alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked ImmunosorEnsayo de doblado) a base de métodos. Se describe aquí cómo proteómica dirigida se puede utilizar para medir marcadores multiplexados de demencia, incluyendo la detección y cuantificación de lo conocido factor de riesgo apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).
Con el fin de hacer que el ensayo adecuado para la traducción, que está diseñado para ser rápida, simple, altamente específico y rentable. Para lograr esto, cada paso en el desarrollo del ensayo debe ser optimizado para las proteínas individuales y tejidos que se analizan. Este método describe un flujo de trabajo típico que incluye varios consejos y trucos para el desarrollo de una proteómica dirigida MRM LC-MS / MS para la traducción .
El desarrollo del método se optimiza el uso de versiones sintetizadas de encargo de péptidos trípticos quantotypic, que calibran la MS para la detección y luego se disparó en el LCR para determinar la correcta identificación del péptido endógeno en la separación cromatográfica previa al análisis en la MS. Para lograr absoluTe cuantificación, marcadas por isótopos estables versiones estándar interno de los péptidos con aminoácidos corta etiquetas de secuencias de ácido y que contiene un sitio de escisión de tripsina, están incluidos en el ensayo.
Introduction
El impacto creciente de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson, se está convirtiendo en un problema socioeconómico en muchos países 1. Hay una necesidad en biomarcadores adicionales que se pueden utilizar para identificar y clasificar los pacientes en las primeras etapas de la enfermedad, y para supervisar cualquier posible nuevos tratamientos. El objetivo general de este método es la creación de una tubería genérico de una manera ágil, económica y más rápida de validación de posibles marcadores en LCR de la neurodegeneración. La razón es el uso de la proteómica dirigidos o péptido MRM LC-MS / MS como un método fácilmente modificable para evaluar múltiples biomarcadores de proteínas potenciales de los experimentos de descubrimiento. Estos pueden ser multiplexados aún más en una separación rápida cromatográfica (<10 min) y se evaluó. Dentro de esta pantalla múltiplex de biomarcadores neurodegenerativas, hemos incluido la demencia conocido factor de riesgo de la apolipoproteína E4 isoforma (ApoE4), de modo que te pn determinar simultáneamente su estado y nivel de expresión, por que la eliminación de la necesidad de pruebas de genotipo 2 separadas. LC MS / MS se utiliza habitualmente como el método de elección para cuantificar con precisión las pequeñas moléculas a través de otros métodos tales como ELISA o radioinmunoensayo (RIA). Este cambio en el uso de la tecnología EM para el análisis de proteínas, ha sido impulsado principalmente por problemas con las tecnologías basadas en técnicas inmunológicas. Estos incluyen cruz-especificidad, variación entre lotes, la vida útil limitada, y alto costo. Por lo tanto, la proteómica dirigidos está convirtiendo rápidamente en una alternativa cada vez más a los métodos basados en anticuerpos, tales como transferencia Western, RIA y ELISA. Sin embargo, la capacidad de multiplexar muchos marcadores en un ensayo es la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos basados en inmuno 3. La técnica es aplicable a muchos tejidos y se ha utilizado como una estrategia de validación para los estudios de proteómica muchos incluyendo plasma 4 y la orina 5,6.
el technique se puede aplicar a cualquier laboratorio que tiene acceso y experiencia en el uso de espectrómetros de masas de triple cuadrupolo. el diseño de péptidos es relativamente simple, con el creciente uso de las bases de datos de código abierto. El mercado competitivo de la síntesis de péptidos personalizados los hace mucho más asequible. péptidos pesados, sin embargo, son caros y, por tanto, los marcadores deben ser evaluados en una pequeña cohorte antes de trasladarse a una escala mayor. Existe un creciente potencial de la técnica que se utiliza en la configuración de diagnóstico clínico, con la mayoría de los grandes hospitales que tienen plataformas basadas triple cuadrupolo que pueden ser fácilmente adaptados para ejecutar ensayos proteómicos dirigidos. Una de tales aplicaciones del método, por lo que es en el ajuste de diagnóstico de rutina, es su reciente aplicación a la detección de gotas de sangre de recién nacidos para la anemia de células falciformes 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA:. Un diagrama esquemático del protocolo general descrito aquí se da en la fi gura 1 Todas las muestras utilizadas para el desarrollo de este método son muestras de diagnóstico clínico excedentes y tienen la aprobación ética del Comité de Ética de Londres Bloomsbury.
Figura 1. Esquema que ilustra el proceso global de crear un CSF GRM dirigidas LC-MS / MS. Ensayo péptidos candidato marcador para la evaluación se seleccionan de dianas proteicas. Mediante el uso de los péptidos sintetizados de encargo, se crea un método multiplex LC-MS / MS de destino. Después de la evaluación, el ensayo se puede usar para evaluar la eficacia de los posibles marcadores de neurodegeneración.
1. Selección de péptidos y Diseño
NOTA: Criterios para un péptido marcador es que debe ser único (proteotípicos (quantotypic). Para determinar si un péptido es único o no, la herramienta de búsqueda 'explosión' en el sitio web Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/) se puede utilizar.
- Definir una lista de proteínas diana (marcadores), es decir, la ApoE (ver Tabla 2).
NOTA: Si el marcador ha sido identificado a partir de experimentos anteriores perfiles proteómicos 8, a continuación, seleccione el péptido que da la mejor respuesta por parte de ese conjunto de datos. - Si esta información no está disponible, utilizar los sitios web de código abierto, como in silico digestión con tripsina de las proteínas diana, utilizando una herramienta de software como MS-Digest.
- Elija el péptido tríptico que es y no es susceptible de modificación postraduccional.
NOTA: Esta información se puede consultar en la página web Uniprot www.uniprot.org. Evitar péptidos propensos a la modificación química durante la preparación de la muestra LC-MS. <li> Solicite la síntesis a medida de los péptidos elegidos.
NOTA: la etiqueta de plástico péptidos pueden ser sintetizados a medida por diversas empresas comerciales. Para el péptido ApoE quantotypic utilizado para medir los niveles totales de ApoE se determinó que era AATVGSLAGQPLQER. Las secuencias de péptidos proteotípicos utilizados para determinar las variantes de E2 y E4 son los péptidos trípticos para la posición 158 (RLAVYQAGAR y CLAVYQAGAR) y la posición 112 (LGADMEDVCGR y LGADMEDVR), respectivamente.
2. Preparación de péptidos estándar
NOTA: Con el fin de seleccionar los mejores transiciones cuantitativos, la detección de la matriz (LCR) necesita ser optimizado. La forma más eficiente de optimizar péptidos multiplexados es crear charcos de los péptidos a concentraciones conocidas. Estas piscinas se pueden utilizar para el desarrollo de métodos y las curvas de calibración.
- Resuspender péptidos sintéticos (detalles de péptidos se dan en la Tabla 2) a 1 mg / ml de stockconcentración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por defecto, si las instrucciones no están disponibles, los péptidos volver a suspender en 50:50 (v / v) de acetonitrilo (ACN) / H2O
- Preparar las diluciones 1:10 de péptido de la concentración de la piscina y 1,000 pmol de cada péptido en un tubo de microcentrífuga de unión de baja. Se seca en un concentrador Speed-Vac el grupo final y se almacena a -20 ° C. Preparar varias piscinas para su uso futuro.
- Alícuota de 100 l de LCR en bajas tubos de unión. Liofilizar la CSF.
- Resuspender una alícuota de 1.000 pmol agrupados péptidos en tampón de digestión (Tris HCl 100, pH 7,8, 6 M urea, 2 M tiourea, 2% ASB14) para obtener concentraciones de 10 y 1 pmol / l.
- Pico de los péptidos agrupados en los 100 ml de alícuotas liofilizadas de LCR en el momento 0, 1, 2, 5, 10 y 15 las concentraciones de PM. Añadir 20 ng de proteína no relacionada intacta tales como enolasa de levadura para actuar como un patrón interno y el control de la eficiencia de la digestión trypsin.
- Rellenar las alícuotas MEC con tampón para digerir una cantidad final de 20 l. Vórtice.
- Añadir 1,5 l de ditiotreitol (30 mg en 1 ml de 100 mM Tris HCl, pH 7,8) y agitar a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Añadir 3 l de yodoacetamida (35 mg en 1 ml de 100 mM Tris HCl, pH 7,8) y agitar a temperatura ambiente durante 45 min en la oscuridad.
- Añadir 165 l de ddH2O
- Añadir 10 l de 0,1 g / l solución de tripsina modificada de grado de secuenciación se resuspendieron en tampón de bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,8. Incubar en un baño de agua a 37 ° CO / N y detener la digestión mediante la congelación de muestras. Tienda digiere a -20 ° C hasta el momento de analizar.
3. Optimización de la detección MS de péptidos
- Copiar y pegar la secuencia del péptido para optimizar, en un software adecuado, por ejemplo, Skyline 9. Haga clic en la secuencia del péptido para obtener la informaciónde iones de masas de iones precursores y productos esperados.
- Diluir los péptidos de concentración de reserva (véase la sección 2.1) sobre la base de 1 ng / ml de concentración para el desarrollo de métodos de MS.
- Directamente infundir los péptidos en el espectrómetro de masas a un caudal optimizado (normalmente de 0,1 - 0,8 ml / min) y de 0 - 5% de la energía de colisión.
- Adquirir MS espectro con el fin de identificar a los iones precursores experimentales se multiplican cargadas 8. Elija el ión precursor (m / z) que da la mayor intensidad (por enlace doble o se les aconseja iones precursores cargados triplemente).
- Reinfundir el péptido y aplicar energía de colisión para fragmentar el péptido por colisión inducida por disociación (CID). Optimizar las energías de colisión de cono y para obtener el mejor patrón de fragmentación (fragmentos de iones con carga simple o doble, y la masa de ion fragmento preferiblemente más grande que de iones de los padres, se aconseja).
- Compruebe que las transiciones obtenidos experimentalmente se ajustan a las transiciones generadas in silico </ Em> (como se describe en el paso 3.1). Guardar la lista de transición en el archivo de método MRM utilizando por lo menos 2 transiciones más intensos por ión precursor. Incluye 2 transiciones: 1 para la cuantificación y el 1 de confirmación en el ensayo final.
NOTA: Algunos fabricantes EM tienen una función (es decir, Aguas Intellistart) para MRM automatizada o la optimización de análisis de SRM. Si es posible infundir péptidos con fases móviles combinados al 50 - 70% de ACN con 0,1% FA.
Desarrollo 4. Método LC-MRM
NOTA: Analizar la mezcla de péptidos sintéticos por un sistema de cromatografía de líquidos (UPLC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Rendimiento Ultra. Asegúrese de que la fuente está limpio. El disolvente A es ddH 2 0 con 0,1% FA; Disolvente B se ACN con 0,1% FA.
- Usar el sistema de LC-MS equipado con una columna UPLC lleno de C-18 de fase (1,6 m de diámetro, 90 poros A, 2,1 mm x 50 mm de longitud) y unido a una pre-columna de la misma fase. </ Li>
- De descongelación digiere CSF sobre hielo, se centrifuga a 16.000 g durante 10 min y la transferencia de 60 l en 300 l viales inserto de vidrio y guardar el resto de vuelta a -20 ° C
- Inyectar la concentración más alta de punto de la curva estándar utilizando 10 min 1 - 40% de gradiente de ACN lineal (véase la Tabla 1 para la configuración de gradiente)
- Abra el cromatograma y retención nota de tiempo resultante y la parte superior dos transiciones más intensos (cuantitativos) por péptido con todas las transiciones creadas en el paso 3.
- Basándose en esta información, actualizar un método MRM 10 min (creado en el paso 3.6) con canales temporizados para medir péptidos (véase la Figura 2 para un ejemplo). Para mantener la sensibilidad, mantener cada canal con puntos por pico mayor que 8 y tiempo de permanencia mayor que 0,01 seg para al menos una transición para cada péptido.
- Incluya 'solventes' retrasos en el método de MRM: uno al principio, hasta 10 segundos antes de la primera elución pico yotro al final del método, 20 seg después de la última elución pico. Para ello, selecciona "retrasos de disolvente" en los eventos del método de archivo de MS método.
- Ejecutar la curva estándar a través del método de MRM cronometrado y garantizar la ausencia de picos no específicos que interfieren en las transiciones (generadas en el paso 3.6) por la comprobación de la linealidad.
- Determinar si los péptidos son detectables mediante la ejecución de control no agrupada de pinchos y LCR enfermedad a través del método.
- Retirar los péptidos que están por debajo del límite de detección del ensayo.
Figura 2. Ejemplo de un método dinámico MS MRM. Temporizado canales de transiciones de péptidos pueden ser agrupados de acuerdo a los tiempos de retención establecidas. MRMs Habilitación para ser incorporado en una forma temporizada como los péptidos marcadores seleccionados eluyen de la columna de cromatografía, reduce al mínimo el número de transitions durante un período de tiempo y aumenta la sensibilidad del ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. La adición del Reglamento Interno
Nota: Como se ha descrito previamente 10, los patrones internos marcados con isótopos estables pueden ser incluidos en el ensayo. Debido al costo de estas normas, se recomienda evaluar primero los péptidos en la matriz.
- Determinar los péptidos ideales optimizados para la detección in CSF: elegir los péptidos que son los más recurrentes, con la intensidad más alta y sin picos de interferencia.
- Diseño péptidos correspondientes para incluir pesados etiquetas 13 C 15 N de aminoácidos que aumentan la masa del péptido de al menos 6 Da en relación con péptido endógeno. Además, agregar una etiqueta de 4 - 6 aminoácidos adicionales en cualquiera de los extremos N- o C-terminal de la pep pesadamarea para controlar por la digestión con tripsina.
- Diluir los estándares internos marcados con isótopos estables en tampón de digestión (véase el paso 2.4). Determinar la cantidad ideal de estándar interno marcado con un isótopo estable que se clavó en el LCR por clavar en varios niveles en función de las abundancias observadas previamente durante el desarrollo. Tratar de conseguir aproximadamente 1: 1 de la norma marcada con isótopos estables de péptido endógeno.
NOTA: Los estándares internos marcados con isótopos estables pueden ser sintetizados por diversas empresas comerciales.
6. LC-MRM de las muestras de LCR de pacientes
- Pico cantidad de estándares marcados con isótopos estables optimizado en 100 l de CSF y liofilizar la mezcla.
- Resuspender el LCR en 20 l de tampón de digestión y realizar la digestión como se describe en los puntos 2.7 - 2.10.
- Analizar las muestras utilizando el método LC-MRM desarrollado en el paso 4.
- Para el análisis cuantitativo, ejecute la pep normamareas en concentraciones de 0 -15 pmol en una curva estándar. Vea el paso 2.5 para la preparación de la curva estándar.
Análisis 7. Datos
NOTA: cuantitativo de datos se basa en la relación de intensidad de pico de los estándares internos de línea de base (péptidos marcados pesada). Información detallada sobre los análisis de datos / MRM SRM se ha descrito previamente 10. datos de relación de a continuación, se pueden utilizar en una curva estándar para determinar los niveles absolutos o calcularlas partir de la concentración añadida de péptido-pesado etiquetado.
- Analizar los datos de LC-GRM utilizando el software estándar de 10 los Espectrómetros de masa para los fabricantes. Como alternativa, utilice el software del horizonte para analizar los datos cuantitativos de GRM 10.
- Comprobar la sensibilidad de la carrera por el control de la respuesta de un patrón interno tal como la enolasa de levadura de púas o un estándar marcado con isótopo estable en cada ejecución. Asegúrese de que el coeficiente de variación (CV) no es mayor que25%.
- revisar manualmente la anotación de datos para asegurar la exactitud. Analizar cada péptido y la relación a un estándar interno marcado isotópicamente estable apropiado, es decir, utilizar la versión marcada con isótopo estable del péptido si está disponible.
- Para obtener valores absolutos de pmol por cada 100 l de CSF, ejecutar los datos de relación a través de las curvas de calibración apropiadas que se ejecutaron en el mismo tiempo.
- Calcular el coeficiente de variación (CV). CV para cada péptido debe ser inferior a 25% y por debajo de 15% para altas péptidos abundantes.
NOTA: El valor absoluto por 100 pmol valores de LCR l se puede utilizar en el análisis estadístico posterior aguas abajo.
8. La apolipoproteína E isoforma Estado
NOTA: Para determinar el estado de isoforma ApoE, la presencia de los péptidos correspondientes se puede realizar mediante la determinación de la presencia de cada isoforma.
- Considere la ApoE en 100 l de LCR umbral de> 1.000 señal-to-ruido como positivo para ese péptido. Vea la Figura 5 para los péptidos requeridos / ausente para determinar el estado isoforma de un paciente. Determinar la expresión alélica mediante el cálculo del% de cada isoforma a un total de expresión ApoE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando el método descrito anteriormente, se desarrolló un ensayo multiplex de alto rendimiento 10 min que consiste de 74 péptidos de 54 proteínas, como un ensayo para los marcadores de los trastornos neurodegenerativos de la enfermedad de Alzheimer y cuerpos de Lewy (LBD) 8. La Figura 3 muestra un cromatograma multiplex publicado previamente 8 de los marcadores de péptidos significativos del ensayo. Los péptidos incluidos en el ensayo y sus transiciones cuantitativos se dan en la Tabla 2. Los datos generados por este método da proporciones estandarizadas para el estándar interno marcado isotópicamente estable relevante. Estos valores pueden entonces ser sometidos a una curva estándar para determinar absolutos pmol / 100 concentraciones l de LCR. Estos valores pueden ser analizados estadísticamente para los cambios en muestras clínicas.
Como se ha descrito previamente 8, la cuantificación de los 74 peptides incluidos en este ensayo CSF revelaron que 25 de estos marcadores fueron alterados significativamente en el LCR de pacientes con demencia. Para ilustrar la eficacia de este ensayo, los resultados de los marcadores anteriormente descritos demencia Pro-orexina y YKL quitinasa 3-como proteínas (YKL-40) 11,12 se da en la Figura 4. El ensayo ApoE integrado identifica el estado ApoE isoforma / alelo de el paciente también. Apo E4 es un factor de riesgo conocido para la enfermedad de Alzheimer, por lo tanto, la integración de esta en el ensayo proporcionará información valiosa. La detección de las isoformas de ApoE se explica en la Figura 5 y se basa en la detección de los péptidos correspondientes para los cambios de aminoácidos de las isoformas de E2 (R158C) y E4 (C112R). La Figura 5A muestra el patrón de pico esperado para cada combinación isoforma y la Figura 5B muestra el resultado de un CSF probado con el ensayo en muestras de pacientes.
Figura 3. representativos superpuestos GRM cromatogramas. Reimpresión de Heywood et al. 8 Biomarcadores significativo para los trastornos neurodegenerativos cuerpos de Lewy y la enfermedad de Alzheimer 8 se muestran sobre un gradiente LC 10 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Ejemplo de datos. Reimpresión de Heywood et al. 8 gráficos muestran cómo el método / MS-MS LC MRM descrito se puede cuantificar de forma fiable y discriminar entre los marcadores controles neurodegenerativas conocidas como proteínas YKL quitinasa 3-como (YKL-40) 11 , 12 y el Pr marcador de AD o-orexina 13. AD = Enfermedad de Alzheimer, LBD = cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson PD =. Los datos publicados anteriormente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Ejemplo de cómo determinar el estado de Apo E isoforma de un paciente. A. Indica los péptidos que cubre el 112 amino LGADMEDVCGR secuencia de ácido para el neutro (E3a) o LGADMEDVR para la presencia de E4 y de la posición 158 para detectar RLAVYQAGAR el neutro (E3b) o CLAVYQAGAR para la isoforma E2. B. los péptidos de la secuencia de ApoE se muestran en el panel de la izquierda. Las diferentes combinaciones de los péptidos detectados en el CSF pueden indicar el estado isoforma ApoE.archivos / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Hora | Flujo (ml / min) | % UN | % B | Curva |
| Inicial | 0,8 | 97 | 3 | inicial |
| 0,2 | 0,8 | 97 | 3 | 6 |
| 0,8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7.01 | 0,8 | 0,1 | 99.9 | 6 |
| 8 | 0,8 | 0,1 | 99.9 | 6 |
| 8.01 | 0,8 | 97 | 3 | 1 |
| 10 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Tabla 1. Configuración UPLC degradado para un Método 10 min. A = ddH 2 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA
Tabla 2. Los péptidos incluidos en el MRM LC MS MS Ensayo CSF /. Se muestran todos los péptidos incluidos usaron en el método, que se describen y se publican 8. Indicación de si el marcador se detecta de forma fiable en 100 l de LCR se indica. Las transiciones marcadas en negrita son las que se usan para los datos cuantitativos. Por favor, haga clic aquí para descargar la tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Como con todos los ensayos basados en MS, los pasos críticos en el método son la determinación de las cantidades adecuadas y precisas de estándares internos. Si se utiliza la cuantificación absoluta, entonces las cantidades correctas de péptidos de púas en la curva estándar también son críticos.
Nuestro ensayo no requiere la precipitación del CSF o el uso de cualquier tipo de limpias pasos arriba o de desalado antes del análisis MS - se trata de un método de reacción en un solo recipiente por completo. Debido al pequeño volumen de CSF y su complejidad limitada (en comparación con el plasma), se ha encontrado que estos pasos pueden ser retirados de el protocolo final, simplificando de este modo el ensayo y lo que es más adecuado para la traducción al ajuste de diagnóstico. Las inclusiones de una pre-columna a la columna analítica principal y de los retrasos de disolvente en el método de MS, parecen ser suficientes para mantener la sensibilidad durante la MS una duración de más de 500 muestras. Como el ensayo de UPLC Running tiempo es corto, es importante identificar de manera inequívoca el pico correcto en el LCR digerir la matriz.
Esto sólo se puede lograr con el uso de péptidos sintetizados de punta y una curva estándar. Si hay una incertidumbre de un péptido adaptado al pico cromatográfico correcta, entonces puede ser útil para ejecutar el ejemplo a través de múltiples transiciones y comprobar el patrón de intensidad transiciones con los estándares sintéticos. Todos nuestros ensayos contienen al menos 2 péptidos transiciones para confirmar la identidad del péptido.
El ensayo ha sido desarrollado para marcadores detectados en un máximo de 100 l de LCR. Para algunos otros marcadores de la demencia, puede ser necesario un mayor volumen de CSF. Otra limitación del ensayo es la cuestión de la gama dinámica de la expresión de proteínas. Algunos marcadores abundantes necesitan ser inyectada en el espectrómetro de masas en unas cantidades más pequeñas, mientras que algunos marcadores abundantes bajas requieren un volumen de inyección de mayor tamaño. Por lo tanto la sample puede necesitar ser inyectado dos veces.
La importancia de esta técnica es la capacidad para multiplexar y el aumento de la especificidad de los 3 niveles de identificación sobre los anticuerpos (tiempo de retención, precursor y el producto m / z). Desde la perspectiva de la traducción clínica, la mayor ventaja es el potencial de ahorro de costes en anticuerpos, aunque se requiere un desembolso inicial para el equipo de espectrometría de masas y personal capacitado. Otra ventaja es la velocidad en la que el método puede ser traducido en los sistemas basados en triple cuadrupolo. Esto acelera de manera significativa la capacidad de traducir y validar un ensayo de comparación con todas las técnicas basadas en la inmuno. Por último, en esta plataforma y la experiencia ha sido utilizado habitualmente para medir pequeñas moléculas clínicamente, muchos grandes centros hospitalarios ya cuentan con esta infraestructura en su lugar. En el ámbito de la neurodegeneración hay una gran cantidad de enfoque y la necesidad de nuevos biomarcadores en el líquido cefalorraquídeo y suero. Este método proporciona un plaTForm para un ensayo de alto rendimiento, donde se pueden añadir marcadores futuras (y eliminados) que deben evaluarse para la eficacia, etc. Esta técnica tiene, además, la aplicación a otros tejidos para la identificación isoforma ApoE, tales como plasma que ha sido ya descritos 2 e incluso manchas de sangre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V.
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
