Summary
Vi beskriver en hög genomströmning, multiplex, och riktade proteomik cerebrospinalvätska (CSF) analys utvecklad med potential för klinisk översättning. Testet kan kvantifiera potentiella markörer och riskfaktorer för neurodegeneration, såsom apolipoprotein E varianterna (E2, E3 och E4), och mäta deras alleliska uttryck.
Abstract
Många neurodegenerativa sjukdomar fortfarande saknar effektiva behandlingar. Tillförlitliga biomarkörer för att identifiera och klassificera dessa sjukdomar kommer att vara viktiga i utvecklingen av framtidens nya terapier. Ofta potentiella nya biomarkörer inte gör det i kliniken på grund av begränsningar i deras utveckling och höga kostnader. Men riktade proteomik använder flera Reaction Monitoring vätskekromatografi-tandem / masspektrometri (MRM LC-MS / MS), särskilt med hjälp av trippelkvadrupol masspektrometrar, är en metod som kan användas för att snabbt bedöma och värdera biomarkörer för klinisk översättning till diagnostiklaboratorier . Traditionellt har denna plattform använts i stor omfattning för mätning av små molekyler i kliniska laboratorier, men det finns risk för att analysera proteiner, som gör den till ett attraktivt alternativ till ELISA (Enzyme-Linked Immunosorböjd Assay) -baserade metoder. Vi beskriver här hur riktade proteomik kan användas för att mäta multiplexerade markörer av demens, inklusive detektering och kvantifiering av känd riskfaktor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
För att göra analysen lämplig för översättning, är det avsett att vara en snabb, enkel, mycket specifika och kostnadseffektiv. För att uppnå detta måste varje steg i utvecklingen av analysen optimeras för de enskilda proteiner och vävnader de analyseras i. Denna metod beskriver en typisk arbetsflöde inklusive olika tips och tricks för att utveckla en riktad proteomik MRM LC-MS / MS för översättning .
Metodutveckling optimeras med hjälp av anpassade syntetiserade versioner av tryptiska quantotypic peptider, som kalibrera MS för detektering och sedan spetsade i CSF för att fastställa korrekt identifiering av den endogena peptiden i den kromatografiska separationen före analysen i MS. Att uppnå absolute kvantifiering, stabila isotopmärkta interna standardversioner av de peptider med korta aminosyrasekvenstaggar och innehållande en trypsin-klyvningsstället, ingår i analysen.
Introduction
Fördjupning av neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom, Lewy body demens och Parkinsons sjukdom, blir en samhällsekonomisk fråga i många länder 1. Det finns ett behov i ytterligare biomarkörer som kan användas för att identifiera och klassificera patienter i ett tidigt skede av sjukdomen, och att övervaka eventuella nya behandlingar. Det övergripande målet med denna metod är att skapa en generisk rörledning för en strömlinjeformad, ekonomisk och snabbare sätt att validera potentiella CSF markörer för neurodegeneration. Skälet är att använda riktade proteomik eller peptid MRM LC-MS / MS som en lätt kan ändras metod för att bedöma flera potentiella protein biomarkörer från upptäckt experiment. Dessa kan vidare multiplexeras över en snabb kromatografisk separation (<10 min) och bedömas. Inom denna multiplex skärm för neurodegenerativa biomarkörer har vi inkluderat den kända demensriskfaktorn apolipoprotein isoform E4 (ApoE4) så vi can bestämma samtidigt sin status och uttryck av att eliminera behovet av separata gentypningstester 2. LC MS / MS används rutinmässigt som den viktigaste metoden för exakt kvantifiering av små molekyler jämfört med andra metoder, såsom ELISA eller radioimmunanalys (RIA). Denna förskjutning i användningen av MS-teknik för att analysera proteiner, har drivits främst av problem med de immuno-baserade teknologier. Dessa innefattar tvär specificitet, variation mellan tillverkningspartier, begränsad hållbarhet och höga kostnader. Därför riktade proteomik snabbt på att bli en växande alternativ till antikroppsbaserade metoder såsom Western blotting, RIA och ELISA. Emellertid är förmågan att multiplexa flera markörer i en analys den största fördelen med denna teknik under immuno-baserade metoder 3. Tekniken kan tillämpas på många vävnader och har använts som en valideringsstrategi för många proteomikstudier inklusive plasma 4 och urin 5,6.
den technique kan tillämpas på alla laboratorier som har tillgång och expertis i att använda trippelkvadrupolmasspektrometer masspektrometrar. Peptid design är relativt enkelt med den ökande användningen av öppen källkod databaser. Den konkurrensutsatta marknaden anpassade peptider syntes gör dem mycket mer prisvärd. Tunga peptider är emellertid dyr och därför markörerna bör bedömas på en liten kohort innan han flyttade till en större skala. Det finns en växande potential för tekniken som ska användas i de kliniska diagnostiska inställningar, med de flesta stora sjukhus har trippelkvadrupol baserade plattformar som lätt kan anpassas för att köra riktade proteomik analyser. En sådan tillämpning av metoden, vilket gör det in i rutinmässig diagnostisk miljö, är dess tillämpning på senare tid till nyfödda blod plats screening för sicklecellanemi 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS:. Ett schema över den totala Protokollet som beskrivs här ges i Fi gur 1 Alla prover som används för utvecklingen av denna metod utgör överskotts kliniska diagnostiska prover och har etiskt godkännande från London Bloomsbury etikkommittén.
Figur 1. Schematisk illustrerar den övergripande processen för att skapa en riktad CSF MRM LC-MS / MS-analysen. Kandidat markerings peptider för utvärdering väljs från målproteiner. Genom användning av anpassade syntetiserade peptider, är en riktad LC-MS / MS-multiplex-metoden skapas. Efter utvärdering, kan analysen användas för att bedöma effekten av potentiella markörer för neurodegeneration.
1. Peptid Urval och design
OBS: Kriterier för en markör peptid är att den måste vara unikt (proteotypic (quantotypic). För att avgöra om en peptid är unikt eller inte, den "blast" sökverktyg på UniProt webbplats (http://www.uniprot.org/blast/) kan användas.
- Definiera en lista över målproteiner (markörer), det vill säga, ApoE (se tabell 2).
OBS: Om markören har identifierats från tidigare proteomik profilering experiment 8, välj sedan peptid som ger den bästa responsen från den datamängd. - Om denna information inte är tillgänglig, använder öppen källkod webbplatser, till exempel in silico trypsin nedbrytning av målproteiner, med hjälp av ett verktyg, såsom MS-Digest.
- Välj peptiden som är tryptisk och inte mottagliga för att posta translationella modifieringar.
OBS: Denna information kan kontrolleras på UniProt webbplats www.uniprot.org. Undvik peptider utsatta för kemisk modifiering under LC-MS provberedning. <li> Beställ anpassade syntes av de valda peptiderna.
OBS: Markör peptider kan skräddarsys syntetiseras av olika kommersiella företag. För ApoE den quantotypic peptid som används för att mäta den totala ApoE nivåer bestämdes vara AATVGSLAGQPLQER. De proteotypic peptidsekvenser som används för att bestämma E2 och E4 varianter är de tryptiska peptider för position 158 (RLAVYQAGAR och CLAVYQAGAR) och position 112 (LGADMEDVCGR och LGADMEDVR), respektive.
2. Beredning av standard peptider
OBS: För att välja ut de bästa kvantitativa övergångar behöver detektering av matrisen (CSF) optimeras. Det mest effektiva sättet att optimera multiplexerade peptider är att skapa pooler av peptiderna vid kända koncentrationer. Dessa pooler kan sedan användas för metodutvecklingen och standardkurvor.
- Resuspendera syntetiska peptider (peptid detaljer ges i tabell 2) till 1 mg / ml lagerkoncentrationen enligt tillverkarens instruktioner. Som standard, om instruktionerna inte är tillgängliga, återsuspendera peptider i 50:50 (v / v) acetonitril (ACN) / H2O
- Framställa de 1:10 utspädningar av peptiden från stamkoncentration och pool 1000 pmol av varje peptid i en låg bindnings mikrocentrifugrör. Torka i en speed-vac koncentrator den slutliga poolen och förvara vid -20 ° C. Förbered flera pooler för framtida bruk.
- Alikvotera 100 pl CSF till låga bindnings rör. Frystorkas CSF.
- Resuspendera en alikvot av poolade 1000 pmol peptider i digereringsbuffert (100 mM Tris HCl, pH 7,8, 6 M urea, 2 M tiourea, 2% ASB14) för att erhålla koncentrationer av 10 och 1 pmol / | il.
- Spike de sammanslagna peptider i de frystorkade 100 il alikvoter av CSF vid 0, 1, 2, 5, 10 och kl 15 koncentrationer. Tillsätt 20 ng av intakt obesläktat protein såsom jäst enolas för att verka som en intern standard och kontroll för matsmältningen effektivitet trypsin.
- Fyll GSR portioner med smälta buffert till en slutlig mängd av 20 ul. Virvel.
- Tillsätt 1,5 | il ditiotreitol (30 mg i 1 ml av 100 mM Tris HCl, pH 7,8) och skaka i rumstemperatur under 1 timme.
- Lägg 3 | il av jodacetamid (35 mg i 1 ml av 100 mM Tris HCl, pH 7,8) och skaka i rumstemperatur under 45 minuter i mörker.
- Lägg 165 pl DDH 2 O.
- Tillsätt 10 mikroliter av 0,1 mikrogram / l sekvense grad modifierad trypsin lösning suspenderades i 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 7,8. Inkubera i ett vattenbad vid 37 ° CO / N och stoppa digerering genom frysning prover. Store digests vid -20 ° C tills den ska analysera.
3. Optimering av MS peptid Detection
- Kopiera och klistra in sekvensen av peptiden som skall optimeras, till en lämplig programvara, till exempel, Skyline 9. Klicka på peptidsekvensen för att erhålla informationförväntade prekursor jon massa och produktjoner.
- Späd peptiderna från förrådskoncentration (se avsnitt 2.1) vidare till en ng / ml koncentration för MS metodutveckling.
- Direkt ingjuta peptiderna i masspektrometern på optimerad flödeshastighet (vanligtvis 0,1-0,8 ml / min) och med 0-5% kollisionsenergi.
- Förvärva MS-spektrum i syfte att identifiera de experimentella flerfaldigt laddade prekursor joner 8. Välja prekursorn jon (m / z) som ger den mest intensitet (doubly- eller tredubbelt laddade mellanproduktjoner rekommenderas).
- Reinfuse peptiden och tillämpa kollisionsenergi för att fragmentera peptiden genom kollision-inducerad-dissociation (CID). Optimera kon och kollisionsenergier för att få bästa fragmenteringsmönstret (fragmentjoner ensamma eller dubbelt laddade, och massan av fragment jon företrädesvis större än moderjoner, rekommenderas).
- Kontrollera att experimentellt erhållna övergångarna motsvarar övergångar genereras in silico </ Em> (såsom beskrivs i steg 3.1). Spara övergångslistan i MRM metoden fil med minst 2 mest intensiva övergångar per föregångare jon. Inkludera 2 övergångar: 1 för kvantifiering och en bekräftelse i den slutliga analysen.
OBS: Vissa MS tillverkare har en funktion (dvs Waters Intellistart) för automatiserad MRM eller SRM analys optimering. Om möjligt ingjuta peptider med kombinerade mobila faser vid 50 - 70% ACN med 0,1% FA.
4. LC-MRM Metodutveckling
OBS: Analysera blandning av syntetiska peptider genom en Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systemet kopplat till trippel kvadrupol masspektrometer. Se till att källan är ren. Lösningsmedel A är DDH 2 0 med 0,1% FA; Lösningsmedel B ACN med 0,1% FA.
- Använda LC-MS-system utrustat med en UPLC kolonn packad med C-18-fas (1,6 | j, m diameter, 90 Å porer, 2,1 mm x 50 mm längd) och fäst vid en pre-kolonn med samma fas. </ Li>
- Avfrostning CSF digests på is, centrifugera vid 16.000 g under 10 minuter och överföra 60 pl till 300 pl glasinsats flaskor och förvara resten tillbaka vid -20 ° C
- Injicera den högsta koncentrationen av standardkurva punkt med 10 min 1-40% ACN linjär gradient (se tabell 1 för lutning inställningar)
- Öppna den resulterande kromatogrammet och notera uppehållstid och de två översta mest intensiva (kvantitativa) övergångar per peptid med alla övergångar skapade i steg tre.
- Baserat på denna information, uppdatera en 10 min MRM metoden (skapade i steg 3,6) med tidsinställda kanaler för att mäta peptider (se figur 2 för ett exempel). För att upprätthålla känslighet, hålla varje kanal med poäng per topp större än 8 och uppehållstid större än 0,01 sek under minst en övergång för varje peptid.
- Inkludera "lösningsmedels fördröjningar i MRM metod: en i början fram till 10 sekunder innan den första toppen eluering ochen annan i slutet av förfarandet, 20 sekunder efter den sista toppen eluering. Gör detta genom att välja "lösningsmedels förseningar" i metod händelser i MS-metoden fil.
- Kör standardkurvan genom tids MRM metoden och se till att det inte finns några störande ospecifika toppar med övergångar (som genererats i steg 3,6) genom att kontrollera för linjäritet.
- Bestämma om peptiderna är detekterbara genom att köra icke-spetsade sammanslagna kontroll och sjukdom CSF genom metoden.
- Ta bort de peptider som är under gränsen för detektering från analysen.
Figur 2. Exempel på en dynamisk MRM MS metod. Tidskanaler peptid övergångar kan grupperas enligt fastställda retentionstider. Möjliggör MRMs att införlivas i en tidsinställd sätt som de utvalda markör peptiderna eluerar från kromatografikolonnen, minimerar antalet transitions över en tidsperiod och ökar känsligheten för analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Tillsats av intern standard
OBS: Som tidigare beskrivits 10 kan stabila isotopmärkta interna standarder inkluderas i analysen. På grund av kostnaden för dessa normer, är det tillrådligt att först utvärdera peptiderna i matrisen.
- Bestämma den ideala peptider optimerade för detektering i CSF: välja de peptider som är mest återkommande, med den högsta intensiteten och utan störningstoppar.
- Utformning motsvarande peptider att innefatta tunga 13 C 15 N aminosyra etiketter som ökar massan av peptiden med minst 6 Da relativt endogen peptid. Lägg också till en tagg av 4 - 6 ytterligare aminosyror till antingen N- eller C-terminalen av den tunga peptidvattnet att kontrollera för tryptisk digestion.
- Späd stabila isotopmärkta interna standarder i matsmältningen buffert (se steg 2,4). Bestämma den ideala mängden stabil isotopmärkt intern standard som kommer att spetsas i CSF genom tillsatta i olika nivåer beroende på överskotten tidigare observerats under utveckling. Syftar till att uppnå approximativt 1: 1 förhållande av stabila isotopen-märkt standard att endogen peptid.
OBS: Stabila isotopmärkta interna standarder kan syntetiseras genom olika kommersiella företag.
6. LC-MRM Analys av CSF patientprover
- Spike optimerad mängd av stabila isotopmärkta standarder i 100 pl CSF och frystorka blandningen.
- Suspendera CSF i 20 pl Digest buffert och utföra matsmältningen som beskrivs i punkterna 2.7 - 2.10.
- Analysera prover med LC-MRM metod som utvecklats i steg 4.
- För kvantitativ analys, kör standard peptidvatten i koncentrationer av 0 -15 pmol i en standardkurva. Se steg 2,5 för framställning av standardkurvan.
7. Data Analysis
OBS: Kvantitativa data baseras på intensiteten förhållandet mellan grundläggande topp interna standarder (tung märkta peptider). Detaljerad information om SRM / MRM dataanalys har tidigare beskrivits 10. Ratio data kan sedan användas i en standardkurva för att bestämma absoluta nivåer eller beräkna dem från den tillsatta koncentrationen av tung-märkt peptid.
- Analysera LC-MRM data med masspektrometrar tillverkarnas standardprogramvara 10. Alternativt kan du använda Skyline programvara för att analysera kvantitativa MRM uppgifter 10.
- Kontrollera känsligheten av körningen genom att kontrollera svaret från en inre standard, såsom den spetsade jäst enolas eller en stabil isotop-märkt standard i varje körning. Se till att variationskoefficienten (CV) inte är större än25%.
- Manuellt gå igenom data anteckning att säkerställa noggrannheten. Analysera varje peptid och förhållandet till en lämplig stabil isotopmärkt inre standard, det vill säga, använda den stabila isotopmärkt version av peptiden om den är tillgänglig.
- För att erhålla absoluta värdena för pmol per 100 | il CSF, köra dataförhållandet genom lämpliga standardkurvor som kördes vid samma tidpunkt.
- Beräkna variationskoefficienten (CV). CV för varje peptid bör vara under 25% och under 15% för höga rikliga peptider.
OBS: Absolut värde pmol per 100 pl CSF värden kan användas i efterföljande nedströms statistisk analys.
8. apolipoprotein E Isoform Status
OBS: För att bestämma ApoE isoform status, kan närvaron av motsvarande peptider utföras genom bestämning av närvaron av varje isoform.
- Betrakta ApoE i 100 pl CSF tröskeln> 1000 signal-till-brus som positiv för denna peptid. Se figur 5 för peptider som krävs / frånvarande för att bestämma en patients isoform status. Bestäm allela uttryck genom att beräkna% av varje isoform till totalt ApoE uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av förfarandet beskrivet ovan, en hög genomströmning 10 min multiplex assay bestående av 74 peptider från 54-proteiner utvecklats, som en analys för markörer av de neurodegenerativa störningar Alzheimers sjukdom och Lewykropp-demens (LBD) 8. Figur 3 visar en multiplex kromatogram publicerad tidigare åtta av de betydande peptidmarkörer från analysen. Peptiderna som ingår i analysen och deras kvantitativa övergångar ges i tabell 2. De data som genereras av denna metod ger standardiserade förhållanden till den relevanta stabil isotopmärkt inre standard. Dessa värden kan sedan genomgå en standardkurva för att bestämma absoluta pmol / 100 pl CSF koncentrationer. Dessa värden kan sedan analyseras statistiskt för förändringar i kliniska prover.
Såsom beskrivits tidigare 8, kvantifiering av de 74 peptides ingår i denna CSF analys visade att 25 av dessa markörer har ändrats betydligt i CSF hos demenspatienter. För att illustrera effektiviteten hos denna analys, resultat från tidigare beskrivna demens markörer Pro-orexin och YKL kitinas 3-liknande protein (YKL-40) 11,12 ges i figur 4. Den integrerade ApoE-analysen identifierar ApoE isoform / allel status patienten också. Apo E4 är en känd riskfaktor för Alzheimers sjukdom, därför att integrera denna i analysen kommer att ge värdefull information. Detekteringen av ApoE isoformer förklaras i fig 5 och är baserad på detekteringen av de motsvarande peptider för aminosyraförändringar för isoformer E2 (R158C) och E4 (C112R). Figur 5A visar den toppdiagram som förväntas för varje isoform kombination och Figur 5B visar resultatet av en CSF testades med analysen på patientprover.
Figur 3. Representativa överlagrade MRM Kromatogram. Reprint från Heywood et al. 8 Biomarkers betydelse för de neurodegenerativa sjukdomar Lewy body demens och Alzheimers sjukdom 8 visas under en 10 min LC gradient. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på data. Reprint från Heywood et al. 8 Diagram visar hur den beskrivna MRM LC-MS / MS-metod på ett tillförlitligt sätt kan kvantifiera och diskriminera från kontroller de kända neurodegenerativa markörer såsom YKL kitinas 3-liknande protein (YKL-40) 11 , 12 och AD markör Pr o-orexin 13. AD = Alzheimers sjukdom, LBD = Lewykropp-demens och PD = Parkinsons sjukdom. Data som tidigare publicerats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Illustration av hur Apo E Isoform status hos en patient kan bestämmas. A. Anger peptiderna omfattar 112 aminosyrasekvensen LGADMEDVCGR för neutral (E3a) eller LGADMEDVR för närvaro av E4 och för position 158 för att detektera RLAVYQAGAR den neutrala (E3B) eller CLAVYQAGAR för E2-isoformen. B. Peptider från ApoE sekvensen visas i panelen till vänster. De olika kombinationer av de peptider som detekteras i CSF kan indikera ApoE isoform status.filer / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tid | Flöde (ml / min) | % A | % B | Kurva |
| Första | 0,8 | 97 | 3 | första |
| 0,2 | 0,8 | 97 | 3 | 6 |
| 0,8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7,01 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8,01 | 0,8 | 97 | 3 | 1 |
| 10 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Tabell 1. UPLC Gradient inställningar för en 10 min Metod. A = DDH 2 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA
Tabell 2. Peptider Ingår i CSF MRM LC MS / MS-analysen. Visade är alla ingående peptider som användes i metoden, som beskrivs och publicerade åtta. Uppgift om huruvida den markör detekteras tillförlitligt i 100 pl CSF indikeras. Övergångar märkta i fet stil är de som används för kvantitativ data. Klicka här för att ladda ned den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med alla MS baserade analyser, de kritiska stegen i förfarandet är att fastställa de lämpliga och exakta mängder av inre standarder. Om absolut kvantifiering används, då de rätta mängderna av spetsade peptider i standardkurvan är också kritisk.
Vår analys kräver inte utfällningen av CSF eller användning av någon typ av rena upp eller avsaltningssteg före MS-analys - det är en helt enkärlsreaktion metod. På grund av den lilla volymen av CSF och dess begränsade komplexitet (jämfört med plasma), har det visat sig att dessa steg kan tas bort från den slutliga protokollet, vilket förenklar analysen och göra det mer lämpligt för översättning till diagnostisk inställning. Införlivandet av en förkolonn till huvud analytisk kolonn och lösningsmedels förseningar i MS-metoden, verkar vara tillräcklig för att upprätthålla känslighet under MS köra för mer än 500 prover. Som analysen-UPLC running tid är kort, det är viktigt att otvetydigt identifiera rätt topp i CSF smälta matrisen.
Detta kan endast åstadkommas med användning av spetsade syntetiserade peptider och en standardkurva. Om det finns en osäkerhet på en peptid matchas till rätt kromatografiska toppen då kan det vara användbart att köra provet genom multipla övergångar och kontrollera övergångar intensitetsmönstret med de syntetiska standarder. Alla våra analyser innehåller minst 2 peptider övergångar för att bekräfta identiteten av peptiden.
Analysen har utvecklats för markörer som detekteras i upp till 100 pl CSF. För vissa andra markörer av demens, kan behövas en större volym av CSF. En annan begränsning av analysen är frågan om dynamiska området för proteinuttryck. Vissa rikliga markörer måste injiceras på masspektrometern i en mindre mängd, medan vissa låga rikliga markörer kräver större injektionsvolymer. Därför sample kan behöva injiceras två gånger.
Betydelsen av denna teknik är förmågan att multiplexa och den ökade specificiteten hos de 3 nivåer av identifiering över antikroppar (retentionstid, prekursorn och produkten m / z). Ur klinisk översättning, är den största fördelen den potentiella kostnadsbesparingar på antikroppar, även om en inledande kostnaderna för mass utrustning spektrometri och utbildad personal krävs. En annan tillgång är hastigheten i vilken metoden kan översättas till de trippelkvadrupol baserade system. Detta snabbar upp avsevärt förmågan att översätta och validera en analys jämfört med alla immunbaserade tekniker. Slutligen, eftersom denna plattform och kompetens har rutinmässigt används för att mäta små molekyler kliniskt, många stora sjukhuscentra har redan denna infrastruktur på plats. När det gäller neurodegeneration finns en hel del fokus och behov av nya biomarkörer i CSF och serum. Denna metod tillhandahåller en platform en hög genomströmning analys där framtida markörer kan läggas till (och tas bort) som skall bedömas för effektivitet, etc. Denna teknik har ytterligare tillämpning till andra vävnader för ApoE isoform identifiering, såsom plasma, som redan har beskrivits 2 och till och med blodfläckar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V.
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
