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Immunology and Infection

साथ प्रायोगिक संक्रमण Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन लिस्टेरिया monocytogenes के EGD तनाव के साथ C57BL / 6J चूहों टीका लगाना करने के लिए कैसे (एल monocytogenes) और इंटरफेरॉन γ (IFN-γ) प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.), प्राकृतिक हत्यारा टी (NKT) कोशिकाओं द्वारा प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, और अनुकूली टी के बाद संक्रमण लिम्फोसाइटों। इस प्रोटोकॉल का भी वर्णन कैसे रोगज़नक़ का एक संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ संक्रमण के बाद चूहों में अस्तित्व के अध्ययन का संचालन करने के लिए।

Abstract

एल monocytogenes एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु मानव में खाद्य जनित रोग का एक कारण है। इस रोगज़नक़ के साथ चूहों की प्रायोगिक संक्रमण intracellular रोगजनकों के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा में सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं और विशिष्ट साइटोकिन्स की भूमिका पर बेहद जानकारीपूर्ण किया गया है। एल monocytogenes साथ sublethal संक्रमण के दौरान IFN-γ जन्मजात कोशिकाओं द्वारा की उत्पादन मैक्रोफेज और रोगज़नक़ 1-3 के प्रारंभिक नियंत्रण को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अनुकूली स्मृति लिम्फोसाइट द्वारा IFN-γ उत्पादन reinfection 4 पर सहज कोशिकाओं की सक्रियता भड़काना के लिए महत्वपूर्ण है। एल संक्रमण मॉडल monocytogenes इस प्रकार की जांच के लिए एक महान उपकरण के रूप में कार्य करता है कि क्या नए उपचारों कि IFN-γ उत्पादन बढ़ाने के लिए तैयार कर रहे हैं विवो में IFN-γ प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव पड़ता है और इस तरह के जीवाणु क्लीयरेंस बढ़ रही है या माउस अस्तित्व में सुधार के रूप में उत्पादक जैविक प्रभाव है सेसंक्रमण। यहाँ बताया कि कैसे एल monocytogenes के EGD तनाव के साथ C57BL / 6J चूहों की intraperitoneal के संक्रमण का संचालन करने और cytometry एन.के. कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं, और अनुकूली लिम्फोसाइट द्वारा IFN-γ उत्पादन प्रवाह से मापने के लिए के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल है। (1) बढ़ने और टीका के लिए बैक्टीरिया तैयार करते हैं, (2) प्लीहा और यकृत, और समापन के लिए (3) उपाय के पशु अस्तित्व में बैक्टीरियल लोड मापने: इसके अलावा, प्रक्रियाओं के लिए वर्णित हैं। प्रतिनिधि डेटा भी वर्णन कैसे इस संक्रमण मॉडल एल monocytogenes और इस संक्रमण से चूहों के अस्तित्व के लिए IFN-γ प्रतिक्रियाओं पर विशेष एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान की जाती हैं।

Introduction

IFN-γ एक साइटोकाइन कि intracellular रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता में मध्यस्थता के लिए और 5 ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरियल प्रतिरोध में इस साइटोकाइन के महत्व अवलोकन है कि साथ IFN-γ संकेतन मार्ग में परिवर्तन अत्यधिक माइक्रोबैक्टीरिया और salmonellae 6 के साथ संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, मनुष्यों में स्पष्ट है। इसी तरह, चूहों, या तो IFN-γ या IFN-γ रिसेप्टर प्रदर्शनी एल monocytogenes 10,11 माइक्रोबैक्टीरिया 7-9 और अन्य intracellular रोगजनकों के लिए प्रतिरोध में दोष सहित कमी लीशमैनिया प्रमुख 12, साल्मोनेला 13, और कुछ वायरस 11। Combatting रोगजनकों के अलावा, IFN-γ ट्यूमर 14 के खिलाफ मेजबान रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि IFN-γ के उच्च उत्पादन संक्रमण या कैंसर के संदर्भ में फायदेमंद है, यह साइटोकाइन के लंबे समय तक उत्पादन टी जोड़ा गया हैप्रणालीगत औतोइम्मुिनित 15-17 के विकास और प्रकार के त्वरण ओ मैं गैर-मोटे मधुमेह माउस मॉडल 18 में मधुमेह।

IFN-γ का प्रमुख स्रोत एन.के. कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं, γδ टी कोशिकाओं, टी सहायक 1 (Th1) कोशिकाओं, और साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (सीटीएल) 5,19,20 शामिल हैं। IFN-γ द्वारा दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा को बढ़ाता है: (1) को विनियमन प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) वर्ग मैं और द्वितीय अभिव्यक्ति, (2) प्रतिजन कोशिकाओं पर सह उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति में वृद्धि, (3) बढ़ाने बृहतभक्षककोशिका phagocytosis और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन और microbicidal कारकों (जैसे, नाइट्रिक ऑक्साइड और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों), (4) Th1 प्रेरक कोशिकाओं में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने, (5) इम्युनोग्लोबुलिन के लिए एंटीबॉडी वर्ग परिवर्तन को बढ़ावा देने ( आईजी) 2A और IgG3 (माउस में), (6) मैं की साइटों के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती के लिए chemokines के उत्पादन उत्प्रेरणnfection, और (7) एन.के. सेल और सीटीएल प्रतिक्रियाओं 5,19 बढ़ाने। रोगजनकों और ट्यूमर के लिए मेजबान जवाब में IFN-γ के निर्णायक महत्व को देखते हुए, पुनः संयोजक IFN-γ विभिन्न संक्रमण और कैंसर (19 में समीक्षा) के लिए एक इलाज के रूप में परीक्षण किया गया है। हालांकि, क्योंकि IFN-γ या Th1 को बढ़ावा देने साइटोकाइन इंटरल्यूकिन 12 (आईएल -12) के प्रणालीगत प्रशासन साइड इफेक्ट के साथ जुड़ा हुआ है और खुराक से संबंधित विषाक्तता 19,21 जाता है, वहां वैकल्पिक रणनीतियों के विकास के द्वारा IFN-γ उत्पादन को बढ़ाने के लिए ब्याज है प्रतिरक्षा कोशिकाओं। नई जैविक और छोटे अणुओं के विकास परीक्षण करने के लिए इस तरह के एजेंटों के एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान IFN-γ उत्पादन बढ़ाने के लिए है कि क्या इन विवो स्क्रीनिंग उपकरण में की आवश्यकता है और इस तरह के पशु अस्तित्व में वृद्धि के रूप में सार्थक जैविक प्रभाव में तब्दील हो जाए।

ग्राम पॉजिटिव जीवाणु एल monocytogenes के साथ चूहों की प्रायोगिक संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई मॉडल किया गया हैintracellular रोगजनकों 1,22 के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा में IFN-γ की भूमिका का गूढ़ रहस्य। रोगज़नक़ नसों या intraperitoneally (आईपी) के साथ चूहों के संक्रमण प्लीहा और यकृत, जहां वे निवासी मैक्रोफेज और 3 और 4 दिनों के बाद के बीच होने वाली तिल्ली में चोटी जीवाणु भार के साथ hepatocytes से भली भाँति बनने के लिए बैक्टीरिया के तेजी से प्रसार करने के लिए सुराग संक्रमण 1,3,22। IFN-γ एन.के. कोशिकाओं द्वारा की उत्पादन बृहतभक्षककोशिका सक्रियण और रोगज़नक़ 3 के खिलाफ प्रारंभिक प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि उच्च संक्रामक खुराक पर, IFN-γ का उत्पादन भी रोगज़नक़ क्लीयरेंस 23 के लिए हानिकारक हो सकता है। NKT कोशिकाओं को भी रोगजनकों 2,24 के प्रारंभिक नियंत्रण के दौरान प्लीहा और यकृत में IFN-γ का स्रोत रहे हैं और इस उत्पादन एन.के. कोशिकाओं 2 सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं द्वारा IFN-γ उत्पादन बढ़ाना करने के लिए दिखाया गया है। दूसरी ओर, बाद में अभिनय अनुकूली टी lymphocytes, पार्टी में सीडी 8 + टी कोशिकाओंcular, रोगज़नक़ की निकासी मध्यस्थता और फिर से संक्रमण 1,4,22 के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

इस संक्रमण मॉडल कारणों की एक संख्या (1 में समीक्षा) के लिए शोधकर्ताओं के लिए आकर्षक हो गया है। सबसे पहले, रोगज़नक़ के साथ संक्रमण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और एक मजबूत Th1 और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया लाती है। दूसरे, sublethal संक्रमण के दौरान, बैक्टीरियल लोड जिगर और तिल्ली जहां यह आसानी से मापा जा सकता है में केंद्रित है। तीसरा, रोगज़नक़ सुरक्षित रूप से जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) की शर्तों के तहत नियंत्रित किया जा सकता है। चौथे, जीव और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया यह बड़े पैमाने पर किया गया विशेषता है उत्पन्न करता है। अंत में, उत्परिवर्ती और आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की एक किस्म विकसित किया गया है कि प्रयोग के लिए उपलब्ध हैं।

यहाँ वर्णित है एल के EGD तनाव के साथ C57BL / 6J चूहों का टीका के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल 25 monocytogenes और IFN को मापने के लिए - γ फिर सेएन.के., NKT, और अनुकूली लिम्फोसाइटों के बाद संक्रमण से sponses। इसके अलावा बताया कि कैसे sublethal संक्रमण के बाद तिल्ली में बैक्टीरियल लोड और जिगर को मापने के लिए और रोगज़नक़ का एक संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ संक्रमण के बाद अस्तित्व के अध्ययन के लिए बाहर ले जाने के लिए है। अंत में, प्रतिनिधि डेटा कैसे इस प्रोटोकॉल IFN-γ प्रतिक्रियाओं और माउस के अस्तित्व पर नए उपचार के प्रभाव स्क्रीन करने के लिए एल से संक्रमण monocytogenes इस्तेमाल किया जा सकता दिखाए जाते हैं।

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Protocol

सुरक्षा वक्तव्य

इस प्रोटोकॉल को लाइव एल monocytogenes के साथ चूहों के संक्रमण का वर्णन है। रोगज़नक़ प्रशिक्षित कर्मियों जो immunocompromised नहीं कर रहे हैं द्वारा BSL2 की शर्तों के तहत सुरक्षित रूप से नियंत्रित किया जाता है। Immunocompromised लोगों गर्भवती महिलाओं, बुजुर्गों और व्यक्तियों, जो एचआईवी संक्रमित हैं या पुरानी स्थिति है कि immunosuppressive चिकित्सा के साथ उपचार की आवश्यकता है शामिल हैं। जबकि संक्रमित नमूनों से निपटने के कर्मियों को एक सुरक्षात्मक प्रयोगशाला कोट या गाउन, दस्ताने, मास्क, और आंखों की सुरक्षा डॉन चाहिए। काम के साथ साथ वर्णित एक प्रमाण पत्र (# 32876) है कि विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क द्वारा जारी किया गया था (UHN) जैव सुरक्षा कार्यालय के अंतर्गत BSL2 शर्तों के तहत किया गया था। संक्रमित चूहों या किसी भी अप्रयुक्त ऊतकों से शवों डबल जीता और Biohazard बेकार में का निपटारा किया गया। संक्रमित चूहों से भी पिंजरों autoclaving द्वारा decontaminated थे।

नैतिकता कथन

चूहे बनाए रखा और एक quara में संक्रमित थेUHN पशु सुविधाओं के भीतर ntine कमरे और दिशा निर्देशों पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद द्वारा निर्धारित मानकों के अनुसार देखभाल कर रहे थे। चूहों पर सभी प्रक्रियाओं के तहत पशु का उपयोग प्रोटोकॉल # 3214 कि UHN जानवरों की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था बाहर किए गए। नैतिक आधार के कारण, मृत्यु अस्तित्व के अध्ययन के लिए एक समापन बिंदु के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया था। संशोधित एलडी 50 खुराक यहाँ एल के लिए सूचना दी monocytogenes संक्रमण खुराक, जिस पर चूहों का 50% विशिष्ट समापन, जो शरीर के वजन में 20% की हानि या निम्न नैदानिक लक्षण के कम से कम दो दिखा के शामिल पहुँच होने के लिए निर्धारित किया गया था: सुस्ती, झालरदार फर, hunched आसन, कृत्रिम श्वास, सुस्त या धँसा आँखें। चूहे euthanized थे जब वे कार्बन डाइऑक्साइड के लिए जोखिम के माध्यम से समापन (सीओ 2) UHN सुविधा के दिशा-निर्देशों के अनुसार पहुंच गया।

लंबी अवधि के भंडारण के लिए ग्लिसरॉल शेयरों की 1. तैयारी

नोट: इस प्रक्रिया का वर्णन के कैसे ग्लिसरॉल शेयरोंएल monocytogenes के EGD तनाव एक मूल ग्लिसरॉल स्टॉक से तैयार कर रहे हैं। कदम संभावित एयरोसौल्ज़ उत्पन्न करने के लिए है कि एक प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के भीतर किया जाना चाहिए।

  1. बैक्टीरिया विकास के लिए मस्तिष्क दिल अर्क (भी) अगर प्लेटें तैयार करें। इस 3.8% जोड़ने के लिए (w / v) BHI शोरबा और 1.5% (w / v) अगर आसुत दोगुना करने के लिए एच 2 ओ (DDH 2 हे)। आटोक्लेव तरल। एक बार अगर 50 डिग्री सेल्सियस के लिए होता है, जीवाणु पेट्री डिश में तरल बांटना (25 मिलीग्राम / पकवान) और सूखी प्लेट (खुला) बीएससी में 1 घंटे के लिए करते हैं।
    नोट: autoclaving के बाद एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित BHI अगर प्लेटें डालने का कार्य करने से पहले solidification से बचने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर BHI प्लेटों उल्टा (शीर्ष पर मीडिया की ओर से) उपयोग के लिए तैयार है जब तक।
  2. तरल BHI मीडिया तैयार करें। इस के लिए, मिश्रण 3.8% (w / v) DDH 2 ओ आटोक्लेव में BHI शोरबा।
  3. से एल monocytogenes EGD तनाव के जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक हटाये -80 सी फ्रीज °आर और कमरे के तापमान को पिघलना।
  4. एक BHI प्लेट के एक वर्ग भर में आगे और पीछे thawed ग्लिसरॉल स्टॉक में एक बाँझ विंदुक टिप टिप और तुरंत लकीर डुबकी। इस प्राथमिक लकीर है।
  5. 90 डिग्री सेल्सियस से प्लेट मुड़ें और एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग, पहली लकीर के माध्यम से खींचें और थाली के अगले ¼ के लिए यह फैल (इस माध्यमिक लकीर है)। तृतीयक लकीर बनाने के लिए एक बार फिर दोहराना।
  6. बारी प्लेट उल्टा और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एकल वर्दी कालोनियों धारियाँ के अंतिम सेट में प्राप्त की और 16 और 24 घंटा के बीच दिखाई जानी चाहिए।
  7. एक बाँझ दिए 50 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ BHI शोरबा के 10 मिलीलीटर बांटना। प्लेट एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करने से एल monocytogenes में से एक कॉलोनी उठाओ और शोरबा टीका लगाना। रात भर या आयुध डिपो के 600 = मिनट (आरपीएम) प्रति 225 घुमाव पर सेटिंग्स के साथ 1.0 जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर में संस्कृति सेते हैं।
    नोट: ग्लास या डिस्पोजेबल पीएलएstic Erlenmeyer बोतल भी संस्कृति बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस्तेमाल किया कंटेनर के प्रकार के बावजूद, यकीन है कि यह बाँझ, दिए है और संस्कृति की मात्रा बैक्टीरिया की उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर की कुल मात्रा का 20% से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  8. : 1 के अनुपात में एक 1 में रात भर बैक्टीरियल तरल संस्कृति के साथ बाँझ 100% ग्लिसरॉल के मिश्रण से ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करें। 2 मिलीलीटर क्रायोजेनिक शीशियों (500 μl / शीशी) और भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए स्थानांतरण शीशियों में बैक्टीरियल / ग्लिसरॉल मिश्रण बांटो।
    ध्यान दें: मनका शेयर तरीकों में भी ग्लिसरॉल शेयरों की जगह बैक्टीरिया को स्टोर करने में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि से, झरझरा microbeads एल monocytogenes का एक शुद्ध संस्कृति के साथ inoculated हैं और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। प्रत्येक मनका जरूरत के रूप में एक ताजा संस्कृति टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिक जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें।

2. एल के विकास की अवस्था का निर्धारण दिन संस्कृति में monocytogenes नोट: इस प्रक्रिया का वर्णन कैसे एल monocytogenes है कि संक्रमण के अध्ययन के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए विकास की अवस्था उत्पन्न करते हैं। सभी कदम संभावित एयरोसौल्ज़ उत्पन्न करने के लिए है कि एक प्रमाणित बीएससी के भीतर किया जाना चाहिए।

  1. एक दिए 50 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर BHI मीडिया के लिए 1.7 कदम में उत्पन्न रातोंरात संस्कृति के 100 μl ले लो और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर (225 आरपीएम, 45 डिग्री के कोण पर झुका हुआ है) में 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है। एक नियंत्रण के रूप में एक गैर-टीका ट्यूब का प्रयोग करें।
  2. एक घंटे के अंतर पर संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर नमूने ले लो (1, 2, 3, 4, 5, 6 घंटा, आदि।)। एक प्लास्टिक क्युवेट में BHI मीडिया के साथ 1 (वी / वी): प्रत्येक विभाज्य 1 पतला। पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए। उपाय 600 एनएम (600 आयुध डिपो) एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट)। आयुध डिपो के 600 = 1 जब तक बैक्टीरिया संवर्धन जारी रखें।
  3. इसी समय, संस्कृति की 100 μl नमूना लेने के लिए और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइकर में 900 μl BHI मीडिया के साथ पतलाocentrifuge ट्यूब (इस 10 -1 कमजोर पड़ने है)। 5 मिनट के लिए 6000 XG पर बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  4. बैक्टीरिया, BHI मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली resuspending 6000 XG पर 5 मिनट के लिए centrifuging, और फिर सतह पर तैरनेवाला aspirating द्वारा दो बार धोएं। 1 मिलीलीटर BHI मीडिया में गोली Resuspend। BHI मीडिया (10 -2 10 -9 के लिए) में इस नमूने की एक 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें। अलग BHI अगर प्लेट पर प्रत्येक मंदक के 100 μl बिखरा हुआ है। एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें सेते हैं।
  5. 300 कॉलोनियों - अगले दिन, प्लेटें 30 के बीच है उठाओ। बाकी त्यागें। इन प्लेटों पर कालोनियों गणना। तालिका 1 एक विभाज्य में प्राप्त की गिनती के लिए एक उदाहरण है कि लिया गया था जब आयुध डिपो के 600 = 0.84 चलता। इस उदाहरण में, प्लेटों में से एक है (यानी, 10 -6 कमजोर पड़ने) कॉलोनी मायने रखता है 30 के बीच थी - 300 और CFU / एमएल गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    नोट: अधिक से अधिक के साथ प्लेटों300 से अधिक कालोनियों के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं के बाद से भीड़भाड़ बैक्टीरिया विकास में बाधा कर सकते हैं और यह भी मुश्किल विचार और व्यक्तिगत कालोनियों गणना करने के लिए बनाता है। क्योंकि कमजोर पड़ने तकनीक या दूषित पदार्थ की मौजूदगी में छोटी त्रुटियों रेंज के निचले अंत में गिना जाता है की शुद्धता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है मायने रखता है <30 के साथ प्लेट भी नहीं किया जाता है।
  6. मात्रा चढ़ाया द्वारा कालोनियों की संख्या में विभाजित है और फिर कमजोर पड़ने कारक एक विशेष कमजोर पड़ने के लिए CFU / एमएल मूल्य प्राप्त करने के लिए से गुणा करें। तालिका 1 में उदाहरण में, 10 -6 कमजोर पड़ने पर गिनती 70 फूट डालो 0.1 मिलीलीटर द्वारा इस मूल्य पतला संस्कृति के लिए CFU / एमएल मूल्य पाने के लिए किया गया था। तब undiluted संस्कृति (7.0 x 10 8) की CFU / एमएल मूल्य प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने कारक (10 6) द्वारा इस मूल्य गुणा।
  7. एच में 600 आयुध डिपो (शाफ़्ट) बनाम समय (एक्स अक्ष) प्लॉट विकास 26 का लघुगणक चरण की पहचान।
    नोट: यह वृद्धि curvजब एक निश्चित आयुध डिपो पढ़ने हो गई ई दिन संस्कृति के CFU / एमएल के एक अनुमान प्रदान करता है। एक आयुध डिपो के 600 पढ़ने उस दिन संस्कृतियों से बढ़ के लिए लक्ष्य 600 आयुध डिपो के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है विकास की लघुगणक चरण में है चुनें। ये आंकड़े अब inoculum की तैयारी के लिए एक संस्कृति में CFU का अनुमान किया जा सकता है (प्रक्रिया 3)।

एल monocytogenes के साथ प्रायोगिक संक्रमण के लिए inoculum के 3. तैयारी

नोट: यह प्रक्रिया एक दिन में संस्कृति है कि एक रात संस्कृति से शुरू किया गया था से संक्रामक inoculum की तैयारी का वर्णन (प्रक्रिया 2 में तैयार)। इन सभी चरणों के बीएससी में प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक अन्यथा इंगित।

  1. चूहों और अध्ययन के प्रयोगात्मक डिजाइन की संख्या के आधार पर संक्रमण के लिए आवश्यक CFU की संख्या की गणना। BHI मीडिया का एक उचित मात्रा एक बाँझ दिए Erlenmeyer कुप्पी या संस्कृति ट्यूब में जोड़े।
    नोट: बैक्टीरिया पी के CFUrepared प्रयोग के प्रकार प्रदर्शन पर निर्भर हो जाएगा। संक्रमण के दौरान एनके और NKT सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, प्रत्येक माउस बैक्टीरिया की 10 5 CFU (प्रक्रिया 6) के साथ टीका है। संक्रमण के लिए अनुकूल टी सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन या बैक्टीरियल लोड मापने हैं, प्रत्येक माउस बैक्टीरिया के 2 एक्स 10 4 CFU (प्रक्रिया 8) के साथ टीका है। अगर समापन करने के लिए अस्तित्व का अध्ययन, प्रत्येक माउस रोगज़नक़ के एलडी 50 खुराक (जो पुरुषों के लिए 10 5 CFU और महिलाओं के लिए 1.5 x 10 5 CFU, वहाँ प्रक्रिया 9) के साथ टीका है।
  2. रातोंरात संस्कृति के 100 μl के साथ BHI मीडिया युक्त ट्यूब टीका लगाना। एक 37 डिग्री सेल्सियस कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर (225 आरपीएम) लक्ष्य 600 आयुध डिपो तक में संस्कृति सेते तक पहुँच जाता है। एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति सामग्री हस्तांतरण।
  3. 6000 XG पर 5 मिनट के लिए एक गोली में अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया एक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर। सतह पर तैरनेवाला एक वैक्यूम ब्लीच युक्त एक जाल कुप्पी से जुड़ी का उपयोग कर aspirate।
  4. धो 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार गोली, बीच में centrifuging (6000 XG पर 5 मिनट)।
  5. दूसरे धोने Aspirate और 1x पीबीएस में उचित एकाग्रता एक 200 μl मात्रा में प्रत्येक माउस के लिए ब्याज की CFU वितरित करने पर बैक्टीरिया पतला।
    नोट: यह बैक्टीरिया धोने के लिए और inoculum की तैयारी के लिए बाँझ 1x पीबीएस के एक व्यावसायिक स्रोत का उपयोग करने के बाद से प्रयोगशाला कांच के बने पदार्थ जैसे कि lipopolysaccharide के रूप में प्रतिरक्षा दूषित पदार्थों को लागू कर सकते हैं सबसे अच्छा है।

4. एल monocytogenes के साथ चूहे की प्रायोगिक संक्रमण

नोट: इस प्रक्रिया का वर्णन प्रक्रिया 3 और कैसे CFU inoculum में दिया सत्यापित करने के लिए तैयार inoculum के साथ चूहों को संक्रमित करने के लिए कैसे। चूहों और इंजेक्शन की हैंडलिंग एक बीएससी में प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. अपने प्रयोग के लिए पुरुष या महिला C57BL / 6J चूहों के लिए पर्याप्त संख्या में आदेश। यह भी आदेश में चूहों के रूप में असंक्रमित नियंत्रण सेवा के लिए।
  2. चूहों की अनुमति दें1 सप्ताह जीवाणु टीका से पहले जलवायु के अनुकूल बनाना।
    नोट: यह इसलिए है क्योंकि जानवरों के परिवहन के साथ जुड़े तनाव तनाव हार्मोन का उत्पादन और lymphopenia 27,28 में एक क्षणिक वृद्धि को गति प्रदान कर सकते हैं।
  3. टीका के दिन, प्रत्येक माउस के लिए एक आधारभूत शरीर के वजन को प्राप्त करने और प्रयोगशाला नोटबुक में यह रिकॉर्ड है।
  4. बीएससी में, जीवाणु निलंबन ऊपर और एक बाँझ पिपेट का उपयोग सुनिश्चित करना है कि बैक्टीरिया में समान रूप से वितरित कर रहे हैं और फिर एक 1 मिलीलीटर सुरक्षा इंजीनियर एक 25 जी सुई के साथ लगे सिरिंज में inoculum के 200 μl को लेने के नीचे मिश्रण।
  5. तैयार inoculum के 200 μl के साथ एक माउस आईपी इंजेक्ट (जैसे, एन.के. सेल संक्रमण के लिए 10 5 CFU, प्रक्रिया 6)। इस प्रक्रिया के लिए, माउस के कंधों के आसपास ढीली त्वचा हथियाने के द्वारा कम प्रमुख हाथ के साथ चूहों कूड़ा। यह सुनिश्चित करना है कि माउस अच्छी तरह से संयमित होने के बाद, पेट के निचले चक्र में माउस इंजेक्षन सिर्फ मीटर पार्श्वidline मूत्राशय से बचने के लिए।
  6. सुई और एक biohazard तेजधार कंटेनर में सिरिंज के निपटान के।
  7. दोहराएँ कदम 4.3 - 4.6 जब तक सभी चूहों को इंजेक्शन हैं। इंजेक्शन चूहों (गैर संक्रमित नियंत्रण) 1x पीबीएस के साथ इसी तरह के कदम का संचालन।
    नोट: चूंकि CFU विकास की अवस्था के आधार पर एक अनुमान है, यह भी inoculum में वास्तविक CFU जाँच करने के लिए अच्छा अभ्यास है। तैयार inoculum (10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला का उपयोग) के 4 विभिन्न dilutions कि आप गणनीय कालोनियों में परिणाम होगा उम्मीद है - इस के लिए, 3 तैयार करते हैं। एक BHI अगर प्लेट पर प्रत्येक मंदक के 100 μl बिखरा हुआ है और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं। कालोनियों की गिनती और प्रक्रिया 2 में वर्णित के रूप में वास्तविक CFU / एमएल की गणना।

इम्यून अध्ययन के लिए 5. तैयारी हीट मारे एल monocytogenes

नोट: सभी चरणों के संभावित उत्पन्न करने के लिए एयरोसौल्ज़ बीएससी के भीतर प्रदर्शन कर रहे है।

  1. जब तक 600 आयुध डिपो मूल्यों को एक दिन के संस्कृति विकसिततक पहुँच रहे हैं कि लघुगणक चरण के भीतर हैं। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में संस्कृति बांटना।
  2. 1 घंटे के लिए एक पानी के स्नान में एक 70 डिग्री सेल्सियस में ट्यूबों सेते बैक्टीरिया को मारने के लिए।
  3. कदम 3.3 और 3.4 में के रूप में 1x पीबीएस के साथ दो बार बैक्टीरिया धो लें। भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त बाँझ पूरा RPMI मीडिया में Resuspend 4 x 10 6 / एमएल की एकाग्रता में (नुस्खा के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। अशेष -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर बाँझ क्रायोजेनिक शीशियों और दुकान में बैक्टीरिया को मार डाला।
  4. BHI अगर प्लेट पर गर्मी की मौत हो बैक्टीरिया तैयारी के 100 μl फैल रहा है और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubating द्वारा जीवाणुओं की मौत की पुष्टि करें।
    नोट: किसी भी BHI अगर प्लेट पर बढ़ रही कालोनियों देखते हैं तो ये गर्मी मारे गए बैक्टीरिया प्रक्रिया 8 में संस्कृति में लिम्फोसाइट उत्तेजक के लिए तैयार किया जाना चाहिए, गर्मी की मौत हो गई प्रक्रिया को दोहराएँ।

6. संक्रमण के दौरान एनके और NKT कोशिकाओं द्वारा IFN-γ प्रतिक्रियाएँ मापन

नोट: इस प्रक्रिया का वर्णन कैसे एल monocytogenes के 10 5 CFU साथ संक्रमण के बाद 24 घंटे में चूहों में एन.के. और NKT कोशिकाओं द्वारा IFN-γ प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए। इस खुराक का इस्तेमाल किया क्योंकि यह तिल्ली 24 में एन.के. और NKT कोशिकाओं द्वारा मजबूत IFN-γ प्रतिक्रियाएं लाती है। बीएससी में सभी चरणों का संचालन। मदद करने के लिए सेल व्यवहार्यता बनाए रखने, बर्फ पर कोशिकाओं को रखने के लिए जब भी संभव है और ठंडा buffers का उपयोग करें।

  1. एल monocytogenes के 10 5 CFU साथ प्रक्रिया 4 में वर्णित के रूप में चूहों टीका लगाना। इसी समय, इंजेक्षन गैर संक्रमित चूहों पर नियंत्रण 1x पीबीएस के एक बराबर मात्रा के साथ आईपी।
  2. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार सीओ द्वारा 24 घंटा के बाद टीका पर चूहों euthanize 2 साँस लेना।
  3. अपनी सही पक्ष पर प्रत्येक माउस झूठ और 70% इथेनॉल के एक निचोड़ बोतल का उपयोग कर के साथ त्वचा के नीचे गीला।
  4. मम्मियाँ या बाँझ संदंश और कठिन कटौती कैंची का प्रयोग, बस रिब पिंजरे के नीचे नीचे त्वचा काटकर अलग कर देना।
  5. नीचे स्प्रे70% इथेनॉल के साथ संपर्क में पेशी परत। तिल्ली पेशी परत (चित्रा 1 में खुला तीर सिर) के नीचे दिखाई जानी चाहिए।
  6. मम्मियाँ या बाँझ संदंश और ठीक कैंची का प्रयोग, तिल्ली प्रकट करने के लिए मांसपेशियों की परत काटकर अलग कर देना। धीरे संदंश के साथ तिल्ली हड़पने के लिए और ठीक कैंची का उपयोग तिल्ली संयोजी ऊतक आसपास से दूर कटौती की।
  7. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार बाँझ 1x पीबीएस युक्त ट्यूब में तिल्ली रखें।
  8. बाँझ 1x पीबीएस के साथ बाँझ पेट्री डिश आधा भरें। एक बाँझ 3 मिलीलीटर सिरिंज का फ्लैट अंत का उपयोग कर पेट्री डिश में एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से तिल्ली अलग कर देना।
  9. एक साफ बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करने में splenocyte निलंबन स्थानांतरण।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 335 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं।
  11. ब्लीच युक्त एक जाल फ्लास्क में सतह पर तैरनेवाला aspirate। एक उंगली के साथ ट्यूब flicking द्वारा या नीचे ट्यूब खींचकर सेल गोली ढीलाआगे और पीछे एक नालीदार सतह के साथ (जैसे, हवा का प्रवाह बीएससी में वेंट)।
  12. अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) lysis बफर के 1.5 मिलीलीटर जोड़कर Lyse लाल रक्त कोशिकाओं को एक तिल्ली करने के लिए (नुस्खा के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। वास्तव में 1 मिनट और 15 सेकंड के बाद, सेल को रोकने के लिए 1x पीबीएस के साथ ट्यूब भरें।
  13. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के रूप में कदम 6.10 में वर्णित है। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और छँटाई (युक्त बाँझ 1x पीबीएस 2% एफसीएस) (FACS) बफर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  14. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। इस के लिए, गिनती के लिए सेल निलंबन के दो aliquots ले। Trypan नीले रंग के एक बराबर मात्रा (0.04%, में DDH 2 हे 0.4% trypan नीले समाधान गिराए द्वारा बनाई गई) के लिए प्रत्येक सेल निलंबन के 15 μl जोड़ें। लोड hemocytometer के कक्ष में प्रत्येक सेल / Trypan नीले निलंबन के 15 μl (यानी, शीर्ष चैम्बर में से एक है, नीचे कक्ष में एक)।
  15. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, में सभी गैर-नीले रंग की कोशिकाओं की गिनतीप्रत्येक कक्ष में केंद्रीय ग्रिड के पांच बड़े वर्ग (चित्रा 2)। इस गणना को ले लो और 10 6 / एमएल में कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए 10 से विभाजित। चित्रा 2 में उदाहरण में, गिनती 5 चौकों में 215 कोशिकाओं है; इसलिए, सेल एकाग्रता 21.5 x 10 6 / एमएल है। सेल सांद्रता दो नमूनों से प्राप्त औसत।
  16. बीज 1 एक्स 10 6 धुंधला प्रवाह cytometry के लिए एक 96 अच्छी तरह गोल-नीचे की थाली में अच्छी तरह से प्रति / दाग कोशिकाओं। यह भी बेदाग और प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) नियंत्रण के लिए कोशिकाओं बीज के लिए सुनिश्चित करें। तालिका 2 में धुंधला पैनल प्रवाह cytometry सिफारिश देखें।
    नोट: निम्न चरणों के लिए, यह बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखने के लिए और पन्नी के साथ प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए जब fluorochromes मौजूद हैं सिफारिश की है। एक multichannel विंदुक प्रसंस्करण में तेजी लाने के लिए 96 अच्छी तरह से धुंधला प्लेटों में तरल पदार्थ वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल गोली जब परेशान करने के लिए सावधान नहीं किया जाCentrifuged थाली से सतह पर तैरनेवाला aspirating। धुंधला हो जाना भी FACS ट्यूबों में किया जा सकता है, तो सेंट्रीफ्यूज प्लेट एडाप्टर के साथ फिट नहीं है। इस बात पर सभी सेंट्रीफ्यूज कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 456 XG पर किया जाता है।
  17. थाली अपकेंद्रित्र और फिर FACS बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। एक धोने से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, FACS बफर के 200 μl जोड़ने प्लेट centrifuging, और फिर सतह पर तैरनेवाला श्वास द्वारा किया जाता है।
  18. 50 μl / अच्छी तरह से FACS विरोधी माउस CD16 / CD32 (शुद्ध एफसी ब्लॉक) (0.5 ग्राम) युक्त बफर जोड़कर अवरुद्ध कदम प्रदर्शन। 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित 1x पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  19. कोशिकाओं के लिए: 100 μl व्यवहार्यता डाई (1x पीबीएस में 1,000 फिक्स व्यवहार्यता डाई 1 पतला) जोड़ें। 30 मिनट के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस (फ्रिज में) पर दाग कोशिकाओं। जैसा कि ऊपर वर्णित FACS बफर में कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  20. एक दूसरे धोने के बाद, संबंधित कुओं अनुसार टी करने के लिए कोशिका की सतह एंटीबॉडी के 100 μl या tetramers जोड़नेओ धुंधला पैनल तालिका 2 में वर्णित है। 30 मिनट के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस (फ्रिज में) पर दाग कोशिकाओं। इस समय, यह भी एक सकारात्मक और FMO नियंत्रण धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: एकल सकारात्मक नियंत्रण के बारे में, यह या तो उपयोग splenocytes कि सीडी 4 एंटीबॉडी या वाणिज्यिक मुआवजा मोतियों की विभिन्न fluorochrome संस्करण है कि पैनल में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं के साथ दाग रहे हैं करने के लिए सिफारिश की है। इस धुंधला प्रक्रिया आयोजित करने से पहले, सभी FACS एंटीबॉडी परीक्षण अध्ययन में titrated किया जाना चाहिए धुंधला के लिए इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए।
  21. जैसा कि ऊपर वर्णित FACS बफर में दो बार कोशिकाओं को धो लें और फिर उन्हें 4% paraformaldehyde (16% paraformaldehyde शेयर DDH 2 हे में पतला) के 50 μl में resuspending और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए incubating द्वारा कोशिकाओं को ठीक। चेतावनी: paraformaldehyde विषैला होता है और केवल धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  22. कोशिकाओं मैं दो बार धोn FACS बफर के बीच में centrifuging। FACS बफर में कोशिकाओं Resuspend। रेफ्रिजरेटर अप करने के लिए तीन दिनों के लिए प्रकाश से सुरक्षित में अगले कदम या दुकान की कोशिकाओं के लिए आगे बढ़ें।
  23. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 1x Permeabilization / धो बफर (पेर्म / धो बफर) के 150 μl के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने, बीच में centrifuging। 9 (वी / वी) DDH 2 में ओ: पेर्म / धो बफर गिराए 1 से एक 10x स्टॉक से तैयार किया जाता है
  24. दूसरे धोने के बाद, पेर्म / धो बफर के 150 μl में कोशिकाओं resuspend और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  25. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को फिर से और फिर सतह पर तैरनेवाला aspirate। विरोधी IFN-γ युक्त और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते 1x पेर्म / धो बफर के 50 μl में Resuspend कोशिकाओं।
  26. कोशिकाओं के बीच में centrifuging, 1x पेर्म / धो बफर के साथ दो बार धोएं। FACS बफर के 250 μl में कोशिकाओं Resuspend और फिर FACS ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण।
  27. अधिग्रहण के प्रवाह cytometry के लिए एक प्रवाह cytomet का उपयोग करते हुए आगे बढ़ेंएर कि 2 टेबल 29 में वर्णित धुंधला पैनल में इस्तेमाल किया fluorochromes भेदभाव करने के लिए एक उचित लेजर विन्यास और फिल्टर सेट है। नमूना प्रति कम से कम 200,000 घटनाओं और मुआवजा नियंत्रण के लिए 10,000 घटनाओं लीजिए।
  28. मुआवजा मैट्रिक्स लागू करें और प्रवाह cytometric विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 30 डेटा का विश्लेषण।

पीक संक्रमण के समय पर प्लीहा और यकृत में बैक्टीरियल लोड 7. मापन

नोट: सभी चरणों का एक बीएससी के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक अन्यथा नोट।

  1. टीका लगाना चूहों रोगज़नक़ प्रक्रिया 4 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर के 2 एक्स 10 4 CFU के साथ आईपी।
  2. 3 दिन के बाद संक्रमण पर, बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों तैयार करते हैं, प्रत्येक युक्त 500 1x पीबीएस में ठंडा बाँझ 0.1% ट्राइटन X-100 के μl और 0.2 - 2 मिमी एसिड धोया बाँझ कांच के मोती - 1.5 से 0.3 ग्राम। प्रत्येक ट्यूब वजन।
    नोट: ग्लास मोती एसिड incu द्वारा धो रहे हैं1 घंटे के लिए एक चुंबकीय दोषी पर एक बीकर में 10% एसिटिक एसिड में बिनअ। ये मोती तो बड़े पैमाने पर एसिड को दूर करने के लिए DDH 2 हे के साथ धो रहे हैं, हवा सूखे हैं, और फिर उपयोग करने से पहले autoclaved।
  3. सीओ 2 जोखिम द्वारा चूहों euthanize।
  4. अंगों के विच्छेदन के लिए, एक विदारक बोर्ड पर अपनी पीठ पर पशु रखना और बोर्ड 25 जी सुइयों का उपयोग करने के लिए माउस का अंग पिन। 70% इथेनॉल के साथ गीला करके त्वचा कीटाणुरहित।
  5. बाँझ कठिन कटौती कैंची का प्रयोग, प्रत्येक घुटने की दिशा में और मध्य प्रत्येक कोहनी की ओर सीने से मध्य कमर से तो मध्य छाती को कमर से त्वचा में एक midline चीरा बनाने के लिए और। ब्लंट काटना और वापस त्वचा प्रतिबिंबित करती हैं, यह 25 जी सुइयों का उपयोग खोलने लगाए।
  6. 70% इथेनॉल के साथ यह गीला और फिर बाँझ ठीक कैंची पेरिटोनियल दीवार में एक midline चीरा बनाने का उपयोग करके पेशी परत कीटाणुरहित। संदंश के साथ जिफाएडा प्रक्रिया को पकड़ो। फिर, वही ठीक कैंची का प्रयोग, जिफाएडा प्रक्रिया से पेरिटोनियल दीवार में कटौती करनेlaterally प्रत्येक पक्ष पर एस एस, रिब पिंजरे के बाद, बस डायाफ्राम के नीचे जिगर प्रकट करते हैं।
  7. जिगर का एक ~ 100 मिलीग्राम टुकड़ा (सभी चूहों के लिए एक ही पालि का उपयोग करें) बाँझ कैंची का उपयोग कर बाहर कट और एक पूर्व तौला 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है।
  8. संदंश का प्रयोग धीरे पेरिटोनियल गुहा के बाईं ओर अंगों तरफ पुश करने के लिए तिल्ली कल्पना करने के लिए। धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ तिल्ली हड़पने और आसपास संयोजी ऊतक दूर काटने से पेरिटोनियल गुहा से इसे जारी।
  9. मोती युक्त पूर्व तौला 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में तिल्ली रखें। परिवहन एक रिसाव प्रूफ कंटेनर युक्त बर्फ में प्रयोगशाला में ऊतकों। एमजी में ऊतक वजन का निर्धारण करने के अंगों युक्त ट्यूबों को फिर से तौलना।
  10. 30 हर्ट्ज की आवृत्ति पर 3 मिनट के लिए एक मनका मिल homogenizer का उपयोग ट्यूबों के झटकों से ऊतकों homogenize।
    ध्यान दें: मनका मिल विधि homogenization के लिए पसंद किया जाता है यह प्रक्रिया के लिए उत्तरदायी है के रूप मेंनमूनों की एक बड़ी संख्या में गाते हैं और कम गंदगी और रोगज़नक़ के लिए संभावित जोखिम पैदा करता है। हालाँकि, स्वचालित homogenizers या 2 मिलीलीटर मैनुअल कांच ऊतक homogenizers एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है autoclaved।
  11. 1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 में homogenates की एक 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला से (लेकर undiluted से 10 -7 करने के लिए) को लेकर तैयार करें।
  12. एक BHI अगर प्लेट (दो प्रतियों में) एक बाँझ स्प्रेडर का उपयोग करने पर प्रत्येक पतला homogenate के 100 μl बिखरा हुआ है। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण प्लेटें और रातोंरात सेते हैं।
  13. प्लेटें कि 30 और 300 कालोनियों / थाली के बीच में होते हैं रखें, बाकी त्यागें। एक थाली पर कालोनियों की गिनती और डुप्लिकेट फैलता के लिए कालोनियों का मतलब संख्या का निर्धारण।
  14. CFU / निम्नलिखित समीकरण अनुसार मिलीग्राम की गणना:
    CFU / मिलीग्राम = CFU / homogenate में मिलीलीटर, तैयार homogenate के मिलीलीटर, ऊतक homogenized की मिलीग्राम वजन से विभाजित से गुणा किया।
    नोट: उदाहरण के लिए, अगर एक 30 कर्नल का मतलबonies, गणना के रूप में होगा इस प्रकार 10 -2 पतला जिगर का एक टुकड़ा है कि 120 मिलीग्राम 0.5 मिलीलीटर में homogenized गया था से तैयार homogenate के 100 μl चढ़ाना के बाद गिना गया:
    CFU / एमएल = 30 कालोनियों x 100 (कमजोर पड़ने कारक) / 0.1 मिलीलीटर की मात्रा (प्रसार) = 30,000 CFU / एमएल।
    CFU / मिलीग्राम = 30,000 CFU / एमएल x 0.5 मिलीलीटर homogenate / 120 मिलीग्राम ऊतक = 125 CFU / मिलीग्राम।

8. IFN-γ प्रतिक्रियाओं पर एल monocytogenes के प्रभाव सीडी 4 + और सीडी 8 + द्वारा प्रकोष्ठों

नोट: इस प्रक्रिया का वर्णन कैसे अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (~ 7 डी के बाद संक्रमण) दो तरीकों का उपयोग कर के चोटी के समय में काटा द्वारा प्लीहा सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं प्रेरक IFN-γ उत्पादन को मापने के लिए: (1) प्रवाह cytometry को मापने के लिए सीडी 4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं द्वारा IFN-गामा intracellular साइटोकाइन धुंधला द्वारा, और (2) एलिसा कुल IFN-γ splenocytes (सभी टी कोशिकाओं भी शामिल है) द्वारा उत्पादित के स्तर को मापने के लिए। प्रक्रियाबीएससी के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. रोगज़नक़ प्रक्रिया 4 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर के 2 एक्स 10 4 CFU के साथ आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों को संक्रमित।
  2. दिन 7 के बाद संक्रमण पर, चूहों सीओ द्वारा संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार 2 साँस लेना euthanize।
  3. तिल्ली (ऊपर वर्णित के रूप में) और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार बाँझ 1x पीबीएस युक्त ट्यूब में जगह काटना। एक रिसाव प्रूफ कंटेनर युक्त बर्फ में प्रयोगशाला के लिए ट्यूबों परिवहन।
  4. एक एकल कक्ष निलंबन में spleens प्रक्रिया, धारा 6 में वर्णित के रूप में लाल रक्त कोशिकाओं lyse, और फिर से युक्त 10% एफसीएस पूरा RPMI मीडिया में कोशिकाओं resuspend। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  5. IFN-γ प्रतिक्रियाओं की माप के लिए संस्कृतियों को निर्धारित करें। इस बांटना कोशिकाओं के लिए (4 x 10 6 में 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) के साथ मिलकर 24 अच्छी तरह प्लेटें और इतनी ही संख्या में (4 x 10 6 या 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) thawed गर्मी मारे एल monocytogenes के (5 प्रक्रिया में तैयार) । एक 37 कोशिकाओं स्थानांतरणसी इनक्यूबेटर °।
  6. ऊष्मायन के 20 घंटे के बाद, कुओं के लिए प्रोटीन परिवहन अवरोध के 0.66 μl / मिलीलीटर जोड़ने और incubations जारी है।
  7. चार घंटा के बाद, एक वाणिज्यिक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) किट का उपयोग कर 31 IFN-γ के स्तर की माप के लिए बाद में बीएससी करने के लिए स्थानांतरण की थाली और (-80 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और फ्रीज के 500 μl इकट्ठा। फिर एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा। 1x पीबीएस के साथ कुओं धो और एकत्र कोशिकाओं के साथ मिलकर इस धोने पूल।
  8. पर सीडी 4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं IFN-γ के लिए सेल सतह धुंधला और intracellular धुंधला धुंधला आचरण पैनल तालिका 3 में वर्णित का उपयोग को छोड़कर प्रक्रिया 6 में वर्णित है। प्रवाह अधिग्रहण कोशिकामापी (200,000 घटनाओं / नमूना संग्रह) और विश्लेषण सॉफ्टवेयर 30 प्रवाह cytometry का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण 29 के लिए आगे बढ़ें।

9. मापने समापन के लिए माउस जीवन रक्षा एल monocytogenes Infec के बादtion

नोट: यह प्रक्रिया रोगज़नक़ के संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ समापन करने के लिए माउस अस्तित्व पर एक एजेंट के प्रभाव के बाद संक्रमण का वर्णन है। इन सभी प्रक्रियाओं जानवरों की सुविधा में बीएससी में आयोजित की जाती हैं।

  1. प्रक्रिया 4 में वर्णित के रूप में इंजेक्षन चूहों एल monocytogenes के संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ आईपी इस 10 5 CFU (पुरुष के लिए) या 1.5 x 10 5 CFU (महिला के लिए), 31 होने के लिए निर्धारित किया गया था।
  2. दो बार नैदानिक ​​लक्षण के लिए दैनिक चूहों का पालन करें और इन संकेतों और एक प्रयोगशाला नोटबुक में पशु शरीर के वजन रिकॉर्ड है। चूहों euthanize अगर वे शरीर के वजन या लिस्टिरिओसिज़ के दो नैदानिक ​​लक्षण में 20% की हानि (सुस्ती, झालरदार फर, hunched आसन, कृत्रिम श्वास, सुस्त या धँसा आँखें) दिखा।
  3. 14 दिनों के बाद, सीओ 2 साँस लेना के माध्यम से चूहों जीवित euthanize।
  4. समय 32 के खिलाफ प्रत्येक समूह का प्रतिशत अस्तित्व साजिश रचने के द्वारा डेटा का कापलान-मायर भूखंडों तैयार करें।
    (चित्रा 7) द्वारा होता है।

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Representative Results

चित्रा 3 कुछ विशिष्ट रोगज़नक़ के 10 5 CFU के साथ 24 घंटा के बाद संक्रमण पर प्लीहा एन.के. और NKT कोशिकाओं में IFN-γ का धुंधला प्रवाह cytometry प्रस्तुत करता है। यह आंकड़ा भी तालिका 2 में वर्णित धुंधला पैनल के लिए gating रणनीति को दिखाता है। चित्रा 4 कुछ प्रतिनिधि डेटा है कि एक प्रयोग है जहाँ नर चूहों PPARα प्रतिपक्षी IS001 या वाहन पर नियंत्रण के साथ इलाज किया गया में प्राप्त किया गया, 10 5 CFU एल monocytogenes से संक्रमित पता चलता है, और उसके बाद 24 घंटे के बाद एन.के. और NKT कोशिकाओं में IFN-γ के लिए विश्लेषण । यह आंकड़ा पता चलता है कि IS001 के साथ इलाज के रोगज़नक़ के साथ संक्रमण के बाद बढ़ाया NKT कोशिकाओं द्वारा IFN-γ प्रतिक्रियाओं, लेकिन नहीं एन.के. कोशिकाओं। चित्रा 5 फिर से उत्तेजना पूर्व vivo गर्मी मारे गए फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ के बाद 7 दिनों के बाद संक्रमण से कम में प्लीहा सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं IFN-γ के लिए प्रतिनिधि धुंधला से पता चलताthogen। यह आंकड़ा भी तालिका 3 में वर्णित धुंधला पैनल के लिए gating रणनीति से पता चलता है। चित्रा 6 प्रतिनिधि डेटा है कि, एक प्रयोग है जहाँ नर चूहों PPARα प्रतिपक्षी IS001 या वाहन पर नियंत्रण के साथ दैनिक इलाज किया गया में प्राप्त किया गया एल monocytogenes की एक sublethal खुराक से संक्रमित है, और 7 दिनों के बाद संक्रमण पर विश्लेषण किया पता चलता है। इस प्रयोग से पता चलता है कि IS001 के साथ इलाज के लिए बढ़ाया दोनों सीडी 4 + और सीडी 8 + लिम्फोसाइटों द्वारा IFN-γ हिमायती हैं। चित्रा 7 एक अध्ययन है कि रोगज़नक़ के संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ संक्रमण के बाद समापन करने के लिए माउस अस्तित्व पर PPARα प्रतिपक्षी IS001 के प्रभाव की जांच से प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है। साजिश रची समय के बाद संक्रमण के खिलाफ चूहों का प्रतिशत अस्तित्व है। यह आंकड़ा पता चलता है कि IS001 के साथ इलाज के समापन के लिए नर चूहों के अस्तित्व में वृद्धि हुई। एक साथ इन डेटा वर्णन कैसे इस मॉडल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकताविवो में और IFN-γ प्रतिक्रियाओं पर नई दवाओं या उपचार के प्रभाव का पता लगाने के लिए कि कैसे इन प्रतिरक्षा परिवर्तन के संक्रमण से पशु अस्तित्व को प्रभावित।

आकृति 1
चित्रा 1. संक्रमित चूहों से Spleens विदारक। तस्वीरों की इस श्रृंखला में एक मृत चूहे से तिल्ली काटना करने के लिए कैसे पता चलता है। (क) अपनी सही पक्ष पर माउस झूठ और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा के नीचे स्प्रे। (ख) मम्मियाँ या बाँझ संदंश और कठिन कटौती कैंची का प्रयोग, बस रिब पिंजरे के नीचे नीचे त्वचा काटकर अलग कर देना। (ग) 70% इथेनॉल के साथ संपर्क में पेशी परत नीचे स्प्रे। तिल्ली पेशी परत (खुला तीर सिर) के नीचे दिखाई जानी चाहिए। (घ) मम्मियाँ या बाँझ संदंश और ठीक कैंची का प्रयोग, मांसपेशियों परत काटकर अलग कर देना तिल्ली प्रकट करते हैं। (ई) धीरे संदंश और यू के साथ तिल्ली हड़पनेएसई ठीक कैंची संयोजी ऊतक आसपास से दूर तिल्ली कटौती करने के लिए। (च) एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार बाँझ 1x पीबीएस युक्त ट्यूब में तिल्ली रखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. गिनती एक hemocytometer का उपयोग Splenocytes। (क) hemocytometer के केंद्रीय ग्रिड से पता चलता है। (ख) केन्द्रीय ग्रिड है कि 25 बड़े चौराहों (है कि प्रत्येक 16 छोटे वर्गों के होते हैं) शामिल हैं के एक बढ़े हुए दृश्य दिखाता है। पांच बड़े गिनती के लिए इस्तेमाल किया चौकों ग्रे (4 कोने चौकों के साथ साथ केंद्रीय ग्रिड में केंद्र वर्ग) में डाला जाता है। (ग) बड़े ग्रे वर्गों में से एक के एक बढ़े हुए दृश्य दिखाता है। 10 6 / एमएल, पहली गणना में सेल की मात्रा निर्धारित करने के लिएपांच बड़े ग्रे वर्गों के भीतर सभी व्यवहार्य कोशिकाओं। दिखाए गए उदाहरण में, यह गिनती 215 जब गिनती, केवल उन है कि सही और ग्रिड के तल पर डबल लाइनों को छू रहे हैं सहित स्पष्ट (गैर नीला) कोशिकाओं के सभी, गिनती करने के लिए सुनिश्चित करें। कोशिकाओं को छोड़ दिया और ग्रिड के शीर्ष पर डबल लाइनों को छूने भरोसा मत करो। कुल पांच वर्ग गिनती लो और 10 6 / एमएल में कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए 10 से विभाजित। उदाहरण के लिए, 215 10 से विभाजित 21.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल है। ध्यान दें कि इन गणनाओं केवल यदि आप बड़े वर्ग के 5 भरोसा कर रहे हैं के रूप में प्रकाश डाला काम करते हैं और अपने कोशिकाओं 1 पतला trypan नीले रंग में 1। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
IFN- की जांच के लिए चित्रा 3. gating रणनीतिएन.के. और NKT कोशिकाओं में γ उत्पादन। एसएससी-एक भूखंड से एफएससी-A पर लिम्फोसाइट पर पहले गेट। तब उन घटनाओं है कि एफएससी-एच / एफएससी-एक भूखंड पर विकर्ण पर कर रहे हैं पर गेट। ये singlets हैं। फिर लाइव (AmCyan -) पर गेट और सीडी 8 - कोशिकाओं। तब TCRβ के खिलाफ टेट्रामर धुंधला साजिश है। NKT कोशिकाओं डबल सकारात्मक आबादी के भीतर हैं और एन.के. कोशिकाओं डबल नकारात्मक आबादी के भीतर हैं। गेट डबल सकारात्मक कोशिकाओं पर, और साजिश NKp46 एफएससी बनाम। NKp46 नकारात्मक आबादी है, जो NKT कोशिकाओं रहे हैं पर गेट (इस फाटक एन.के. सेल साजिश से दो आबादी में विभाजन के बिंदु को खोजने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है)। TCRβ - - NKp46 + आबादी एन.के. कोशिकाओं टेट्रामर हैं। एन.के. और NKT सेल फाटक के भीतर, IFN-γ + पीई चैनल में कोशिकाओं FMO नियंत्रण पर आधारित एक गेट की स्थापना के बाद पहचाने जाते हैं। फिर से लॉगिन करने के लिएयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि डेटा 24 घंटा के बाद संक्रमण पर IFN-γ + एन.के. और NKT कोशिकाओं की आवृत्तियों के लिए प्राप्त किया। इस प्रयोग में, पुरुष C57BL / 6J चूहों (एन = 3 - 4 / समूह) 10 5 एल के CFU monocytogenes से संक्रमित आईपी थे या संयुक्त राष्ट्र संक्रमित छोड़ दिया गया। चूहे भी दवा IS001 या वाहन (0.5% carboxymethyl सेल्यूलोज) टीका और बाद में 12 घंटा के एक ही समय में दिलाई गई। टीका के बाद चौबीस घंटे, चूहों euthanized थे और spleens हटा दिया गया है और व्यक्तिगत रूप से संसाधित और प्रवाह cytometry के लिए दाग रहे थे। दिखाया IFN-γ + एन.के. में कोशिकाओं के SEM आवृत्ति ± मतलब हैं (क) या NKT सेल फाटकों (ख) एक वाहन या नशीली दवाओं के साथ इलाज के बाद IS001 असंक्रमित या संक्रमित चूहों में। * इंगितदो पूंछ टी परीक्षण द्वारा वाहन पर नियंत्रण से एसए अंतर (पी <0.05)। डेटा इम्यूनोलॉजी के जर्नल (मात्रा 195, पीपी। 5189-5202, 2015) से अनुमति के साथ 31 से फिर से मुद्रित कर रहे हैं। कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. CD4 और CD8 कोशिकाओं में IFN-γ उत्पादन की जांच के लिए gating रणनीति। एसएससी-ए भूखंडों द्वारा एफएससी-A पर लिम्फोसाइट पर पहले गेट। तब उन घटनाओं है कि एफएससी-एच / एफएससी-एक भूखंड पर विकर्ण पर कर रहे हैं पर गेट। ये singlets हैं। इस फाटक के भीतर, लाइव (AmCyan -) पर गेट CD45 + कोशिकाओं। तो फिर या तो सीडी 8 + या सीडी 4 + आबादी पर गेट। प्रत्येक गेट के भीतर, IFN-γ +पीई चैनल में कोशिकाओं FMO नियंत्रण करने के लिए धुंधला की तुलना द्वारा पहचाने जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. प्रतिनिधि डेटा एल monocytogenes के साथ 7 दिनों के बाद संक्रमण (EGD तनाव) में IFN-γ + CD4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की आवृत्तियों के लिए प्राप्त किया। इस प्रयोग में, पुरुष C57BL / 6J चूहों 2 एक्स 10 4 CFU एल monocytogenes (एन = 7 / समूह) के साथ आईपी संक्रमित थे या असंक्रमित (एन = 3 / समूह) को छोड़ दिया गया था। चूहे भी दवा IS001 या वाहन (0.5% carboxymethyl सेल्यूलोज) दिन में दो बार प्रारंभिक टीका के दिन पर दिलाई गई। सात दिन बाद, चूहों euthanized थे और spleens हटा दिया गया है और के लिए व्यक्तिगत रूप प्रोसेस किया गयाकोशिका संवर्धन। Splenocyte mononuclear कोशिकाओं में प्रोटीन परिवहन के साथ गर्मी की मौत हो एल monocytogenes संस्कृति के अंतिम 4 घंटे के लिए जोड़ा अवरोध करनेवाला के साथ 24 घंटे के लिए प्रेरित किया गया। कोशिकाओं तो प्रवाह cytometry के लिए दाग रहे थे। दिखाया IFN-γ + एक वाहन (0.5% carboxymethyl सेल्यूलोज) के साथ उपचार के बाद में सीडी 4 + (क) या सीडी 8 + सेल (ख) फाटकों असंक्रमित या संक्रमित चूहों में कोशिकाओं या दवा IS001 के SEM आवृत्ति ± मतलब हैं। * के रूप में दो पूंछ टी परीक्षण द्वारा निर्धारित वाहन पर नियंत्रण समकक्ष से एक अंतर (पी <0.05) इंगित करता है। डेटा इम्यूनोलॉजी के जर्नल (मात्रा 195, पीपी। 5189-5202, 2015) कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन से अनुमति के साथ 31 से फिर से मुद्रित कर रहे हैं, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।


चित्रा 7. प्रतिनिधि डेटा एक प्रयोग है कि एल monocytogenes के साथ पुरुष C57BL / 6J चूहों (EGD तनाव) के संक्रमण के बाद समापन के लिए माउस अस्तित्व पर एक PPARα विरोधी 1S001 के प्रभाव की तुलना के दौरान प्राप्त की। इस प्रयोग में, पुरुष C57BL / 6J चूहों (एन = 10 चूहों / समूह) एल monocytogenes के रोगज़नक़ के संशोधित एलडी 50 खुराक (10 5 CFU) से संक्रमित आईपी थे। चूहे भी दवा IS001 या वाहन (0.5% carboxymethyl सेल्यूलोज) दिन में दो बार प्रारंभिक टीका के दिन पर दिलाई गई। चूहे नैदानिक ​​लक्षण के लिए दैनिक पीछा किया गया था और अगर मानवीय समापन मिले थे euthanized थे। दिखाया समय * पर समापन के लिए चूहों का प्रतिशत अस्तित्व है इंगित करता है समूहों के बीच अस्तित्व में एक अंतर के रूप में लॉग-रैंक टेस्ट (पी <0.05) द्वारा निर्धारित की। डेटा 31 से फिर से मुद्रित कर रहे हैं जर्नल ओ से अनुमति के साथएफ इम्यूनोलॉजी (मात्रा 195, पीपी। 5189-5202, 2015)। कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: दिन संस्कृति के एक विभाज्य में CFU निर्धारण के लिए कुछ प्रतिनिधि गणना दिखाता है। इस उदाहरण में, दिन संस्कृति के एक विभाज्य लिया गया था और 1 पतला था: BHI मीडिया के साथ 1। इस पतला नमूना के आयुध डिपो के 600 0.84 होने के लिए निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, एक 100 μl विभाज्य CFU निर्धारण के लिए लिया गया था। यह नमूना BHI मीडिया के 900 μl (10 -1) के साथ पतला था और धोया और 1 मिलीलीटर BHI में resuspended किया गया था। इस नमूने के 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार किया गया था (10 -2 10 -9) और पतला नमूने BHI आगा पर चढ़ाया गयाआर प्लेट (केवल 10 -4 10 -9 करने के लिए मूल्यों को दिखाया जाता है)। अगले दिन कालोनियों गिना रहे थे। केवल वे ही लोग प्लेटें कि 30-300 के बीच कॉलोनी नंबर था गणना के लिए विचार किया गया (यानी, 10 -6 थाली, पीले रंग में प्रकाश डाला)। इस प्लेट (70) पर कालोनियों की संख्या तो पतला नमूने के CFU / एमएल पाने के लिए 0.1 (एमएल मात्रा में चढ़ाया) द्वारा विभाजित किया गया था। यह मान तो कमजोर पड़ने कारक (10 6) undiluted संस्कृति का CFU / एमएल पढ़ने प्राप्त करने से गुणा किया गया था। TMTC गिनती करने के लिए भी कई =।

सारणी 2
तालिका 2: एन.के. और NKT कोशिकाओं में IFN- की जांच के लिए γ धुंधला कक्ष। ध्यान दें कि या तो मुआवजा पैनल या सीडी 4 एंटीबॉडी क्लोन GK1.1 के विभिन्न संस्करणों के साथ fluorochrome दाग splenocytes में इस्तेमाल प्रवाह एंटीबॉडी के साथ दाग मोती एकल सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता।

टेबल तीन
तालिका 3: सीडी 4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं में IFN- की जांच के लिए γ धुंधला कक्ष। ध्यान दें कि या तो मुआवजा पैनल या सीडी 4 एंटीबॉडी क्लोन GK1.1 के विभिन्न संस्करणों के साथ fluorochrome दाग splenocytes में इस्तेमाल प्रवाह एंटीबॉडी के साथ दाग मोती एकल सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Discussion

यहाँ हम कैसे बाहर एक बुनियादी प्रयोगात्मक संक्रमण के साथ ले जाने के लिए एल के EGD तनाव पुरुष या महिला C57BL / 6J चूहों में 25 monocytogenes के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल विवो 31 में सहज और अनुकूली लिम्फोसाइट द्वारा IFN-γ उत्पादन पर एक उपन्यास छोटे अणु IS001 के प्रभाव का अध्ययन करने के उद्देश्य के लिए स्थापित किया गया था। बैक्टीरियल निकासी और अस्तित्व के बाद संक्रमण की निगरानी करके, अंतर्दृष्टि में कैसे IFN-γ में इन परिवर्तनों को मेजबान के संक्रमण को नियंत्रित करने की क्षमता पर असर पड़ा प्राप्त किया गया।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण विचार

अध्ययन के इस प्रकार के डिजाइन में एक महत्वपूर्ण विचार है कि एक प्रयोग के लिए पर्याप्त रूप से संचालित है और उचित रूप से नियंत्रित किया जा रहा है। संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में जैविक विभिन्नता के कारण (आंकड़े 4 और वहाँ 6), यह सिफारिश की है कि एन = 4 - 5 समूह प्रति चूहों प्रारंभिक प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यदि एकfter इन अध्ययनों के आंकड़ों में एक प्रवृत्ति है, लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर समूहों के बीच स्पष्ट है, एक शक्ति गणना के बाद पढ़ाई में आवश्यक सांख्यिकीय महत्व हासिल करने के लिए जानवरों की संख्या कम से कम निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। नियंत्रण के बारे में, यह प्रतिरक्षा अध्ययन और वाहन उपचार के प्रशासन के साथ जुड़े तनाव से उपचार के प्रभाव को अलग करने में मदद करने के लिए नियंत्रित करने के लिए आधारभूत IFN-γ प्रतिक्रियाओं के निर्धारण के लिए असंक्रमित नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार उपचार का समय है। चूंकि एल monocytogenes को सहज प्रतिक्रिया बहुत तेजी से होता है, यह सिफारिश की है कि प्रथम उपचार के दिन के लिए, या के रूप में, आदेश अभिकर्मक की कि चिकित्सकीय स्तर को सुनिश्चित करने में टीका एक ही समय में करने के लिए पहले से हासिल किया जा प्रायर पर प्रशासित किया सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा।

अभी तक एक और महत्वपूर्ण विचार रोगज़नक़ की खुराक infectio के लिए इस्तेमाल किया जा रहा हैएन। एक sublethal खुराक, जीवाणु लोड की माप के लिए सिफारिश की है, क्योंकि यह मौका है कि रोगजनक बैक्टीरिया की अधिक सटीक गणना के लिए अनुमति देता है, प्लीहा और यकृत के भीतर ध्यान केंद्रित किया जाएगा, बढ़ जाती है। एक sublethal खुराक भी अनुकूली लिम्फोसाइट द्वारा IFN-γ प्रतिक्रियाओं की गणना सुनिश्चित करने के लिए है कि जानवरों के चोटी के टी सेल विस्तार के समय से पहले लिस्टिरिओसिज़ का शिकार नहीं करते के लिए सिफारिश की है। इसके विपरीत, यह सिफारिश की है कि एक उच्च संक्रामक खुराक आदेश में इन कोशिकाओं द्वारा IFN-γ उत्पादन को अधिकतम करने के 24 घंटे में जल्दी एन.के. और NKT सेल प्रतिक्रिया की माप के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

शास्त्रीय एलडी 50 रोगज़नक़ की खुराक है कि चूहों के 50% मारक में यह परिणाम है। चूंकि मृत्यु हमारी संस्था में एक स्वीकार्य समापन बिंदु नहीं था और तब से लिस्टिरिओसिज़ के कई लक्षण भविष्यवाणी कर सकते हैं कि क्या एक जानवर एक संक्रमण का शिकार होने की संभावना है, हम अपने अध्ययन में एक समापन बिंदु के रूप में के बजाय नैदानिक ​​लक्षण के एक परिभाषित सूची मौत का इस्तेमाल किया। यूएसआईएनजी इस विधि है, यह निर्धारित किया गया था कि संशोधित एलडी 50 8 सप्ताह पुराने पुरुष के लिए 10 5 CFU और 1.5 x 10 5 से 8 सप्ताह पुराने महिला C57BL / 6J चूहों 31 के लिए CFU था। ये एलडी 50 खुराक (एन = कुल में 5 अध्ययन) कदम वार खुराक वृद्धि अध्ययन में समापन के लिए चूहों का प्रतिशत अस्तित्व को मापने कि प्रत्येक निहित समूह प्रति एन = 8 चूहों द्वारा निर्धारित किया गया है (जैसे, चूहों पहले 10,000 CFU से संक्रमित थे , तो 20,000 CFU, आदि) के साथ एक दूसरे बैच। Userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit: एलडी 50 गणना लॉग की एक प्रतिगमन साजिश (CFU) (एक्स अक्ष) प्रतिशत अस्तित्व मूल्यों (शाफ़्ट) (वेबसाइट के PROBIT बनाम से निर्धारित किया गया था /ProbitAnalysis.pdf)।

ध्यान दें कि संशोधित एलडी 50 खुराक हमारी प्रयोगशाला में निर्धारित एक और प्रयोगशाला में उस से अलग हो सकता है यहां तक कि जब एल monocytogenes की इसी तनाव के साथ चूहों को संक्रमित। इस परिवर्तनशीलता के भाग व्यक्तिपरक प्रकृति ओ करने के लिए संबंधित हो सकती हैएफ मौत के अधिक पूर्ण समापन बिंदु की तुलना में लिस्टिरिओसिज़ के नैदानिक ​​लक्षण नजर रखे। अतिरिक्त परिवर्तनशीलता जैसे माउस आहार या माइक्रोबायोटा या प्रयोगशालाओं के बीच inoculum की तैयारी में मतभेद के रूप में पर्यावरणीय कारकों में मतभेद से परिणाम कर सकते हैं। इस प्रकार, यह सिफारिश की है कि किसी भी अस्तित्व के अध्ययन पर तैयार करने से पहले, एक पायलट अध्ययन के रूप में प्रयोग किया जाता है इस प्रदर्शन किया जहां मादा चूहों (एन = 8 चूहों / समूह) 1.5 x 10 5 एल monocytogenes का एक ही तनाव की CFU से संक्रमित हैं अध्ययन और निगरानी लक्षण निर्धारित करने के लिए अगर यह खुराक वास्तव में समापन करने के लिए 50% अस्तित्व में परिणाम है। अगर अस्तित्व कम या 50% से अधिक इस CFU पर है, कदम वार खुराक वृद्धि या खुराक de-वृद्धि के अध्ययन के लिए जल्दी एलडी 50 खुराक पर संकीर्ण करने के लिए किया जा सकता है।

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार तनाव या संक्रमण अध्ययन के लिए इस्तेमाल चूहों के substrain है। इस प्रोटोकॉल सामान्य रूप से प्रयुक्त जन्मजात माउस तनाव C57BL / 6J के संक्रमण का वर्णन है। इस तनाव IFN-γ प्रतिक्रियाओं की माप के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, क्योंकि इस माउस एक Th1-प्रवण तनाव 33 माना जाता है और एक परिणाम के रूप में, अपेक्षाकृत एल के लिए प्रतिरोधी है संक्रमण (जैसे BALB / रूप Th2-प्रवण माउस उपभेदों की तुलना में monocytogenes ग) 34,35। अन्य माउस उपभेदों के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल विशेष तनाव के लिए रोगज़नक़ के संक्रामक खुराक के ज्ञान की आवश्यकता होगी। यह भी रूप में आदेश मुसीबत शूटिंग मॉडल की स्थापना में शामिल की मात्रा को कम करने के लिए इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक ही उम्र, लिंग के चूहों और विक्रेता का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। उदाहरण के लिए, C57BL / 6 चूहों एक विक्रेता (जैसे, C57BL / 6J) से आदेश दिया C67BL / 6 चूहों एक और विक्रेता (जैसे, C57BL / 6NTac), 36 से आदेश दिया की तुलना में आनुवंशिक मतभेद प्रदर्शन कर सकते हैं। इसके अलावा, आंतों माइक्रोबायोटा / 6 substrains विभिन्न विक्रेताओं, जो माउस के 37 में Th1 और Th17 प्रतिक्रियाओं के संतुलन को प्रभावित कर सकते हैं से प्राप्त C57BL बीच अलग है।

ove_title "> तकनीक के लिए संभावित संशोधनों

चूहे सबसे अधिक आईपी टीका या नसों के रूप में मानव में संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग है, जो जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से होने का विरोध कर रहे हैं। मौखिक संक्रमण को कम आम क्योंकि एल monocytogenes के मानक उपभेदों निकम्मेपन से चूहों 38 की आंतों उपकला को संक्रमित कर रहे हैं। यह मानव ई cadherin कि listerial आक्रमण प्रोटीन से ई cadherin की मान्यता के नुकसान में परिणाम से माउस ई cadherin के अनुक्रम में एक भी अमीनो एसिड परिवर्तन है क्योंकि वहाँ internalin एक (Inia) 39, है। इस बाधा को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने चूहों कि मानव ई cadherin प्रोटीन के लिए ट्रांसजेनिक हैं या लिस्टेरिया कि Inia (Inia mut) के लिए है कि गुम्मट EGD के रूप में ही आत्मीयता के साथ माउस ई cadherin को बांध का एक उत्परिवर्तित अनुक्रम व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है का उपयोग करें मानव ई cadherin 40। इस प्रकार, इस तकनीक का एक संभावित संशोधन मौखिक मार्ग के माध्यम से चूहों को संक्रमित करने के लिए है। पाठक एक और जौव प्रकाशन है कि मौखिक टीका तरीकों 38 का वर्णन करने के लिए जाना जाता है। ध्यान दें कि संक्रमण के मोड में फेरबदल संक्रामक खुराक के रूप में अच्छी तरह से रोगज़नक़ के प्रचार-प्रसार के कैनेटीक्स को प्रभावित करेगा।

इस प्रोटोकॉल गर्मी की मौत हो लिस्टेरिया का उपयोग कर सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं द्वारा IFN-γ उत्पादन प्रकाश में लाना करने का वर्णन है। क्योंकि इस प्रतिजन सस्ती है गर्मी की मौत हो एल monocytogenes, हमारे अध्ययन में एक प्रोत्साहन के रूप में चुना गया था और क्योंकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से रोगज़नक़ के सीडी 4 + टी सेल प्रतिक्रिया में दिलचस्पी थी। एक सीमा है कि गर्मी की मौत हो बैक्टीरिया कुशलतापूर्वक या तो इन विट्रो 41 में या विवो 42,43 संक्रमण में प्रधानमंत्री सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया नहीं है। इस प्रकार, सीडी 8 + टी सेल IFN-γ उत्पादन है कि हम संक्रमण के चरम पर काटा splenocytes से मनाया (यानी, चित्रा 6) होने की संभावना अवशिष्ट के जवाब में हैजीवित बैक्टीरिया splenocyte संस्कृतियों में मौजूद या साइटोकाइन प्रेरित साइटोकाइन का एक परिणाम के रूप में हासिल किया गया था जारी कर 41। के रूप में एक विकल्प गर्मी मारे गए लिस्टेरिया, एक भी listerial प्रोटीन पर epitopes एन्कोडिंग पेप्टाइड्स के लिए टी कोशिकाओं को प्रकाश में लाने से IFN-γ प्रतिक्रियाओं पूर्व vivo बटोर सकता है। दरअसल, immunodominant MHC वर्ग द्वितीय-प्रतिबंधित listeriolysin हे और P60 hydrolase के लिए epitopes और C57BL / 6 और BALB / ग चूहों और immunodominant MHC वर्ग मैं epitopes के लिए वर्णित किया गया है BALB / सी 44 के लिए वर्णित किया गया है। अभी तक एक और दृष्टिकोण एल monocytogenes के तनाव है कि आदेश में मौजूदा MHC वर्ग मैं और MHC वर्ग द्वितीय टेट्रामर अभिकर्मकों विशिष्ट प्रतिजन गणना करने के लिए का लाभ लेने के लिए इस तरह के ovalbumin या वायरल एंटीजन के रूप में मॉडल एंटीजन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है के साथ चूहों को संक्रमित करने के लिए है संक्रमित चूहों 45,46 में टी कोशिकाओं।

प्रोटोकॉल की अन्य सीमाओं

इस मॉडल की एक और सीमा यह है कि ओ हैतिल्ली में प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा nly उपायों IFN-γ उत्पादन। Tetramers के उपयोग के प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं (के ovalbumin व्यक्त एल monocytogenes के वेरिएंट), यहाँ वर्णित धुंधला पैनलों प्रवाह cytometry गणना करने के लिए इसके अलावा आसानी से ऐसे TNF या आईएल -2 के रूप में या अन्य साइटोकिन्स के उत्पादन को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है प्रेरक अणुओं है कि सीडी 8 टी सेल या ऐसे perforin या granzyme बी इसके अलावा के रूप में रोगज़नक़ के एन.के. की मध्यस्थता हत्या में भाग लेते हैं, इस प्रोटोकॉल भी IFN-γ जिगर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

भविष्य के अनुप्रयोगों

एक बार जब इस प्रोटोकॉल में महारत हासिल है, यह विभिन्न एजेंटों या Th1 और सेलुलर प्रतिरक्षा पर जीनों का प्रभाव स्क्रीन करने के लिए विवो मॉडल में एक सरल रूप में सेवा कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

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References

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संक्रमण अंक 117, बैक्टीरिया संक्रमण मॉडल चूहों cytometry इंटरफेरॉन γ प्रतिक्रिया प्रवाह
साथ प्रायोगिक संक्रमण<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; का अध्ययन होस्ट इंटरफेरॉन-γ जवाब के लिए एक मॉडल के रूप
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Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

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