Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Eksperimentel infektion med Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man pode C57BL / 6J mus med EGD-stamme af Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) og måle interferon-γ (IFN-γ) responser ved naturlig dræber (NK) celler, naturlige dræber T (NKT) celler, og adaptive T-lymfocytter efter infektion. Denne protokol beskrives også hvordan man fører overlevelse hos mus efter infektion med en modificeret LD50 dosis af patogenet.

Abstract

L. monocytogenes er en grampositiv bakterie, der er årsag til fødevarebårne sygdomme hos mennesker. Eksperimentel infektion af mus med dette patogen har været yderst informativ om den rolle, medfødte og adaptive immunceller og specifikke cytokiner i værten immunitet mod intracellulære patogener. Produktion af IFN-γ med medfødte celler under subletale infektion med L. monocytogenes er vigtig for aktivering makrofager og tidlig kontrol af patogenet 1-3. Desuden IFN-γ-produktion af adaptive hukommelse lymfocytter er vigtigt for priming aktiveringen af medfødte celler efter reinfektion 4. Den L. monocytogenes infektion model tjener således som et godt værktøj til at undersøge, om nye behandlingsformer, der er designet til at øge IFN-γ produktion har en indvirkning på IFN-γ reaktioner in vivo og har produktive biologiske effekter såsom øget bakteriel clearance eller forbedre mus overlevelse frainfektion. Beskrevet her er en grundlæggende protokol for hvordan man fører intraperitoneale infektioner af C57BL / 6J mus med EGD-stamme af L. monocytogenes og måle IFN-γ-produktion af NK-celler, NKT-celler og adaptive lymfocytter ved flowcytometri. Derudover er procedurer beskrevet til: (1) vokse og forberede bakterierne til podning, (2) måling af bakteriel belastning i milten og leveren, og (3) at måle dyr overlevelse til endepunkter. Repræsentative data er også tilvejebragt for at illustrere, hvordan denne infektion model kan anvendes til at teste virkningen af specifikke midler på IFN-y reaktioner på L. monocytogenes og overlevelsen af mus fra denne infektion.

Introduction

IFN-γ er et cytokin, der er afgørende for mediering af immunitet mod intracellulære patogener og til at styre tumor 5 vækst. Betydningen af dette cytokin i bakteriel resistens er tydeligt i den iagttagelse, at mennesker med mutationer i IFN-γ-signalvejen er stærkt modtagelige for infektion med mycobakterier og salmonella 6. Tilsvarende mus defekte i enten IFN-γ eller IFN-γ-receptor udviser defekter i resistens over for mycobakterier 7-9 og andre intracellulære patogener, herunder L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, og visse vira 11. Foruden bekæmper patogener, IFN-γ spiller en afgørende rolle i vært-forsvar mod tumorer 14. Selvom højere produktion af IFN-γ er gavnlig i forbindelse med infektion eller cancer, har forlænget produktion af dette cytokin blevet forbundet to udvikling af systemisk autoimmunitet 15-17 og accelerationen af type I-diabetes i den ikke-overvægtige diabetiske musemodel 18.

De vigtigste kilder til IFN-γ omfatter NK-celler, NKT-celler, γδ T-celler, T hjælper 1 (Th1) -celler, og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) 5,19,20. IFN-γ forbedrer både medfødte og adaptive immunitet ved: (1) opregulering hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II udtryk, (2) at øge ekspressionen af ​​co-stimulerende molekyler på antigen-præsenterende celler, (3) at øge makrofag fagocytose og produktionen af pro-inflammatoriske cytokiner og mikrobicide faktorer (f.eks nitrogenoxid og reaktive oxygenarter), (4) fremme differentieringen af naive CD4 + T celler til Th1-effektorceller, (5) fremme antistof klasseskift til immunglobulin ( Ig) 2a og IgG3 (i mus), (6) induktion af produktion af kemokiner at rekruttere immunceller til steder med infection, og (7) forbedring NK celle og CTL-reaktioner 5,19. I betragtning af den afgørende betydning af IFN-γ i værtens reaktion på patogener og tumorer, har rekombinant IFN-γ blevet testet som en behandling for forskellige infektioner og maligniteter (anmeldt i 19). Men fordi systemisk indgivelse af IFN-γ eller Th1 fremme cytokin interleukin-12 (IL-12) er forbundet med bivirkninger og dosis-relateret toksicitet 19,21, der er interesse for at udvikle alternative strategier til at øge IFN-γ-produktion ved immunceller. Udvikling af nye biologiske lægemidler og små molekyler kræver in vivo screening-værktøjer til at teste, om sådanne midler øger IFN-γ produktion i et immunrespons, og hvorvidt dette udmønter sig i meningsfulde biologiske effekter såsom stigninger i dyr overlevelse.

Eksperimentel infektion af mus med de gram-positiv bakterie L. monocytogenes har været en medvirkende model fordechifrering rolle IFN-γ i vært-immunitet mod intracellulære patogener 1,22. Infektion af mus med patogenet intravenøst ​​eller intraperitonealt (ip) fører til hurtig udbredelse af bakterier til milt og lever, hvor de bliver internaliseret af residente makrofager og hepatocytter med peak bakterielle belastninger i milten forekommer mellem 3 og 4 dage post infektion 1,3,22. Produktion af IFN-γ af NK-celler er vigtig for makrofagaktivering og tidlig resistens mod patogenet 3; dog ved høje infektiøse doser, kan produktion af IFN-γ også være skadelig for patogen feltet 23. NKT-celler er også en kilde til IFN-γ i milt og lever under tidlig kontrol af patogener 2,24 og denne produktion er blevet vist at forstærke IFN-γ-produktion af andre celletyper, herunder NK-celler 2. På den anden side, senere virkende adaptive T-lymfocytter, CD8 + T-celler i deltaCULAR, er vigtige for at mægle clearance af patogenet og yde beskyttelse mod reinfektion 1,4,22.

Denne infektion model har været attraktivt for forskere for en række årsager (revideret i 1). Første, infektion med patogenet er meget reproducerbar og inducerer et stærkt Th1 og cellulært immunrespons. For det andet under subletal infektion, er bakteriel belastning koncentreres i leveren og milten, hvor den let kan måles. For det tredje kan patogenet håndteres sikkert under biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) betingelser. For det fjerde organismen og den immunrespons, som det genererer er blevet grundigt karakteriseret. Endelig har en række mutante og genetisk modificerede stammer blevet udviklet, som er tilgængelige til brug.

Beskrevet her er en grundlæggende protokol for podning af C57BL / 6J mus med EGD stamme af L. monocytogenes 25 og til måling af IFN - γ rebesvarelser fra NK, NKT, og adaptive lymfocytter efter infektion. Der beskrives også, hvordan man måler bakteriel belastning i milten og leveren efter subletale infektion og til at udføre overlevelsesstudier efter infektion med en modificeret LD50 dosis af patogenet. Endelig er repræsentative data vist, hvordan denne protokol kan anvendes til at screene virkningen af nye behandlinger på IFN-y-responser og muse overlevelse fra L. monocytogenes infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sikkerhed Statement

Denne protokol beskriver infektion af mus med levende L. monocytogenes. Den patogen håndteres sikkert under BSL2 betingelser af uddannet personale, der ikke er immunkompromitterede. Immunkompromitterede mennesker omfatter gravide kvinder, ældre og personer, der er hiv-smittede eller har kroniske lidelser, der kræver behandling med immunsuppressiv behandling. Personale bør don en beskyttende kittel eller kjole, handsker, maske, og øjenbeskyttelse ved håndtering inficerede prøver. Den her beskrevne arbejde blev udført under BSL2 betingelser et certifikat (# 32.876), som blev udstedt af University Health Network (UHN) biosikkerhed kontor. Slagtekroppe fra inficerede mus eller ubrugte væv var dobbelt-sække og bortskaffes i biologisk farligt affald. Bure fra inficerede mus blev også dekontamineres ved autoklavering.

Etik Statement

Mus blev opretholdt og inficeret i en Quarantine værelse inden UHN dyrefaciliteter og blev passet i overensstemmelse med de retningslinjer, som den canadiske Rådet om Animal Care. Alle procedurer på mus blev udført under anvendelse dyr protokol # 3214, der blev godkendt af UHN dyr pleje udvalg. På grund af etiske overvejelser, blev døden ikke som et slutpunkt for overlevelse studier. Den modificerede LD 50 dosis rapporteret her for L. monocytogenes infektion blev bestemt til at være den dosis, ved hvilken 50% af musene nåede specifikke endepunkter, som bestod af et tab på 20% i kropsvægt eller viser mindst to af følgende kliniske tegn: sløvhed, pjusket pels, foroverbøjet kropsholdning, besværet vejrtrækning, sløve eller indsunkne øjne. Mus blev aflivet, da de nåede endpoints via udsættelse for kuldioxid (CO 2) i henhold til UHN facility retningslinjer.

1. Forberedelse af glycerol Bestande Langsigtet opbevaring

BEMÆRK: Denne procedure beskriver, hvordan glycerol lagre afEGD-stamme af L. monocytogenes fremstilles ud fra en original glycerolstamme. Trin, der har potentiale til at generere aerosoler bør udføres inden for en certificeret biosikkerhed kabinet (BSC).

  1. Forbered Brain Heart Infusion (BHI) agarplader for bakterievækst. For denne tilføjelse 3,8% (vægt / volumen) BHI-bouillon og 1,5% (w / v) agar til dobbelt destilleret H2O (Hedeselskabet 2 O). Autoklave væske. Når agaren køler til 50 ° C, dispensere væske ind i bakterielle petriskåle (25 ml / skål) og lad pladerne tørre (udækket) i BSC i 1 time.
    BEMÆRK: Transfer BHI agar i en 50 ° C vandbad efter autoklavering for at undgå størkning før hælde plader. Opbevar BHI-plader ved 4 ° C på hovedet (med media side på toppen) indtil den er klar til brug.
  2. Forbered flydende BHI medie. Til dette, bland 3,8% (vægt / volumen) BHI-bouillon i Hedeselskabet 2 O. Autoklave.
  3. Fjern frossen glycerol status over L. monocytogenes EGD stammen fra -80 ° C fryser og optøning til stuetemperatur.
  4. Dyp en steril pipettespids i den optøede glycerolstamme og straks streak spidsen frem og tilbage over en sektion af en BHI plade. Dette er den primære streak.
  5. Drej pladen ved 90 ° C og under anvendelse af separate pipettespidser, trække gennem den første streak og sprede det til det næste ¼ af pladen (dette er den sekundære streak). Gentag en gang mere for at gøre den tertiære streak.
  6. Vend pladen på hovedet og inkuberes ved 37 ° C natten over. Enkelte ensartede kolonier bør indhentes i det sidste sæt striber og synlig mellem 16 og 24 timer.
  7. Dispensere 10 ml steril BHI-bouillon i en steril udluftet 50 ml rør. Pick en koloni af L. monocytogenes fra pladen under anvendelse af en steril pipettespids og inokulering bouillon. Inkuber kulturen i en 37 ° C orbital rysteinkubator natten over, eller indtil OD600 = 1,0 med indstillinger ved 225 omdrejninger pr minut (rpm).
    BEMÆRK: Glas eller engangs plaSTIC Erlenmeyer-kolber kan også anvendes til dyrkning af bakterier. Uanset hvilken type beholder anvendes, sikre, at det er sterilt, udluftet og at mængden af ​​kulturen ikke overstiger 20% af det samlede volumen af ​​beholderen for at sikre en passende beluftning af bakterierne.
  8. Forbered glycerolstamopløsninger ved blanding steril 100% glycerol med natten over bakterielle flydende kultur ved et 1: 1 forhold. Fordel den bakterielle / glycerol blandingen i 2 ml kryogene hætteglas (500 pi / hætteglas) og overføre hætteglas til -80 ° C fryser til opbevaring.
    BEMÆRK: Bead stock metoder kan også anvendes i stedet for glycerol-stamopløsninger til at gemme bakterier. Ved denne fremgangsmåde er porøse mikroperler inokuleret med en renkultur af L. monocytogenes og opbevares ved -80 ° C. Hver perle kan anvendes til at inokulere en frisk kultur efter behov. Se materialer liste for yderligere information.

2. Bestemmelse af Growth Curve af L. monocytogenes i Day Kultur BEMÆRK: Denne procedure beskriver, hvordan at generere vækstkurven for Listeria monocytogenes, der bruges til at estimere kolonidannende enheder (CFU) for infektion studier. Alle trin, der har potentiale til at generere aerosoler bør udføres inden for en certificeret BSC.

  1. Tag 100 pi overnatskultur genererede i trin 1.7 til 10 ml BHI medie i en ventileret 50 ml rør og vokse ved 37 ° C i en rysteinkubator (225 rpm, vippes ved 45 ° vinkel). Brug en ikke-podede rør som en kontrol.
  2. Tag 0,5 ml prøver af kulturen hver time (1, 2, 3, 4, 5, 6 timer, osv.). Fortynd hver alikvot 1: 1 (v / v) med BHI medie i en plast kuvette. Pipettere op og ned for at blande. Mål den optiske densitet (OD) ved 600 nm (OD600) ved anvendelse af et spektrometer. Fortsæt dyrkning bakterier indtil OD600 = 1.
  3. På samme tid, tage en 100 pi prøve af kulturen og fortyndes med 900 pi BHI medier i en steril 1,5 ml MICRocentrifuge rør (dette er den 10 -1 fortynding). Centrifugeres bakterierne ved 6.000 xg i 5 min, og aspireres supernatanten.
  4. Vask bakterier to gange ved at resuspendere pellet i 1 ml BHI medium, centrifugering i 5 minutter ved 6.000 x g, og derefter opsugning af supernatanten. Pellet resuspenderes i 1 ml BHI medie. Forbered en 10 ganges fortynding serie af denne prøve i BHI medier (10 -2 til 10 -9). Spred 100 pi af hver fortyndingsmiddel på separate BHI-agarplader. Pladerne inkuberes natten over ved 37 ° C i en inkubator.
  5. Den næste dag, bryde plader, der har mellem 30 - 300 kolonier. Kassér resten. Tæl kolonier på disse plader. Tabel 1 viser et eksempel på tællinger opnået i en prøve, der blev taget, da OD600 = 0,84. I dette eksempel en af pladerne (dvs. 10 -6 fortynding) havde kolonitællinger mellem 30 - 300 og blev anvendt til CFU / ml beregning.
    BEMÆRK: Plader med størreend 300 kolonier ikke anvendes, da overbelægning kan hæmme bakterievækst og også gør det vanskeligt at skelne og optælle individuelle kolonier. Plader med tal <30, er heller ikke anvendes, fordi små fejl i fortynding teknik eller tilstedeværelsen af ​​forurenende stoffer kan have en stor indflydelse på præcisionen af ​​tællinger i den lave ende af intervallet.
  6. Divider antallet af kolonier af volumen forgyldt og multiplicerer med fortyndingsfaktoren for at opnå den CFU / ml værdi for en bestemt fortynding. I eksemplet i tabel 1, tællingen ved 10 -6 fortynding var 70. Divider denne værdi med 0,1 ml for at få den CFU / ml værdi for den fortyndede kultur. Derefter multipliceres værdien med fortyndingsfaktoren (10 6) for at opnå CFU / ml-værdi af den ufortyndede kultur (7,0 x 10 8).
  7. Plot OD600 (y-akse) versus tid i timer (x-aksen) for at identificere den logaritmiske vækstfase 26.
    BEMÆRK: Denne vækst Curve tilvejebringer et estimat af CFU / ml af dagen kultur, når vokset til en vis OD-aflæsning. Vælg en OD600 aflæsning, der er i den logaritmiske vækstfase, der kan anvendes som et mål OD600 til dyrkning dage gamle kulturer. Disse data nu kan anvendes til at estimere CFU i en kultur til fremstilling af inokulum (Procedure 3).

3. Fremstilling af inoculum for eksperimentel infektion med L. monocytogenes

BEMÆRK: Denne procedure beskriver fremstillingen af den smitsomme inokulum fra en dag kultur, der blev startet fra en overnatning kultur (udarbejdet i Procedure 2). Alle disse trin udføres i BSC medmindre andet er angivet.

  1. Beregne antallet af CFU kræves for infektion baseret på antallet af mus og eksperimentelle design af undersøgelsen. Tilsæt en passende mængde BHI medie til et sterilt ventileret Erlenmeyerkolbe eller kultur rør.
    BEMÆRK: CFU af bakterier prepared vil være afhængig af, hvilken type forsøg udført. Til undersøgelse af NK og NKT-celle-responser under infektion, er hver mus inokuleret med 10 5 CFU bakterier (Procedure 6). Hvis studere adaptive T celle responser på infektion eller måling af bakteriel belastning, er hver mus inokuleret med 2 x 10 4 CFU bakterier (Procedure 8). Hvis studere overlevelse til egenskabers vedkommende hver mus podet med LD 50-dosis af patogenet (som er 10 5 CFU for mænd og 1,5 x 10 5 CFU for kvinder, se Procedure 9).
  2. Podes på rør indeholdende BHI medie med 100 pi af natten kultur. Inkuber kulturen i en 37 ° C orbital rysteinkubator (225 rpm), indtil mål OD600 er nået. Overfør indholdet kultur i en steril centrifuge rør.
  3. Centrifuge bakterier i en pellet i 5 min ved 6.000 xg anvendelse af en centrifuge. Aspirer supernatanten under anvendelse af et vakuum fastgjort til en fælde kolbe indeholdende blegemiddel.
  4. Vask pellet to gange med 1x phosphatpufret saltvand (PBS), centrifugering (5 min ved 6.000 xg) i mellem.
  5. Aspirere den anden vask og fortyndes bakterier i den rigtige koncentration i 1x PBS til at levere den CFU af interesse for hver mus i en 200 pi volumen.
    BEMÆRK: Det er bedst at bruge en kommerciel kilde til sterilt 1x PBS til vask bakterier og til forberedelse af inoculum, da lab glasvarer kan introducere immunologiske forureninger såsom lipopolysaccharid.

4. Eksperimentel infektion af mus med L. monocytogenes

BEMÆRK: Denne procedure beskriver, hvordan at inficere mus med inokulum udarbejdet i Procedure 3 og hvordan man kontrollerer CFU leveres i inokulum. Håndtering af mus og injektioner udføres i et BSC.

  1. Bestil et tilstrækkeligt antal mandlige eller kvindelige C57BL / 6J mus til dit eksperiment. Også bestille mus for at tjene som ikke-inficerede kontroller.
  2. Tillad mus tilakklimatisere i 1 uge før bakteriel inokulering.
    BEMÆRK: Dette skyldes, at stress i forbindelse med transport af dyrene kan udløse en forbigående stigning i stress hormon produktion og lymfopeni 27,28.
  3. På dagen for inokulering opnå en baseline legemsvægt for hver mus og optager det i laboratoriet notesbog.
  4. I BSC, bland bakteriesuspensionen op og ned med en steril pipette til at sikre, at bakterierne er jævnt fordelt og derefter tage op 200 pi af inokulum i en 1 ml sikkerhed manipuleret sprøjte forsynet med en 25 G nål.
  5. Sprøjt en mus ip med 200 pi af tilberedt inokulum (fx 10 5 CFU for NK-celle-infektion, Procedure 6). Til denne procedure, harmoniske mus med den mindre dominerende hånd ved at snuppe den løse hud omkring musens skuldre. Efter at have sikret, at musen er godt behersket, injicere mus i den nederste kvadrant af maven, lige lateralt for midline at undgå blæren.
  6. Bortskaf kanyle og sprøjte i en biologisk fare beholder til skarpe genstande.
  7. Gentag trin 4.3 - 4.6 indtil alle mus injiceres. Gennemføre lignende skridt med 1x PBS injicerede mus (ikke-inficerede kontroller).
    BEMÆRK: Da CFU er et estimat baseret på vækstkurven, er det også god praksis at kontrollere den faktiske CFU i inokulum. Til dette, forberede 3 - 4 forskellige fortyndinger af det fremstillede inokulum (ved anvendelse af 10-fold fortyndingsserie), som du forventer vil resultere i tællelige kolonier. Spred 100 pi af hver fortyndingsmiddel på en BHI-agarplade og inkuberes natten over ved 37 ° C. Kolonierne og beregne de faktiske CFU / ml som beskrevet i Metode 2.

5. Forberedelse Heat-dræbt L. monocytogenes for Immune Studies

BEMÆRK: Alle trin, der har potentiale til at generere aerosoler udføres i BSC.

  1. Grow dag kultur indtil OD 600 værdier enre nået som er inden den logaritmiske fase. Dispenser kultur i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Inkuber rørene i et 70 ° C i et vandbad i 1 time for at dræbe bakterier.
  3. Vask bakterier to gange med 1x PBS som i trin 3.3 og 3.4. Resuspender i sterile komplet RPMI medium indeholdende føtalt kalveserum (FCS) (se Supplemental File 1 for opskrift) i en koncentration på 4 x 10 6 / ml. Portion dræbte bakterier i 2 ml sterile kryogene hætteglas og opbevares ved -80 ° C.
  4. Bekræft død af bakterierne ved at sprede 100 pi varme-dræbte bakterier forberedelse på BHI-agarplader og inkubering natten over ved 37 ° C.
    BEMÆRK: Disse varmedræbte bakterier skal være klar til at stimulere lymfocytter i kultur i procedure 8. Hvis der er nogen kolonier vokser på BHI agar plade, gentag varme-drab procedure.

6. Måling af IFN-y Responses ved NK og NKT celler under infektion

BEMÆRK: Denne procedure beskriver, hvordan at måle IFN-y reaktioner fra NK og NKT-celler i mus ved 24 timer efter infektion med 10 5 CFU af L. monocytogenes. Denne dosis er brugt, fordi det fremkalder robuste IFN-y reaktioner fra NK og NKT-celler i milten 24. Gennemføre alle trin i BSC. At hjælpe med at opretholde cellernes levedygtighed, holde celler på is når det er muligt og bruge iskolde buffere.

  1. Pode mus som beskrevet i procedure 4 med 10 5 CFU af L. monocytogenes. Samtidig injiceres ikke-inficerede kontrolmus IP med et lige volumen af ​​1x PBS.
  2. Afliv mus på 24 timer efter podning af CO 2 indånding i henhold til institutionelle retningslinier.
  3. Ligge hver mus på sin højre side og våd ned huden med 70% ethanol ved anvendelse af en sprøjteflaske.
  4. Med aseptisk steril pincet og hård-cut saks, incise huden lige under bunden af ​​brystkassen.
  5. Spray nedden blotlagte muskellag med 70% ethanol. Milten skal være synlig under musklen lag (åben pilespids i figur 1).
  6. Med aseptisk steril pincet og fine sakse, incise muskellag at afsløre milten. grab forsigtigt milten med pincet og bruge fine saks til at klippe milten væk fra omgivende bindevæv.
  7. Placer milten i en 15 ml konisk rør indeholdende steril 1 x PBS.
  8. Half-fyld sterile petriskåle med sterilt 1x PBS. Dissociere milt gennem en 70 um nylon celle si i petriskålen ved anvendelse den flade ende af en steril 3 ml sprøjte.
  9. Overfør splenocytpopulation suspension i en ren steril 15 ml konisk rør ved anvendelse af en steril 10 ml serologisk pipette.
  10. Centrifuger prøverne ved 335 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  11. Aspirer supernatanten i en fælde kolbe indeholdende blegemiddel. Løsn cellepelleten ved at stille rør med en finger eller ved at trække den nederste rørfrem og tilbage langs en korrugeret overflade (f.eks luftstrømmen udluftning i BSC).
  12. Lysere røde blodlegemer ved at tilføje 1,5 ml Ammonium-Klorid-Kalium (ACK) lysisbuffer (se Supplemental File 1 for opskrift) til hver milt. Efter nøjagtigt 1 min og 15 sekunder, fylde røret med 1x PBS for at stoppe cellelyse.
  13. Centrifuger celler som beskrevet i trin 6.10. Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) Buffer (steril 1 x PBS indeholdende 2% FCS).
  14. Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Til dette, tage to portioner af cellesuspension til optælling. Der tilsættes 15 ul af hver cellesuspension til et tilsvarende volumen af Trypan blå (0,04%, fremstillet ved fortynding af 0,4% trypan blå opløsning i Hedeselskabet 2 O). Load 15 pi af hver celle / Trypan blå suspension ind i kammeret af hæmocytometer (dvs. et i den øverste kammer, en i bunden kammer).
  15. Ved mikroskopi tælle alle ikke-blå celler ifem store kvadrater af den centrale gitter i hvert kammer (figur 2). Tag denne optælling og dividere det med 10 for at få antallet af celler i 10 6 / ml. I eksemplet i figur 2, optællingen er 215 celler i de 5 pladser; derfor, cellekoncentrationen er 21,5 x 10 6 / ml. Gennemsnittet af celle koncentrationer opnået fra de to prøver.
  16. Seed 1 x 10 6 celler pr brønd / plet i en 96-brønds rundbundet plade til flowcytometri farvning. Sørg også frø celler for ufarvede og fluorescens minus én (FMO) kontrol. Se anbefalet flowcytometri farvning panel i tabel 2.
    BEMÆRK: de følgende trin, anbefales det at holde celler på is eller ved 4 ° C og til at beskytte celler mod lys med folie, når fluorokromer er til stede. En multikanal pipette kan anvendes til at dispensere væsker i 96-brønds plader farvende at fremskynde behandlingen. Pas på ikke at forstyrre cellepelleten nåropsugning af supernatanten fra den centrifugerede plade. Farvning kan også gøres i FACS-rør, hvis centrifugen ikke er udstyret med plade adaptere. Alle centrifuge skridt fra dette punkt på er færdig ved 456 xg i 5 min ved 4 ° C.
  17. Centrifugeres pladen og derefter vaske cellerne to gange med FACS buffer. Én vask gøres ved at tilføje 200 pi FACS buffer til hver brønd, centrifugering af pladen, og derefter opsugning af supernatanten.
  18. Udfør blokeringstrin ved tilsætning af 50 pl / brønd af FACS buffer indeholdende anti-muse CD16 / CD32 (oprenset Fc blok) (0,5 ug). Cellerne inkuberes ved 4 ° C i 15 min. Vask cellerne én gang i 1 x PBS som beskrevet ovenfor.
  19. Tilsæt 100 pi viabilitetsfarvestoffet (fixable viabilitetsfarvestoffet fortyndet 1: 1.000 i 1x PBS) til celler. Farv cellerne ved 4 ° C i mørke (i køleskab) i 30 min. Vask cellerne to gange i FACS-buffer som beskrevet ovenfor.
  20. Efter en anden vask, tilsættes 100 ul celleoverflade antistoffer eller tetramerer til respektive brønde i henhold to farvningen panel beskrevet i tabel 2. Farv cellerne ved 4 ° C i mørke (i køleskab) i 30 min. På dette tidspunkt også tilføje antistoffer til farvning enkelt positiv og FMO kontroller.
    BEMÆRK: Vedrørende enkelt positive kontroller, anbefales det at enten bruge splenocytter, der er farvet med forskellige fluorochrom versioner af CD4-antistof eller kommercielle kompensation perler, der er farvet med antistofferne, der anvendes i panelet. Forud for udførelse af denne farvning procedure bør alle FACS antistoffer titreres i test undersøgelser for at bestemme optimale koncentrationer til farvning.
  21. Vask cellerne to gange i FACS-buffer som beskrevet ovenfor og derefter lave celler ved resuspendering dem i 50 pi 4% paraformaldehyd (16% paraformaldehyd lager fortyndet i Hedeselskabet 2 O) og inkubering i 10 minutter ved stuetemperatur. ADVARSEL: paraformaldehyd er giftigt og bør kun håndteres i stinkskab.
  22. Vask cellerne to gange in FACS buffer, centrifugering i mellem. Resuspender celler i FACS-buffer. Fortsæt til næste trin eller gemme celler i køleskabet beskyttet mod lys i op til tre dage.
  23. Centrifuger celler, supernatanten fjernes, og vask cellerne to gange med 150 pi 1x Permeabilisering / Wash Buffer (Perm / Wash buffer), centrifugering i mellem. Perm / Wash Buffer fremstilles ud fra en 10x lager ved fortynding 1: 9 (v / v) i Hedeselskabet 2 O.
  24. Efter den anden vask, cellerne resuspenderes i 150 pi Perm / Wash Buffer og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C i mørke.
  25. Centrifuger cellerne igen og derefter aspirere supernatanten. Resuspender celler i 50 pi 1x Perm / Wash buffer indeholdende anti-IFN-γ og inkuberes i 1 time ved 4 ° C i mørke.
  26. Vask cellerne to gange med 1x Perm / Wash buffer, centrifugering i mellem. Resuspender celler i 250 pi FACS buffer og derefter overføre cellerne til FACS rør.
  27. Fortsæt til flowcytometri erhvervelse ved hjælp af et flow cytometis, som har en passende laser konfiguration og filtersæt til at diskriminere fluorochromer anvendes i farvningen panel beskrevet i tabel 2 29. Saml mindst 200.000 hændelser pr prøve og 10.000 arrangementer for kompensation kontrol.
  28. Påfør kompensation matrix og analysere data ved hjælp af flowcytometrisk analyse software 30.

7. Måling af bakteriel belastning i milt og lever på tidspunktet for Peak infektion

BEMÆRK: Alle trin udføres i et BSC medmindre andet er angivet.

  1. Inokulere mus IP med 2 x 10 4 CFU af patogenet ved anvendelse af procedurer beskrevet i procedure 4.
  2. På dag 3 efter infektion fremstille sterile 1,5 ml mikrocentrifugerør, der hver indeholder 500 pi iskold steril 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS og 0,2 - 0,3 g 1,5 - 2 mm syrevaskede steril glasperler. Afvej hvert rør.
    BEMÆRK: Glasperler er syre vasket ved INCUpyring i 10% eddikesyre i et bægerglas på en magnetomrører i 1 time. Disse perler derefter grundigt vasket med Hedeselskabet 2 O til fjernelse syre, lufttørres, og derefter autoklaveret før anvendelse.
  3. Afliv mus ved CO 2 eksponering.
  4. For dissektion af organer, lægge dyret på ryggen på en dissekere bord og pin lemmerne med musen til bestyrelsen ved hjælp 25 G nåle. Desinficere huden ved befugtning med 70% ethanol.
  5. Sterile hårde cut saks, lave en midtlinjeincision i huden fra lysken til midten brystet og derefter fra midten lysken mod hinanden knæ og fra midten brystet mod hinanden albue. Blunt dissekere og reflektere tilbage i huden, pinning det åbne bruge 25 G nåle.
  6. Desinficere muskellag ved befugtning med 70% ethanol og derefter med sterile fine sakse gøre en midtlinjeincision i bugvæggen. Grab formet som et sværd proces med pincet. Derefter bruger de samme fine saks, gør nedskæringer i bugvæggen fra formet som et sværd process lateralt på hver side, efter brystkassen, lige under mellemgulvet at afsløre leveren.
  7. Klip en ~ 100 mg stykke af leveren (bruge den samme lap for alle mus) ved hjælp af steril saks og læg den i en forud vejet 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  8. Brug pincet til forsigtigt at skubbe organerne på den venstre side af bughulen at visualisere milten. grab forsigtigt milten med en tang og frigøre det fra peritonealhulen ved at bortskære det omgivende bindevæv.
  9. Placer milten i pre-vejede 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende perler. Transport væv til laboratoriet i en lækage-bevis beholder indeholdende is. Vejes igen rørene indeholdende organer til at bestemme vægten væv i mg.
  10. Homogeniseres vævene ved at ryste rørene under anvendelse af en perlemølle homogenisator i 3 minutter ved frekvens på 30 Hertz.
    BEMÆRK: perlemølle metode foretrækkes for homogenisering som det er modtagelig for processynge et stort antal prøver og skaber mindre rod og potentiel eksponering for patogenet. Imidlertid automatiske homogenisatorer eller autoklaveret 2 ml manuel glasvæv homogenisatorer kunne anvendes som et alternativ.
  11. Der fremstilles en 10 ganges fortyndingsserie af homogenaterne i 0,1% Triton-X-100 i 1 x PBS, der spænder fra (fra ufortyndet til 10 -7).
  12. Spred 100 pi af hver fortyndet homogenat på en BHI-agarplade (in duplo) med en steril spreder. Overførselsplader til en 37 ° C inkubator og inkuberes natten over.
  13. Hold pladerne, som indeholder mellem 30 og 300 kolonier / plade, kassere resten. Tæl kolonier på hver plade og bestemme det gennemsnitlige antal kolonier for dublerede opslag.
  14. Beregn CFU / mg ifølge den følgende ligning:
    CFU / mg = CFU / ml i homogenatet, multipliceret med de ml homogenat fremstillet divideret med mg vægt af vævet homogeniseret.
    BEMÆRK: Hvis f.eks et gennemsnit af 30 colonies blev talt efter plating 100 ul 10 -2 fortyndet homogenat fremstillet af en 120 mg stykke leveren, der blev homogeniseret i 0,5 ml, beregningerne ville være som følger:
    CFU / ml = 30 kolonier x 100 (fortyndingsfaktor) / 0,1 ml (volumen spread) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml homogenat / 120 mg væv = 125 CFU / mg.

8. Virkninger af L. monocytogenes på IFN-y Responses af CD4 + og CD8 + -celler

BEMÆRK: Denne procedure beskriver hvordan man måler IFN-γ-produktion ved milt-CD4 + og CD8 + T effektorceller høstet på tidspunktet for toppen af adaptive immunrespons (~ 7 d efter infektion) under anvendelse af to metoder: (1) strømning cytometri for at måle IFN-y af CD4 + og CD8 + -celler ved intracellulær cytokin-farvning, og (2) ELISA til måling af total IFN-γ niveauer produceret af splenocytter (inkluderer alle T-celler). Procedurerudføres inden for BSC.

  1. Infect mus ved injektion ip med 2 x 10 4 CFU af patogenet ved anvendelse af procedurer beskrevet i procedure 4.
  2. På dag 7 efter infektion, aflive mus ved CO 2 indånding i henhold til institutionelle retningslinier.
  3. Dissekere milten (som beskrevet ovenfor) og anbringes i et 15 ml konisk rør indeholdende steril 1x PBS. Transport rørene til laboratoriet i en lækage-bevis beholder indeholdende is.
  4. Proces milten i en enkelt celle suspension, lysere røde blodlegemer som beskrevet i afsnit 6, og derefter resuspenderes cellerne i komplette RPMI medier indeholdende 10% FCS. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
  5. Opsæt kulturer til måling af IFN-y svar. Til dette Dispense celler (4 x 10 6 i 1 ml / brønd) i plader med 24 brønde sammen med og lige antal (4 x 10 6 eller 1 ml / brønd) af optøede varmedræbte L. monocytogenes (fremstillet i Metode 5) . Overfør celler til en 37° C inkubator.
  6. Efter 20 timer af inkuberingen tilsættes 0,66 pl / ml protein transport inhibitor til brønde og fortsætte inkubationer.
  7. Fire timer senere, overførselspladen til BSC og indsamle 500 pi kultursupernatant og fryse (ved -80 ° C) til senere måling af IFN-y-niveauet under anvendelse af en kommerciel enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) kit 31. Derefter indsamle celler i et sterilt 15 ml rør. Vask brøndene med 1x PBS og samle denne vask sammen med indsamlede celler.
  8. Gennemføre celleoverflade-farvning og intracellulær farvning for IFN-γ på CD4 + og CD8 + -celler som beskrevet i procedure 6, bortset bruge farvning panel beskrevet i tabel 3. Fortsæt til flowcytometer erhvervelse (opsamling 200.000 hændelser / prøve) og analysere data 29 ved hjælp af flowcytometri analyse software 30.

9. Måling Mouse Overlevelse til endpoints efter L. monocytogenes Infection

BEMÆRK: Denne procedure beskriver virkningen af en agent på mus overlevelse til endepunkter efter infektion med den modificerede LD 50 dosis af patogenet. Alle disse procedurer udføres i BSC i dyret anlægget.

  1. Injicere mus ip med den modificerede LD 50 dosis af Listeria monocytogenes, som beskrevet i Procedure 4. Dette blev bestemt til at være 10 5 CFU (for mænd) eller 1,5 x 10 5 CFU (for kvinder) 31.
  2. Følg mus to gange dagligt for kliniske tegn og registrere disse tegn og dyr kropsvægt i et laboratorium notesbog. Afliv mus, hvis de viser et tab på 20% i kropsvægt eller to kliniske tegn på listeriose (sløvhed, pjusket pels, foroverbøjet kropsholdning, besværet vejrtrækning, sløve eller indsunkne øjne).
  3. Efter 14 dage aflive overlevende mus via CO 2 inhalation.
  4. Forbered Kaplan-Meier plot af dataene ved at plotte overlevelsen af hver gruppe procent mod tiden 32.
    (figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser nogle typiske flowcytometri farvning af IFN-γ i milt NK og NKT-celler ved 24 timer efter infektion med 10 5 CFU af patogenet. Denne figur illustrerer også den gating strategi for farvning panel beskrevet i tabel 2. Figur 4 viser nogle repræsentative data, der blev opnået i et eksperiment, hvor hanmus blev behandlet med den PPARa antagonisten IS001 eller vehikelkontrol, inficeret med 10 5 CFU Listeria monocytogenes, og derefter analyseret for IFN-γ i NK og NKT-celler efter 24 timer . Denne figur viser, at behandling med IS001 boostet IFN-y reaktioner fra NKT-celler, men ikke NK-celler efter infektion med patogenet. Figur 5 viser repræsentative farvning for IFN-γ i milten CD4 + og CD8 + T-celler efter 7 dage efter infektion efter fornyet stimulering ex vivo med varmedræbt pathogen. Denne figur viser også gating strategi for farvning panel beskrevet i tabel 3. Figur 6 viser repræsentative data, der blev opnået i et eksperiment, hvor hanmus blev behandlet dagligt med PPARa antagonisten IS001 eller vehikelkontrol, der er inficeret med en subletal dosis af Listeria monocytogenes, og analyseres efter 7 dage efter infektion. Dette forsøg viser, at behandling med IS001 forbedret IFN-y reaktioner fra både CD4 + og CD8 + -lymfocytter. Figur 7 viser repræsentative data fra en undersøgelse, der undersøgte effekten af PPARa antagonisten IS001 på musenes overlevelse til endepunkter efter infektion med den modificerede LD 50-dosis af patogenet. Plottet er den procentvise overlevelse af mus mod tiden efter infektion. Denne figur viser, at behandling med IS001 forøgede overlevelsen af ​​hanmus til endpoints. Tilsammen viser disse data illustrerer, hvordan denne model kan anvendes til at undersøgevirkningerne af nye lægemidler eller behandlinger på IFN-γ reaktioner in vivo og at undersøge, hvordan disse immune ændringer påvirke dyr overlevelse mod infektion.

figur 1
Figur 1. dissekere milt fra inficerede mus. Denne serie af billeder viser, hvordan at dissekere milten fra en død mus. (a) Lig musen på sin højre side og spray ned huden med 70% ethanol. (b) med aseptisk steril pincet og hård-cut saks, incise huden lige under bunden af brystkassen. (c) Spray ned den udsatte muskel lag med 70% ethanol. Milten skal være synlig under musklen lag (åben pil hoved). (d) med aseptisk steril pincet og fine sakse, incise muskellag at afsløre milten. (e) Grib forsigtigt milten med pincet og uSE fine saks til at klippe milten væk fra omgivende bindevæv. (f) Placer milten i en 15 ml konisk rør indeholdende steril 1 x PBS. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Counting Splenocytter anvendelse af et hæmocytometer. (a) viser den centrale gitter af hæmocytometeret. (b) viser et forstørret billede af den centrale gitter, der indeholder 25 store kvadrater (at hver indeholder 16 mindre kvadrater). De fem store pladser anvendes til optælling er fremhævet i grå (4 hjørne firkanter plus center torvet i det centrale gitter). (c) viser et forstørret billede af en af de store grå firkanter. For at bestemme cellens volumen i 10 6 / ml, første optællingalle de levedygtige celler i de fem store grå firkanter. I det viste eksempel, denne tæller er 215. Når tælle, så sørg for at kun tælle alle de klare (ikke-blå) celler, herunder dem, der rører dobbelte linjer til højre og i bunden af ​​nettet. Må ikke tælle cellerne rører de dobbelte linier på venstre og toppen af ​​gitteret. Tag den samlede fem firkantede optælling og dividere det med 10 for at få antallet af celler i 10 6 / ml. I eksemplet, 215 divideret med 10 er 21,5 x 10 6 celler / ml. Bemærk, at disse beregninger kun fungere, hvis du regner fem af de store pladser som fremhævet og fortyndes dine celler 1: 1 i trypanblåt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Gating strategi for påvisning af IFNγ Produktion i NK og NKT-celler. Første port på lymfocytter på FSC-A ved SSC-Et plot. Så gate på de begivenheder, der er på diagonalen på FSC-H / FSC-Et plot. Disse er de singletter. Så gate på live (AmCyan -) og CD8 - celler. Så plotte tetramerfarvning mod TCRβ. De NKT-celler er inden for dobbelt positive population og NK-celler er inden for dobbelt negativ befolkning. Gate på de dobbelte positive celler, og plot NKp46 versus FSC. Gate på NKp46 negative population, som er de NKT-celler (denne port kan indstilles ved at finde det punkt af afsnit i de to populationer fra NK-celle plot). NK celler er tetrameren - TCRβ - NKp46 + population. Inden NK og NKT-cellen porte, er IFN-y + celler i PE-kanalen identificeret efter indstilling af en gate baseret på FMO kontrol. klikher for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Repræsentant Data opnået vedrørende hyppigheden af IFN-γ + NK og NKT celler ved 24 timers Post-infektion. I dette eksperiment C57BL / 6J mus (N = 3 - 4 / gruppe) var inficeret ip med 10 5 CFU af L. monocytogenes eller blev efterladt un-smittet. Mus blev også indgivet lægemidlet IS001 eller bærer (0,5% carboxymethylcellulose) på samme tid for inokulering og 12 timer senere. Fireogtyve timer efter inokulering blev mus aflivet, og miltene blev fjernet og blev forarbejdet individuelt og farvet til flowcytometri. Vist er middelværdien ± SEM frekvens af IFN-γ + celler i NK (a) eller NKT-cellen porte (b) i ikke-inficerede eller inficerede mus efter behandling med et køretøj eller lægemidlet IS001. *Indikeresa forskel (P <0,05) fra kontrol køretøj ved to-halet t-test. Data er igen udskrevet fra 31 med tilladelse fra Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. Den amerikanske sammenslutning af immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Gating strategi for påvisning af IFN-γ-produktion i CD4 og CD8 celler. Første port på lymfocytter på FSC-A ved SSC-A plots. Så gate på de begivenheder, der er på diagonalen på FSC-H / FSC-Et plot. Disse er de singletter. Inden for denne port, gate på levende (AmCyan -) CD45 + celler. Derefter gate på enten CD8 + eller CD4 + populationer. Inden for hver port, IFN-γ +celler i PE-kanalen identificeres ved at sammenligne farvningen til FMO kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Repræsentant Data opnået vedrørende hyppigheden af IFN-γ + CD4 + og CD8 + T-celler på 7 dage efter infektion med L. monocytogenes (EGD stamme). I dette eksperiment blev C57BL / 6J-mus inficeret ip med 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / gruppe) eller blev efterladt uinficeret (N = 3 / gruppe). Musene blev også lægemidlet administreres IS001 eller køretøj (0,5% carboxymethylcellulose) to gange daglig start på dagen for podning. Syv dage senere blev musene aflivet, og miltene blev fjernet og blev behandlet individuelt forcellekultur. Splenocytpopulation mononukleære celler blev stimuleret i 24 timer med varme-dræbt L. monocytogenes med protein transport inhibitor tilføjet til den endelige fire timers kultur. Celler blev derefter farvet til flowcytometri. Vist er middelværdien ± SEM frekvens af IFN-γ + -celler i CD4 + (A) eller CD8 + -celle porte (B) i ikke-inficerede eller inficerede mus efter behandling med et køretøj (0,5% carboxymethylcellulose) eller lægemidlet IS001. * Viser en forskel (P <0,05) fra køretøjets styring modstykke som bestemt ved to-halet t-test. Data er igen udskrevet fra 31 med tilladelse fra Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 7. Repræsentant data opnået i løbet af et eksperiment, der sammenlignede effekten af en PPARa antagonist 1S001 på Mouse Overlevelse til endpoints efter infektion af Male C57BL / 6J mus med L. monocytogenes (EGD stamme). I dette eksperiment C57BL / 6J-mus (N = 10 mus / gruppe) blev inficeret ip med den modificerede LD 50-dosis af patogenet (10 5 CFU) af L. monocytogenes. Musene blev også lægemidlet administreres IS001 eller køretøj (0,5% carboxymethylcellulose) to gange daglig start på dagen for podning. Musene blev fulgt dagligt for kliniske tegn og blev aflivet, hvis humane endpoints var opfyldt. Vist er overlevelsen af ​​mus procent til endpoints over tid * viser en forskel i overlevelse mellem grupper som bestemt ved log-rank test (P <0,05). Data er igen udskrevet fra 31 med tilladelse fra Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. Den amerikanske sammenslutning af immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Viser nogle repræsentative beregninger til bestemmelse af CFU i en portion af Day Culture. I dette eksempel blev en alikvot af dagen kultur tages og blev fortyndet 1: 1 med BHI medie. OD600 af denne fortyndede prøve blev bestemt til at være 0,84. Desuden blev en 100 pi alikvot udtages til CFU-bestemmelse. Denne prøve blev fortyndet med 900 pi BHI medium (10 -1) og blev vasket og resuspenderet i 1 ml BHI. En 10-ganges fortyndingsserie af denne prøve blev fremstillet (10 -2 til 10 -9) og fortyndede prøver blev udpladet på BHI agar plader (kun værdier for 10 -4 til 10 -9 er vist). Den næste dag kolonier blev talt. Kun de plader, der havde koloni tal mellem 30-300 blev anset for beregningen (dvs. 10 -6 plade, markeret med gult). Antallet af kolonier på denne plade (70) blev derefter divideret med 0,1 (volumen i ml udpladet) for at få CFU / ml af den fortyndede prøve. Denne værdi blev derefter multipliceret med fortyndingsfaktoren (10 6) for at opnå CFU / ml læsning af den ufortyndede kultur. TMTC = alt for mange til at tælle.

tabel 2
Tabel 2: Farvning Panel til påvisning af IFN γ i NK og NKT Cells. Bemærk, at enten kompensation perler farves med strømmen antistofferne anvendt i panelet eller splenocytter farvet med forskellige fluorochrom versioner af CD4-antistof klon GK1.1 kan anvendes som enkelte positive kontroller.

tabel 3
Tabel 3: Farvning Panel til påvisning af IFN-γ i CD4 + og CD8 + -celler. Bemærk, at enten kompensation perler farves med strømmen antistofferne anvendt i panelet eller splenocytter farvet med forskellige fluorochrom versioner af CD4-antistof klon GK1.1 kan anvendes som enkelte positive kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en protokol over, hvordan at foretage en grundlæggende eksperimentel infektion med EGD stamme af L. monocytogenes 25 i mandlige eller kvindelige C57BL / 6J mus. Denne protokol blev oprettet med det formål at studere effekten af en ny lille molekyle IS001 på IFN-γ produktion af medfødte og adaptive lymfocytter in vivo 31. Ved at overvåge bakterieclearance og overlevelse efter infektion blev indsigter i hvordan disse ændringer i IFN-γ påvirket værtens evne til at bekæmpe infektionen.

Kritiske overvejelser i protokollen

En vigtig overvejelse i udformningen af ​​denne type undersøgelse er, at hvert forsøg være tilstrækkeligt strøm og hensigtsmæssigt kontrolleret. På grund af biologisk variation i immunresponset på infektion (se figur 4 og 6), anbefales det, at N = 4 - anvendes 5 mus pr gruppe for de indledende immune undersøgelser. Hvis enfter disse undersøgelser er der en tendens i dataene, men ingen signifikant forskel tilsyneladende mellem grupperne, kunne en magt beregning gøres for at bestemme den mindste antal dyr, der kræves i de efterfølgende undersøgelser for at opnå statistisk signifikans. Vedrørende kontroller, er det vigtigt at medtage ikke-inficerede kontroller til bestemmelse af baseline IFN-y-responser for immune undersøgelser og køretøj kontroller til at skelne virkningen af ​​behandling fra stress i forbindelse med administration af behandlingen. En anden vigtig overvejelse er timingen af ​​behandlingen. Da den medfødte reaktion på L. monocytogenes er meget hurtig, anbefales det administreres den første behandling dagen før eller på samme tid som, inokulering for at sikre, at terapeutiske niveauer af reagenset opnås forud for initiering af det medfødte immunreaktion.

Endnu en anden vigtig overvejelse er den dosis af patogenet, der skal anvendes til infection. En subletal dosis anbefales til måling af bakteriel belastning, da det øger chancen for, at patogenet vil blive koncentreret i milten og leveren, giver mulighed for mere nøjagtig optælling af bakterierne. En subletale dosis anbefales også til optælle IFN-y reaktioner fra adaptive lymfocytter at sikre, at dyrene ikke bukke under for listeriose forud for tidspunktet for maksimal T-celle ekspansion. I modsætning anbefales det, at en højere infektiøs dosis anvendes til måling af den tidlige NK og NKT-celle respons på 24 timer for at maksimere den IFN-γ-produktion af disse celler.

Den klassiske LD 50 er den dosis af patogenet, der resulterer i 50% dødelighed af mus. Da døden ikke var en acceptabel endepunkt på vores institution, og da mange symptomer på listeriose kan forudsige, om et dyr er tilbøjelige til at bukke under for en infektion, vi brugte en defineret liste af kliniske tegn i stedet for døden som endepunkt i vores studier. Using denne metode, blev det bestemt, at den modificerede LD 50 var 10 5 CFU for 8 uger gammel mand og 1,5 x 10 5 CFU for 8 uger gamle C57BL / 6J-mus 31. Disse LD 50 doser blev bestemt ved at måle overlevelsen af musene procent til endepunkter i trinvise dosis-eskalering studier (N = 5 studier i alt), at hver indeholdt N = 8 mus pr gruppe (fx mus blev inficeret først med 10.000 CFU og derefter en anden batch med 20.000 CFU, etc.). Beregningen LD50 blev bestemt ud fra en regression plot af log (CFU) (x-aksen) versus probit af procent overlevelse værdier (y-aksen) (website: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).

Bemærk, at den modificerede LD 50-dosis bestemmes i vores laboratorium kan afvige fra det i et andet laboratorium, selv når inficere mus med den samme stamme af L. monocytogenes. En del af denne variation kan vedrøre den subjektive natur of overvågning kliniske tegn på listeriose i forhold til den mere absolutte endepunkt død. Yderligere variation kan skyldes forskelle i miljømæssige faktorer såsom mus kost eller mikrobiota eller forskelle i udarbejdelsen af ​​inokulum mellem laboratorier. Det anbefales således, at en pilotundersøgelse, inden der iværksættes eventuelle overlevelse undersøgelser, der skal udføres, når hunmus (N = 8 mus / gruppe) inficeres med 1,5 x 10 5 CFU af samme stamme af L. monocytogenes, som anvendes i dette studere og symptomer overvåget for at fastslå, om denne dosis faktisk resulterer i 50% overlevelse til endepunkter. Hvis overlevelse er lavere eller højere end 50% på dette CFU, kunne trinvis dosisøgning eller dosis nedtrapning undersøgelser udføres for at hurtigt at indsnævre ind på LD 50 dosis.

En anden vigtig overvejelse er stammen eller understamme af mus anvendt til infektion studier. Denne protokol beskriver infektion i almindeligt anvendte indavlet musestamme C57BL / 6J. Denne stamme er velegnet til måling af IFN-y-responser, da denne mus anses for at være en Th1-tilbøjelige stamme 33 og som et resultat, er relativt resistent over for L. monocytogenes-infektion (sammenlignet med Th2-tilbøjelige mus stammer, såsom BALB / c) 34,35. Tilpasning denne protokol til andre musestammer vil kræve kendskab til infektiøs dosis af patogenet for den pågældende stamme. Det anbefales også at bruge mus på samme alder, køn og sælger som skitseret i denne protokol for at reducere mængden af ​​fejlfinding involveret i oprettelsen af ​​modellen. For eksempel, C57BL / 6 mus bestilles hos én leverandør (f.eks C57BL / 6J) kan udvise genetiske forskelle end C67BL / 6 mus bestilt fra en anden leverandør (f.eks C57BL / 6NTac) 36. Desuden den intestinale mikroflora forskellig C57BL / 6 understammer opnået fra forskellige leverandører, hvilket kan påvirke balancen mellem Th1- og Th17 responser i musen 37.

ove_title "> Potentielle Ændringer Teknik

Mus er mest almindeligt inokuleret ip eller intravenøst ​​i modsætning til den naturlige infektionsvej hos mennesker, som er gennem mavetarmkanalen. Mundtlige infektioner er mindre almindelige, fordi standard stammer af L. monocytogenes ineffektivt inficere tarmepitelet af mus 38. Dette er fordi der er en enkelt aminosyreændring i sekvensen af muse E-cadherin fra human E-cadherin, der resulterer i tab af anerkendelse af E-cadherin ved listerial invasion protein, internalin A (INIA) 39. For at overvinde denne barriere, bruger forskerne mus, som er transgene for human E-cadherin-protein eller brug listeria, der er blevet manipuleret til at udtrykke en muteret sekvens af INIA (INIA mut), som binder til muse E-cadherin med samme affinitet som WT EGD for human E-cadherin 40. Således er en potentiel modifikation af denne teknik er at inficere mus via den orale vej. Læseren henvises til en anden JOVE publikation, der beskriver orale podning metoder 38. Bemærk, at ændring Smittemåden vil påvirke den infektiøse dosis samt kinetikken for formidling af patogenet.

Denne protokol beskriver anvendelse af varmedræbte listeria at fremkalde IFN-γ-produktion af CD4 + og CD8 + T-celler. Varmedræbte L. monocytogenes blev valgt som en stimulus i vores studier, fordi dette antigen er billig, og fordi vores laboratorium var primært interesseret i CD4 + T-cellereaktioner på patogenet. En begrænsning er, at varmedræbte bakterier ikke effektivt prime CD8 + T-cellereaktioner enten in vitro 41 eller in vivo 42,43 infektion. Således CD8 + T-celle IFN-γ produktion, som vi observeret af splenocytter høstet på toppen af infektion (dvs. figur 6) sandsynligvis er en reaktion på den tilbageværendelevende bakterier til stede i splenocytkulturer eller blev fremkaldt som følge af cytokin-induceret cytokinfrigørelse 41. Som et alternativ til varmedræbte listeria kunne man også fremkalde IFN-y-responser ex vivo ved at udsætte T-celler til peptider, der koder epitoper på listerial proteiner. Faktisk immunodominant MHC Klasse II-begrænsede epitoper for listeriolysin O og p60 hydrolase og er blevet beskrevet for C57BL / 6 og BALB / C-mus og immundominante MHC klasse I epitoper er blevet beskrevet for BALB / c 44. Endnu en anden fremgangsmåde er at inficere mus med stammer af L. monocytogenes, der er blevet gensplejset til at udtrykke model antigener, såsom ovalbumin eller virale antigener, for at drage fordel af eksisterende MHC klasse I- og MHC klasse II-tetramer reagenser at opregne antigenspecifik T-celler i inficerede mus 45,46.

Andre begrænsninger i protokollen

En anden begrænsning ved denne model er, at det oinstallationstype foranstaltninger IFN-γ-produktion af immunceller i milten. Ud over anvendelsen af tetramerer at opregne antigenspecifikke T-celler (af ovalbumin-udtrykkende varianter af L. monocytogenes), flowcytometri farvende paneler her beskrevne let kan modificeres til at måle produktionen af andre cytokiner, såsom TNF eller IL-2 eller effektormolekyler, der deltager i CD8 T-celle eller NK-medieret drab af patogenet såsom perforin eller granzym B. desuden kunne denne protokol også tilpasses til at undersøge IFN-γ produceres af immunceller i leveren.

Fremtidige applikationer

Når denne protokol beherskes, kan det tjene som en simpel in vivo-model til screening af virkningerne af forskellige midler eller gener på Th1 og cellulær immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Tags

Infektion , Bakterier infektion model mus flowcytometri interferon-γ respons
Eksperimentel infektion med<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Som en model til at studere Host Interferon-y Responses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter