Summary
Этот протокол описывает , как прививают C57BL / 6J мышей штамма EGD из листерий (L. моноцитогенес) и для измерения интерферона-гамма (IFN-gamma) ответов на естественных киллеров (NK) клеток, естественных киллеров Т (НКТ) клеток, и адаптивным Т-лимфоциты после заражения. Этот протокол также описывает , как проводить исследования выживаемости у мышей после заражения с помощью модифицированного LD 50 дозы возбудителя.
Abstract
L. моноцитогенес является грамположительной бактерией , которая является причиной болезней пищевого происхождения в организме человека. Экспериментальная инфекция у мышей с этим патогеном является высокоинформативным о роли врожденной и адаптивной иммунных клеток и специфических цитокинов в хозяина иммунитета против внутриклеточных патогенов. Получение IFN-gamma врожденными клетками во время сублетального инфекции с L. моноцитогенес имеет важное значение для активации макрофагов и ранний контроль возбудителя 1-3. Кроме того, производство IFN-γ с помощью адаптивных лимфоцитов памяти имеет важное значение для заливки активации врожденного клеток на реинфекцией 4. L. моноцитогенес модель инфекции , таким образом , служит отличным инструментом для исследования , могут ли новые методы лечения, которые предназначены для увеличения производства IFN-gamma оказывают влияние на IFN-γ ответы в естественных условиях и имеют продуктивные биологические эффекты , такие как увеличение бактерий зазор или улучшение выживания мыши изинфекционное заболевание. Описанная здесь является базовым протоколом для того, как проводить внутрибрюшинные инфекции C57BL / 6J с штамма EGD от L. моноцитогенес и измерить продукцию IFN-gamma NK клетками, клетками NKT и адаптивное лимфоцитов при помощи проточной цитометрии. Кроме того, процедуры описаны в: (1) расти и готовить бактерии для инокуляции (2) измерения бактериальной нагрузки в селезенке и печени, а также (3) выживание мера животного к конечным точкам. Также предоставляются представительные данные для иллюстрации того, как эта модель инфекция может быть использована для проверки влияния специфических агентов на IFN-gamma ответов на L. моноцитогенес и выживаемости мышей от этой инфекции.
Introduction
ИФН-γ представляет собой цитокин , который имеет решающее значение для опосредования иммунитета против внутриклеточных патогенов и для контроля роста опухоли 5. Важность этого цитокина в бактериальной резистентности проявляется в наблюдении , что люди с мутациями в сигнальном пути IFN-гамма очень восприимчивы к инфекции с микобактериями и сальмонелл 6. Кроме того , у мышей с дефицитом либо IFN-gamma или IFN-γ дефектов рецептора выставляться в устойчивости к микобактерий 7-9 и других внутриклеточных патогенов , включая L. моноцитогенес 10,11, Лейшмания основная 12, Salmonella Typhimurium 13, и некоторые вирусы 11. В дополнение к борьбе с патогенами, IFN-γ играет решающую роль в принимающей обороны против опухолей 14. Хотя выше производство IFN-gamma является полезным в контексте инфекции или рака, длительное производство этого цитокина было связано тО развитии системного аутоиммунитете 15-17 и ускорения развития диабета типа I в не страдающих ожирением диабетической модели мыши 18.
Основными источниками IFN-gamma включают NK - клетки, клетки NKT, γδ Т - лимфоциты, хелперные 1 (Th1) клеток Т и цитотоксических Т - лимфоцитов (CTL) 5,19,20. IFN-γ повышает как врожденный и адаптивный иммунитет путем: (1) до регулирующего главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и выражение II, (2) увеличение экспрессии костимуляторных молекул на антиген-представляющих клеток, (3) повышение макрофагальной фагоцитоз и производство провоспалительных цитокинов и антимикробные факторы (например, оксид азота и активные формы кислорода), (4) содействие дифференцировки наивных CD4 + Т - клеток в эффекторные клетки Th1, (5) содействие переключения класса антител к иммуноглобулина ( Ig), 2a и IgG3 (у мышей), (6) индукции продуцирования хемокинов привлекать клетки иммунной системы к участкам Infection, и (7) повышение NK клеток и CTL ответов 5,19. Учитывая исключительную важность IFN-gamma в ответ хозяина к патогенам и опухолей, рекомбинантный IFN-γ была испытана в качестве лечения различных инфекций и злокачественных опухолей (обзор в 19). Тем не менее, так как системное введение IFN-gamma или Th1 способствующего цитокина интерлейкина-12 (IL-12) связано с побочными эффектами и от дозы токсичность 19,21, существует заинтересованность в разработке альтернативных стратегий для повышения IFN-γ производства путем иммунные клетки. Разработка новых биопрепаратов и малых молекул требуется в естественных условиях скрининговых инструментов для тестирования повышают ли такие средства производства IFN-gamma в ходе иммунного ответа и переводит ли это в значимые биологические эффекты , такие как повышение выживаемости животных.
Экспериментальная инфекция у мышей с грамположительной бактерии L. моноцитогенес была инструментальная модельрасшифровке роль IFN-gamma в хост-иммунитета против внутриклеточных патогенов 1,22. Заражение мышей с патогеном внутривенно или внутрибрюшинно (IP) приводит к быстрому распространению бактерий в селезенке и печени, где они становятся интернализованной резидентами макрофагов и гепатоцитов с пиковыми нагрузками бактерий в селезенке, происходящих от 3 до 4 дней пост- инфекция 1,3,22. Получение IFN-gamma NK клетками является важным для активации макрофагов и ранней устойчивости к возбудителю 3; Однако при высоких дозах инфекционных, производство IFN-gamma также может быть вредным для патогена зазор 23. НКТ - клетки также являются источником IFN-gamma в селезенке и печени во время раннего контроля патогенов 2,24 и это производство было показано, усиливает продукцию IFN-gamma другими типами клеток , включая клетки NK 2. С другой стороны, в дальнейшем действующие адаптивные Т - лимфоциты, CD8 + Т - клеток в Partiлярных, имеют важное значение для опосредования зазор возбудителя и обеспечивая защиту от повторного заражения 1,4,22.
Эта модель инфекции была привлекательной для исследователей по целому ряду причин (обзор 1). Во-первых, заражение патогеном является высокой воспроизводимостью и индуцирует сильную Th1 и клеточный иммунный ответ. Во-вторых, во время сублетального инфекции, бактериальной нагрузки концентрируется в печени и селезенке, где он может быть легко измерены. В-третьих, возбудитель может быть безопасно работать в соответствии с биологической безопасности 2-го уровня (BSL2) условиях. В-четвертых, организм и иммунный ответ, который он создает, были широко охарактеризованы. И, наконец, различные мутантные и генетически модифицированных штаммов были разработаны, которые доступны для использования.
Описанное здесь является основным протоколом для прививки C57BL / 6J с штамма EGD Л. моноцитогенес 25 и для измерения IFN - γ повторноН.К. ответах, НКТ и адаптивных лимфоцитов после инфицирования. Также описано , как измерять бактериальной нагрузки в селезенке и печени после сублетального инфекции и провести исследования выживаемости после инфицирования с модифицированной LD 50 дозы возбудителя. И, наконец, репрезентативные данные показаны как этот протокол может быть использован для скрининга влияния новых обработок на ответах IFN- и выживаемости мышей от L. моноцитогенес инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по безопасности
Этот протокол описывает заражение мышей с живыми моноцитогенес L.. Возбудитель обрабатывается безопасно в условиях BSL2 квалифицированным персоналом, не иммунодефицитом. Людей с ослабленным иммунитетом относятся беременные женщины, пожилые люди и лица, которые являются ВИЧ-инфицированными или имеют хронические состояния, которые требуют лечения с иммуносупрессивной терапии. Персонал должен надеть защитную лабораторный халат или платье, перчатки, маски и средства защиты глаз при обработке зараженных образцов. Работа, описанная здесь, была выполнена в условиях BSL2 под сертификатом (# 32876), который был опубликован в сети здравоохранения университета (иНп) биобезопасность офис. Тушки от инфицированных мышей или любых неиспользованных тканей были дважды упаковываются и утилизировать в биологически опасных отходов. Клети от инфицированных мышей были также обеззараживают автоклавированием.
Заявление по этике
Мыши выдерживались и инфицировали в Квараntine номер в пределах объектов животного иНп и заботились в соответствии с руководящими принципами, установленными Канадский совет по уходу за животными. Все процедуры на мышах проводились при использовании животных протокола # 3214, который был одобрен комитетом по уходу за животными иНп. Из-за этических соображений, смерть не была использована в качестве конечной точки для исследований выживания. Модифицированный LD 50 дозы сообщили здесь L. моноцитогенес инфекция была определена доза , при которой 50% мышей достигли конкретных конечных точек, которые состояли потери 20% массы тела или показывая по крайней мере два из следующих клинических признаков: вялость, взъерошенные мех, сгорбившись поза, затрудненное дыхание, тусклые или запавшие глаза. Мыши были подвергнуты эвтаназии , когда они достигли конечных точек посредством воздействия диоксида углерода (СО 2) в соответствии с директивами по объекту иНп.
1. Подготовка глицерол запасов для долгосрочного хранения
Примечание: Эта процедура описывает , как запасы глицерина из самыхШтамм EGD из L. моноцитогенес получают из исходного раствора в глицерине. Шаги, которые имеют потенциал для создания аэрозолей должны выполняться в рамках сертифицированной биологической безопасности кабинета (BSC).
- Приготовьте настой сердца мозга (BHI) агаром для роста бактерий. Для этого нужно добавить 3,8% (вес / об) бульона BHI , и 1,5% (вес / объем) агаре в бидистиллированной H 2 O (DDH 2 O). Автоклавы жидкость. После того, как агар охлаждается до 50 ° С, дозировать жидкость в бактериальных чашках Петри (25 мл / чашку) и пусть плиты сухие (непокрытый) в КБС в течение 1 часа.
Примечание: Передача BHI агаром в ванну воды 50 ° С , после обработки в автоклаве , чтобы избежать затвердевание до заливки пластин. Храните BHI пластины при температуре 4 ° С с ног на голову (со стороны средств массовой информации на вершине), пока не готовы к использованию. - Приготовьте жидкий BHI носитель. Для этого смешайте 3,8% (вес / объем) BHI - бульона в DDH 2 O. автоклава.
- Удалить замороженную глицерине штамма L. моноцитогенес EGD от -80 ° C замораживанияR и оттепели до комнатной температуры.
- Смочите стерильный наконечник пипетки в талой раствора в глицерине и сразу полоса кончике взад и вперед по сечению пластины BHI. Это основная полоса.
- Включите плиту на 90 ° С и с использованием свежей кончика пипетки, перетащить через первую полосу и распространить его на следующей ¼ пластины (это вторичная полоса). Повторите еще раз, чтобы сделать третичную полосу.
- Включите планшет вверх дном и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Единый унифицированный колонии должны быть получены в последнем наборе прожилок и видимой между 16 и 24 ч.
- Разливают 10 мл стерильной BHI бульона в стерильный вентилируемые 50 мл пробирку. Выберите одну колонию L. моноцитогенес от пластины с помощью стерильной пипетки и прививать бульон. Выдержите культуры в орбитальной качалке инкубаторе 37 ° C в течение ночи или до OD 600 = 1,0 с параметрами при 225 оборотов в мин (оборотов в минуту).
Примечание: Стеклянные или одноразовые PLASTIC колб Эрленмейера также могут быть использованы для культивирования бактерий. Вне зависимости от типа используемого контейнера, убедитесь, что она стерильна, вентилируют и что объем культуры не превышает 20% от общего объема контейнера для обеспечения надлежащей аэрации бактерий. - Приготовьте запасы глицерина путем смешивания стерильного 100% глицерина с ночной бактериальной культуральной жидкости в соотношении 1: 1. Распределить бактериальный / глицерина смесь в 2 мл криогенные флаконы (500 мкл / флакон) и передачи флаконов до -80 ° C морозильника для хранения.
Примечание: фондовые методы Bead также могут быть использованы вместо запасов глицерина для хранения бактерий. По этому методу, пористые микрогранулы засевают чистой культурой L. моноцитогенес и хранили при -80 ° С. Каждый шарик может быть использован для инокуляции свежую культуру по мере необходимости. Смотрите список материалов для получения дополнительной информации.
2. Определение роста кривой Л. моноцитогенес в День культуры Примечание: Эта процедура описывает , как создать кривую роста для L. моноцитогенес , который используется для оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) для исследования инфекции. Все шаги, которые имеют потенциал для создания аэрозолей должны выполняться в рамках сертифицированного BSC.
- Взять 100 мкл ночной культуры, полученной на этапе от 1,7 до 10 мл BHI сред в вентилируемом 50 мл трубки и расти при температуре 37 ° C в инкубаторном шейкере (225 оборотов в минуту, наклоненной под углом 45 °). Используйте не привитой трубку в качестве контроля.
- Взять 0,5 мл образцы культуры с часовыми интервалами (1, 2, 3, 4, 5, 6 ч . И т.д.). Развести каждый аликвоты 1: 1 (об / об) с BHI сред в пластиковую кювету. Пипетировать вверх и вниз, перемешать. Измерение оптической плотности (OD) при 600 нм (OD 600) с использованием спектрометра. Продолжайте культивированием бактерии до OD 600 = 1.
- В то же время, взять пробу 100 мкл культуры и разбавьте 900 мкл BHI сред в стерильном 1,5 мл MICRocentrifuge трубка (это 10 -1 разведение). Центрифуга бактерии при 6000 мкг в течение 5 мин, и аспирата супернатант.
- Промыть бактерии дважды ресуспендирования осадка в 1 мл BHI-средах, центрифугирование в течение 5 мин при 6000 х г, а затем аспирационных супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл BHI средах. Приготовьте разведения серии 10-кратное этого образца в BHI средах (10 -2 до 10 -9). Спред 100 мкл каждого разбавителя на отдельные BHI чашки с агаром. Инкубируйте пластины в течение ночи при 37 ° С в термостате.
- На следующий день, забрать тарелки, которые имеют между 30 - 300 колоний. Выбросьте все остальное. Подсчитайте колонии на этих пластинах. В таблице 1 приведен пример отсчетов , полученных в аликвоте , который был сделан , когда OD 600 = 0,84. В этом примере одна из пластин (то есть, 10 -6 разведение) имели количество колоний в диапазоне 30 - 300 и использовали для расчета / мл CFU.
Примечание: Пластины с большимчем 300 колоний не используются, так как переполненность может препятствовать росту бактерий, а также делает его трудно различить и перечислить отдельные колонии. Пластины с числом <30 также не используются, поскольку небольшие ошибки в разведений или наличие загрязняющих веществ могут иметь большое влияние на точность отсчетов в нижнем конце диапазона. - Разделите количество колоний по объему гальванопокрытием, а затем умножить на коэффициент разбавления, чтобы получить значение / мл CFU для конкретного разбавления. В примере в таблице 1, счетчик на 10 -6 разбавления было 70. Разделите это значение на 0,1 мл , чтобы получить значение / мл CFU для разбавленной культуры. Затем умножьте эту величину на коэффициент разбавления (10 6) для получения / мл значение КОЕ неразбавленном культуры (7,0 × 10 8).
- Постройте OD 600 (ось у) в зависимости от времени в час (ось х) для определения логарифмической фазы роста 26.
Примечание: Этот CURV росте дает оценку КОЕ / мл дневной культуры при выращивании до определенного чтения OD. Выберите OD 600 чтение , которое находится в логарифмической фазе роста , который может быть использован в качестве целевого OD 600 для выращивания культур день. Эти данные теперь могут быть использованы для оценки КОЕ в культуре для приготовления инокулята (Процедура 3).
3. Подготовка посевного материала для экспериментальной инфекции с Л. моноцитогенес
Примечание: Эта процедура описывает получение инфекционного инокулята из современной культуры , которая была начата из ночной культуры (полученного в процедуре 2). Все эти этапы выполняются в BSC, если не указано иное.
- Подсчитайте число КОЕ, необходимое для заражения на основе количества мышей и опытно-конструкторских исследования. Добавьте соответствующий объем BHI сред в стерильную колбу Эрленмейера на вентилируемый или культуральную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: КОЕ бактерий рrepared будет зависеть от типа эксперимента, осуществленного. Для изучения NK и ответов NKT клеток во время инфекции, каждая мышь инокулируют 10 5 КОЕ бактерий (Процедура 6). Если изучение адаптивные Т - клеточные реакции на инфекцию или измерения бактериальной нагрузки, каждая мышь инокулируют 2 х 10 4 КОЕ бактерий (Процедура 8). Если изучать выживание конечных точек, каждая мышь засевают дозы LD 50 возбудителя (который составляет 10 5 КОЕ для мужчин и 1,5 × 10 5 КОЕ для женщин, см Процедура 9). - Инокулируйте трубки, содержащей BHI носитель с 100 мкл ночной культуры. Выдержите культуры в 37 ° C орбитальной качалке инкубаторе (225 оборотов в минуту) до целевого OD 600 достигается. Передача содержимого культуры в стерильную пробирку центрифуги.
- Центрифуга бактерии в гранулы в течение 5 мин при 6000 х г в центрифуге. Аспирируйте супернатант с использованием вакуума, прикрепленного к ловушке колбу, содержащую отбеливатель.
- Промыть гранулы дважды с 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), центрифугирование (5 мин при 6000 х г) между ними.
- Аспирируйте второй промывки и разбавленных бактерий в соответствующей концентрации в 1X PBS, чтобы доставить КОЕ интерес к каждой мыши в объеме 200 мкл.
Примечание: Лучше всего использовать коммерческий источник стерильного 1x PBS для умывания бактерий и для приготовления посевного материала , так как лаборатории стеклянную посуду можно ввести иммунологические загрязняющие вещества , такие как липополисахарида.
4. Экспериментальное заражение мышей с L. моноцитогенес
Примечание: Эта процедура описывает , как заразить мышей с инокулята , полученного в процедуре 3 и как проверить КОЕ доставлен в инокулята. Обработка мышей и инъекции выполняются в BSC.
- Заказать достаточное количество мужского или женского пола C57BL / 6J для эксперимента. Также заказать мышей служить в качестве неинфицированных контроля.
- Разрешить мышейакклиматизироваться за 1 неделю до бактериальной прививки.
Примечание: Это происходит потому , что стресс , связанный с перевозкой животных может вызвать временное увеличение производства гормона стресса и лимфопении 27,28. - В день прививки, получить базовый вес тела для каждой мыши и записать его в лаборатории ноутбука.
- В BSC, смешайте бактериальной суспензии вверх и вниз с помощью стерильной пипетки, чтобы гарантировать, что бактерии равномерно распределены и затем занимают 200 мкл посевного материала в 1 мл шприц безопасности сконструированного, снабженную иглой 25 G.
- Подайте IP мыши с 200 мкл приготовленного посевного материала (например, 10 5 КОЕ для инфекции NK клеток, Процедура 6). Для этой процедуры, загривок мышей с менее доминирующей рукой, захватывая свободную кожу вокруг плеч мыши. Убедившись, что мышь хорошо сдержанным, впрыснуть мышь в нижнем квадранте живота, только сбоку от мidline, чтобы избежать мочевого пузыря.
- Утилизировать иглу и шприц в биологическая_опасность контейнер для острых предметов.
- Повторите шаги 4.3 - 4.6, пока у всех мышей не вводили. Провести аналогичные шаги с 1x PBS вводили мышам (неинфицированных контроль).
Примечание: Поскольку CFU является оценкой , основанной на кривой роста, это также хорошая практика , чтобы проверить фактическое КОЕ в инокулята. Для этого, подготовить 3 - 4 различных разведений подготовленного посевного материала (с использованием 10-кратного разведения серии), которые вы ожидаете приведет к счетных колоний. Спред 100 мкл каждого разбавителя на в BHI агаром и инкубируют в течение ночи при 37 ° C. Подсчитывают колонии, и рассчитать фактические КОЕ / мл, как описано в процедуре 2.
5. Подготовка к нагреву убит L. моноцитогенес иммунных исследований
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги , которые имеют потенциал для создания аэрозолей выполняются в рамках BSC.
- Расти день культуры до OD 600 значений авновь достигли, что находятся в логарифмической фазе. Разлить культуры в 1,5 мл микропробирок.
- Инкубировать пробирки в 70 ° С на водяной бане в течение 1 часа, чтобы убить бактерии.
- Вымойте бактерии дважды 1x PBS, как в шагах 3.3 и 3.4. Ресуспендируют в стерильных средах RPMI полных содержащих фетальной телячьей сыворотки (FCS) (см Дополнительный файл 1 для рецепта) при концентрации 4 х 10 6 / мл. Алиготе убили бактерии в 2 мл стерильной криогенные флаконы и хранят при температуре -80 ° С.
- Подтверждение гибели бактерий путем распространения 100 мкл убитых нагреванием препарата бактерий на чашках с агаром с BHI и инкубирование в течение ночи при 37 ° С.
Примечание: Эти тепловые убитые бактерии должны быть готовы для стимуляции лимфоцитов в культуре в процедуре 8. Если есть какие - либо колонии , растущие на агаровой пластине BHI, повторить процедуру тепла убийство.
6. Измерение IFN-gamma ответных действий со стороны НК и НКТ-клеток во время инфекции
Примечание: Эта процедура описывает , как измерить ответов IFN-gamma от NK и NKT клеток у мышей через 24 часа после заражения 10 5 КОЕ L. моноцитогенес. Эта доза используется потому , что он вызывает устойчивые ответы IFN-gamma от NK и NKT клеток в селезенке 24. Провести все шаги в BSC. Для того, чтобы помочь сохранить жизнеспособность клеток, сохранить клетки на льду, когда это возможно и использовать ледяное буферов.
- Инокулируйте мышей , как описано в процедуре 4 с 10 5 КОЕ моноцитогенес L.. В то же время, впрыснуть неинфицированные контрольные мыши внутрибрюшинно равным объемом 1х PBS.
- Эвтаназии мышей через 24 часа после инокуляции СО 2 ингаляции в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
- Ли каждая мышь на правой стороне и намочить вниз кожу с 70% этанола с использованием бутыли.
- Использование асептические или стерильного пинцета и жесткие вырезать ножницами, надрезать кожу чуть ниже нижней части грудной клетки.
- Спрей внизобнаженный мышечный слой с 70% -ным этанолом. Селезенка должна быть видна под слоем мышц (открытой головкой стрелка на рисунке 1).
- Использование асептические или стерильного пинцета и тонких ножниц, надрезать мышечный слой, чтобы выявить селезенку. Осторожно возьмите селезенку с пинцетом и использовать тонкие ножницы, чтобы вырезать селезенку от окружающих соединительной ткани.
- Поместите селезенку в 15 мл коническую пробирку, содержащую стерильный 1x PBS.
- Половина заполнить стерильные чашки Петри со стерильной 1x PBS. Диссоциируют селезенку через нейлоновый клеточный фильтр 70 мкм в чашке Петри с использованием плоский конец стерильной 3 мл шприца.
- Перенос суспензии спленоцитов в чистую стерильную 15 мл коническую пробирку, используя стерильный 10 мл серологической пипеткой.
- Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Аспирируйте супернатант в ловушку колбу, содержащую отбеливатель. Ослабить осадок клеток, щелкая трубку с пальцем или переместив нижнюю трубувзад и вперед вдоль гофрированной поверхности (например, поток воздуха в отверстие КБС).
- Лизировать красные кровяные клетки, добавляя 1,5 мл аммоний-хлоридно-калия (ACK) буфера для лизиса (см Дополнительный файл 1 для рецепта) к каждой селезенки. После того, как ровно 1 мин и 15 сек, заполнить трубу с 1x PBS, чтобы остановить лизиса клеток.
- Центрифуга клетки, как описано в шаге 6.10. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл флуоресценцией сортировка клеток (FACS) Буфер (стерильными 1X PBS, содержащий 2% FCS).
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Для этого возьмите две аликвоты клеточной суспензии для подсчета. Добавьте 15 мкл каждой клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего (0,04%, путем разбавления 0,4% трипанового синего раствора в DDH 2 O). Нагрузка 15 мкл каждой ячейки / трипанового синего суспензии в камере гемоцитометра (то есть, один в верхней камере, один в нижней камере).
- С помощью микроскопа, пересчитать все не-голубые клеткипять больших площадей центральной сетки в каждой камере (рисунок 2). Возьмите этот счет и разделить его на 10 , чтобы получить число клеток в 10 6 / мл. В примере на рисунке 2, количество составляет 215 клеток в 5 квадратов; Таким образом, концентрация клеток составляет 21,5 х 10 6 / мл. Определяется среднее значение концентрации клеток, полученных из двух образцов.
- Семенной 1 × 10 6 клеток на лунку / пятно в 96-луночного круглым дном пластины для поточной цитометрии окрашивания. Убедитесь в том, чтобы также семена клеток для неокрашенных и флуоресценции минус один (FMO) управления. См рекомендуемый проточной цитометрии окрашивания панели в таблице 2.
Примечание: Для следующих шагов, рекомендуется сохранить клетки на льду или при 4 ° С и для защиты клеток от воздействия света с фольгой , когда флуорохромы присутствуют. Многоканальную пипетку можно использовать для дозирования жидкости в 96-луночных планшетах для окрашивания ускорить обработку. Будьте осторожны, чтобы не мешать осадок клеток приаспирационных супернатант из центрифугированных пластины. Окрашивание также может быть сделано в FACS труб, если центрифуга не оснащен адаптерами пластинчатых. Все центрифуга шаги с этого момента выполняются на 456 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. - Центрифуга пластину, а затем промыть клетки дважды буфером FACS. Одна стирка осуществляется путем добавления 200 мкл буфера FACS в каждую лунку и центрифугирование пластину, а затем аспирационных супернатант.
- Выполните этап блокирования путем добавления 50 мкл / лунку FACS буфера, содержащего анти-CD16 мыши / CD32 (очищенный Fc-блок) (0,5 мкг). Инкубируйте клетки при 4 ° С в течение 15 мин. Промыть клетки один раз в 1x PBS, как описано выше.
- Добавьте 100 мкл жизнеспособность красителя (поправимо жизнеспособность красителя разводили 1: 1000 в 1x PBS) к клеткам. Пятно клетки при 4 ° С в темноте (в холодильнике) в течение 30 мин. Промыть клетки дважды в буфере FACS, как описано выше.
- После второй промывки, добавляют 100 мкл клеточной поверхности антител или тетрамеры в соответствующие лунки по тO панель окрашивания , описанный в таблице 2. Пятно клетки при 4 ° С в темноте (в холодильнике) в течение 30 мин. В это время также добавляют антитела для окрашивания одного положительного и FMO управления.
Примечание: В отношении одного положительного контроля, рекомендуется либо спленоцитов использования , которые окрашивают с различными флуорохромом версиями антитела CD4 или коммерческих бусин компенсации , которые окрашивали антителами , используемых в панели. Перед проведением этой процедуры окрашивания, все антитела FACS должны подбираться в тестовых исследованиях, чтобы определить оптимальные концентрации для окрашивания. - Промыть клетки дважды в буфере FACS , как описано выше , и затем зафиксировать клетки путем ресуспендирования их в 50 мкл 4% параформальдегида (16% параформальдегидом разбавленный раствор в DDH 2 O) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: параформальдегид является токсичным и должны быть обработаны только в вытяжном шкафу.
- Вымойте клетки дважды яп FACS буфера, центрифугирование между ними. Ресуспендируют клеток в буфере FACS. Перейдите к следующему шагу или хранить клетки в холодильнике, защищенном от света до трех дней.
- Центрифуга клетки, удалить супернатант и промыть клетки в два раза с 150 мкл 1x пермеабилизирующего / промывочного буфера (Пермь / промывочного буфера), центрифугирование между ними. Пермь / промывочного буфера получают из 10 - кратного запаса путем разбавления 1: 9 (об / об) в DDH 2 O.
- После второй промывки, клетки вновь суспендируют в 150 мкл / Пермь промывочного буфера и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
- Центрифуга клетки, а затем снова аспирата супернатант. Ресуспендируют клеток в 50 мкл буфера 1x Пермь / промывочного содержащих анти-IFN-gamma и инкубировать в течение 1 ч при 4 ° С в темноте.
- Вымойте клетки дважды с буфером 1x Пермь / промывочного, центрифугирование между ними. Ресуспендируют клеток в 250 мкл буфера FACS, а затем передать клетки в FACS труб.
- Перейдите к проточной цитометрии приобретения с использованием cytomet потокаэр , который имеет соответствующую конфигурацию лазера и набор фильтров к различению флуорохромии , используемых в окрашивании панели , описанной в таблице 2 , 29. Соберите по крайней мере, 200000 событий в образце и 10000 событий для контроля компенсации.
- Применить матрицу коррекции и анализа данных с помощью программного обеспечения для анализа потока цитометрии 30.
7. Измерение бактериальной нагрузки в селезенке и печени во время пика инфекции
Примечание: Все операции выполняются в BSC , если не указано иное.
- Инокулируйте мышей внутрибрюшинно 2 х 10 4 КОЕ патогена с использованием процедур , описанных в процедуре 4.
- На 3-й день после заражения, готовят стерильные 1,5 мл микроцентрифужных труб, каждая из которых содержит 500 мкл охлажденного льдом стерильный 0,1% Тритон Х-100 в 1x PBS и 0,2 - 0,3 г 1,5 - 2 мм кислоты вымытые стерильные стеклянные бусы. Взвесить каждую пробирку.
Примечание: Стеклянные бусины кислоты промывают INCUза исключением в 10% -ной уксусной кислоты в химическом стакане на магнитной мешалке в течение 1 ч. Эти гранулы затем интенсивно промывают DDH 2 O , чтобы удалить кислоту, сушат на воздухе, а затем выдерживают в автоклаве перед использованием. - Эвтаназии мышей от воздействия CO 2.
- Для рассечения органов, лежало животное на своей спине на секционном доске и прикрепить конечности мыши к плате с помощью 25 G иглы. Дезинфекцию кожи смачиванием 70% -ным этанолом.
- Используя стерильные жесткие вырезать ножницами, сделать срединный разрез в коже от паха до середины груди, а затем от середины паховой к каждому колену и от середины груди к каждому локтя. Блант рассекают и отражать обратно кожу, прижав ее открыть с помощью 25 G иглы.
- Дезинфекцию мышечный слой путем смачивания его с 70% -ным этанолом, а затем с помощью стерильных тонких ножниц делают срединный разрез в брюшной стенке. Захватите мечевидного отростка с пинцетом. Затем, используя те же тонких ножниц, делают разрезы в брюшную стенку от мечевидного процеSS в боковом направлении с каждой стороны, следуя грудной клетки, как раз под диафрагмой, чтобы выявить печень.
- Вырежьте мг кусок ~ 100 печени (использовать тот же лопасть для всех мышей) с помощью стерильных ножниц и поместить его в предварительно взвешенную 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Используйте пинцет, чтобы аккуратно оттеснить органы на левой стороне брюшной полости, чтобы визуализировать селезенку. Осторожно возьмите селезенку с парой щипцов и выпустить его из брюшной полости путем срезания окружающей соединительной ткани.
- Поместите селезенку в предварительно взвешенную 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую шарики. Транспорт тканей в лабораторию в герметичного контейнера, содержащего лед. Повторно взвесить все пробирки, содержащие органы для определения веса ткани в мг.
- Однородный ткани путем встряхивания пробирки с использованием мельницы гомогенизатора шарик в течение 3 мин при частоте 30 Гц.
Примечание: Метод бисерной мельницы является предпочтительным для гомогенизации , как она поддается для предпосепоют большое количество образцов и создает меньше беспорядка и потенциального воздействия патогенных микроорганизмов. Тем не менее, автоматические гомогенизаторы или автоклавируют 2 мл ручной стеклянные гомогенизаторы ткани могут быть использованы в качестве альтернативы. - Готовят 10-кратное разведение серии гомогенатах в 0,1% Тритон-Х-100 в 1x PBS, начиная от (от неразбавленный до 10 -7).
- Спред по 100 мкл каждого разведенного гомогената на в BHI агаром (в дубликате) с помощью стерильного шпателя. Передача пластины с С-инкубаторе 37 ° и инкубировать в течение ночи.
- Держите пластины, которые содержат от 30 до 300 колоний / чашка, остальное отбрасывают. Количество колоний на каждой пластине и определяют среднее число колоний для дублированных спредов.
- Рассчитывают КОЕ / мг В соответствии со следующим уравнением:
КОЕ / мг = КОЕ / мл в гомогенате, умножаются на мл гомогената, полученного, деленное на мг веса ткани гомогенизируют.
Примечание: Например, если среднее значение 30 Colonies подсчитывали после засева 100 мкл 10 -2 разбавленного гомогената , полученного из 120 мг кусочком печени , который гомогенизируют в 0,5 мл, расчеты будут выглядеть следующим образом :
КОЕ (коэффициент разбавления) / мл = 30 колоний х 100 / 0,1 мл (объем спред) = 30 000 КОЕ / мл.
КОЕ / мг = 30000 КОЕ / мл х 0,5 мл гомогената / 120 мг ткани = 125 КОЕ / мг.
8. Эффекты L. моноцитогенес на IFN-gamma Ответы на CD4 + и CD8 + клеток
Примечание: Эта процедура описывает , как измерить IFN-gamma производства по селезеночной CD4 + и эффекторных клеток CD8 + Т - заготовленную во время пика адаптивного иммунного ответа (~ 7 дней после заражения) , используя два метода: (1) потока цитометрии для измерения IFN-gamma CD4 + и CD8 + клеток с помощью внутриклеточного окрашивания цитокина, и (2) ELISA для измерения общего уровня IFN-γ , произведенные спленоцитов (включает в себя все Т - клетки). процедурывыполняются в BSC.
- Infect мышей путем инъекции внутрибрюшинно с помощью 2 х 10 4 КОЕ патогена с использованием процедур , описанных в процедуре 4.
- На 7 -й день после заражения, усыпить мышей СО 2 ингаляции в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
- Рассеките селезенку (как описано выше) и место в 15 мл коническую пробирку, содержащую стерильный 1x PBS. Транспортировка труб в лабораторию в герметичного контейнера, содержащего лед.
- Процесс Селезенки в суспензии отдельных клеток, лизировать эритроциты, как это описано в разделе 6, а затем ресуспендирования клеток в средах RPMI полных, содержащей 10% FCS. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- Настройка культур для измерения откликов IFN-gamma. Для этого дозирующих клеток (4 х 10 6 в 1 мл / лунку) в 24-луночных планшетах вместе с равным числом и (4 х 10 6 или 1 мл / лунку) размороженных убитых нагреванием L. моноцитогенес (полученного в процедуре 5) , Передача клетки в 37° C инкубатор.
- После 20 ч инкубации добавляют 0,66 мкл / мл ингибитора белка транспорта в лунки и продолжают инкубацию.
- Четыре часа спустя, перенос пластины в BSC и собирают 500 мкл супернатанта культуры и заморозить (при -80 ° С) для последующего измерения IFN-gamma уровней с использованием коммерческого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) , комплект 31. Затем собирают клетки в стерильный 15 мл пробирку. Промыть лунки с 1x PBS и объединить эту стирку вместе с собранными клетками.
- Проведение клеточной поверхности окрашивания и внутриклеточное окрашивание для IFN-gamma на CD4 + и CD8 + клеток , как описано в процедуре 6 , за исключением использования окрашивающего панели , описанной в таблице 3. Перейдите к проточном цитометре приобретения (сбор 200000 событий / образец) и анализ данных 29 с помощью проточной цитометрии анализа программного обеспечения 30.
9. Измерение мыши выживания к Endpoints после того, как Л. моноцитогенес Infecции
Примечание: Эта процедура описывает влияние агента на выживаемость мышей к конечным точкам после инфекции с модифицированной LD 50 дозы возбудителя. Все эти процедуры проводятся в BSC в виварии.
- Inject мышей внутрибрюшинно с модифицированной LD 50 дозы L. моноцитогенес , как описано в процедуре 4. Это было определено , что 10 5 КОЕ (для мужчины) или 1,5 × 10 5 КОЕ (для женщин) 31.
- Следуйте мыши два раза в день по клиническим признакам и записывать эти знаки и веса тела животного в лаборатории ноутбука. Эвтаназии мышей, если они показывают потерю 20% веса тела или двух клинических признаков листериоза (вялость, взъерошенные мех, выгибание спины, затрудненное дыхание, тусклые или запавшие глаза).
- Через 14 дней, эвтаназии выживших мышей с помощью CO 2 ингаляции.
- Подготовить Каплана-Мейера участков данных путем построения графика процент выживаемости каждой группы в зависимости от времени 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3 приведены некоторые типичные проточной цитометрии окрашивания IFN-gamma в селезенке NK и NKT клеток через 24 часа после заражения 10 5 КОЕ возбудителя. На этом рисунке также иллюстрирует стратегию стробирования для окрашивания панели , описанной в Таблице 2. На рисунке 4 показаны некоторые репрезентативные данные , которые были получены в одном эксперименте , в котором самцов мышей обрабатывали антагонистом PPAR , IS001 или контрольный носитель, зараженных 10 5 КОЕ L. моноцитогенес, а затем анализировали на IFN-gamma в НК и НКТ клеток через 24 часа , На этом рисунке показано, что лечение с помощью IS001 росту ответов IFN-gamma клетками NKT, но не NK клеток после инфицирования патогеном. На рисунке 5 показан репрезентативный для окрашивания IFN-gamma в селезеночной CD4 + и CD8 + Т - клеток в течение 7 дней после инфицирования после повторной стимуляции с экс виво убитых нагреванием в годthogen. На этом рисунке также показана стратегия стробирования для окрашивания панели , описанной в таблице 3. На рисунке 6 показаны репрезентативные данные , которые были получены в одном эксперименте , в котором самцов мышей обрабатывали ежедневно с антагонистом IS001 , либо контрольный носитель PPAR , заражают сублетального дозой L. моноцитогенес, и анализировались на 7 дней после заражения. Этот эксперимент показывает , что лечение с помощью IS001 усиливается IFN-gamma ответов обоими CD4 + и CD8 + лимфоцитов. На рисунке 7 показаны репрезентативные данные исследования , которые исследовали влияние антагониста IS001 PPAR , на выживаемость мышей с конечными точками после заражения с модифицированным LD 50 дозы возбудителя. Нанесенными это процент выживаемости мышей, в зависимости от времени после заражения. На этом рисунке показано, что лечение с помощью IS001 повышает выживаемость мышей-самцов к конечным точкам. В совокупности эти данные показывают, как эта модель может быть применена для исследованияэффекты новых лекарств или методов лечения на IFN-γ ответы в естественных условиях и исследовать , как эти изменения влияют на иммунные выживаемости животных от инфекции.
Рисунок 1. Анатомический селезенке от инфицированных мышей. Эта серия фотографий показывает, как рассекают селезенку с мертвой мыши. (а) Ли мышь на правой стороне и распылить вниз кожу с 70% этанола. (б) с использованием асептических или стерильного пинцета и жесткие вырезать ножницами, надрезать кожу чуть ниже нижней части грудной клетки. (с) Spray вниз обнаженный мышечный слой с 70% этанола. Селезенка должна быть видна под слоем мышц (открытой головкой стрелка). (d) с использованием асептических или стерильного пинцета и тонких ножниц, надрезать мышечный слой , чтобы выявить селезенку. (е) Осторожно возьмите селезенку с пинцетом и USE тонкие ножницы, чтобы вырезать селезенку от окружающих соединительной ткани. (е) Поместите селезенку в 15 мл коническую пробирку , содержащую стерильный 1x PBS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Подсчет спленоциты с помощью гемоцитометра. (а) показывает центральную сеточными гемоцитометра. (б) показывает увеличенный вид центральной сетки , которая содержит 25 больших квадратов (каждый из которых содержит 16 меньших квадратов). Пять больших площадей, используемых для подсчета, выделены серым цветом (4 угловых квадратов плюс центральной площади в центральной сетке). (с) показывает увеличенный вид одной из больших серых квадратов. Для определения объема клеток в 10 6 / мл, первый отсчетвсе жизнеспособные клетки в пределах пяти крупных серых квадратов. В приведенном примере это число составляет 215. При подсчете, убедитесь, что рассчитывать только все ясно (не-голубых) клеток, в том числе те, которые касаются двойные линии на правой и нижней части сетки. Не рассчитывайте клетки трогательные двойные линии на левой и верхней части сетки. Возьмите общее количество пяти квадратных и разделить его на 10 , чтобы получить число клеток в 10 6 / мл. В примере, 215 делится на 10 составляет 21,5 х 10 6 клеток / мл. Обратите внимание, что эти расчеты работают только тогда, когда вы рассчитываете 5 из больших квадратов, как выделены и разбавить ваши клетки 1: 1 в трипановым синим. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Стратегия Gating для обнаружения IFN-Г Производство в НК и НКТ-клеток. Во-первых ворот на лимфоцитов на FSC-A по SSC-сюжет. Затем ворота на те события, которые по диагонали на FSC-H / FSC-A участка. Это синглеты. Тогда ворота в прямом (AmCyan -) и CD8 - клеток. Затем построить тетрамерное окрашивание против TCR & beta;. В NKT клетки находятся в пределах двойной положительной популяции и клетки NK находятся в пределах двойного отрицательного населения. Ворота на двойных положительных клеток, и участок NKp46 по сравнению с FSC. Ворота на отрицательной популяции NKp46, которые являются НКТ-клеток (эти ворота могут быть установлены путем нахождения точки разделения в двух популяциях из клетки участке NK). Клетки NK являются тетрамер - TCR & beta ; - NKp46 + население. Внутри ворот клеток НК и НКТ, что IFN-gamma + клеток в канале PE идентифицируются после установки ворот на основе управления ФМО. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель данных , полученных для частот IFN-gamma + NK и NKT клеток через 24 часа после заражения. В этом эксперименте самцов C57BL / 6J мышей (n = 3 - 4 / группу) были инфицированы внутрибрюшинно 10 5 КОЕ L. моноцитогенес или остались не-инфицированных. Мыши были также введены в IS001 лекарство или носитель (0,5% карбоксиметилцеллюлоза), в то же время инокуляции и 12 ч позже. Через двадцать четыре часа после прививки, мышей умерщвляли и селезенки были удалены, и были обработаны по отдельности и окрашивают для проточной цитометрии. Изображены среднее значение ± SEM частоты от IFN-gamma + клеток в NK (а) или ворота НКТ - клеточные (б) в неинфицированных или инфицированных мышей после обработки транспортного средства или IS001 наркотиков. * УкажитеРазница са (P <0,05) от управления транспортным средством двумя хвостами T-тест. Данные перепечатывали из 31 с разрешения журнала Immunology (объем 195, стр. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Gating Стратегия для обнаружения IFN-gamma производства в CD4 и CD8 клеток. Во-первых ворот на лимфоцитов на FSC-A заговорами SSC-A. Затем ворота на те события, которые по диагонали на FSC-H / FSC-A участка. Это синглеты. В эти ворота, ворота на живых (AmCyan -) CD45 + клеток. Затем ворота на популяции либо CD8 + или CD4 +. Внутри каждого ворот, IFN-γ +Клетки в канале PE идентифицированы путем сравнения окрашивание с контролем ФМО. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Представитель Данные , полученные для частот IFN-gamma + CD4 + и CD8 + Т - клеток на 7 -й день после заражения L. моноцитогенес (ЭГД штамма). В этом эксперименте, C57BL / 6J самцов мышей инфицировали внутрибрюшинно с 2 х 10 4 КОЕ L. моноцитогенес (N = 7 / группа) или оставляли неинфицированным (N = 3 / группа). Мышей также управляла IS001 наркотиков или носитель (0,5% карбоксиметилцеллюлоза) два раза в день, начиная со дня прививки. Через семь дней мышей умерщвляли и селезенки были удалены, и были обработаны по отдельности длякультура клеток. Мононуклеарных клеток спленоцитов стимулировали в течение 24 часов с убитых нагреванием L. моноцитогенес с протеином ингибитора транспортировки добавленными для окончательного 4 ч культуры. Затем клетки окрашивали для проточной цитометрии. Изображены среднее значение ± SEM частоты от IFN-gamma + клеток в CD4 + (а) или клеточные ворота CD8 + (б) в неинфицированных или инфицированных мышей после лечения с транспортным средством (0,5% карбоксиметилцеллюлоза) или IS001 наркотиков. * Указывает на разницу (р <0,05) от контрагента управления транспортным средством, как это определено двумя хвостами испытания Т. Данные перепечатывали из 31 с разрешения журнала Immunology (объем 195, стр. 5189-5202, 2015) .copyright 2015 Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Представитель Данные , полученные в ходе эксперимента , который сравнил эффект PPAR , Антагонистов 1S001 на мышах выживания к Endpoints после заражения самцов C57BL / 6J мышей с L. моноцитогенес (ЭГД штамма). В этом эксперименте самцов C57BL / 6J мышей (N = 10 мышей / группу) были инфицированы внутрибрюшинно с модифицированной LD 50 дозы патогена (10 5 КОЕ) из L. моноцитогенес. Мышей также управляла IS001 наркотиков или носитель (0,5% карбоксиметилцеллюлоза) два раза в день, начиная со дня прививки. Мышей ежедневно наблюдали на клинические признаки и были подвергнуты эвтаназии, если были выполнены гуманные конечные точки. Показана процент выживаемости мышей, к конечным точкам с течением времени * указывает на различие в выживаемости между группами, как определено с помощью теста лог-ранга (P <0,05). Данные перепечатывали из 31 с разрешения журнала Oе Immunology (объем 195, стр. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Показывает некоторые репрезентативные расчетов для нахождения КОЕ в аликвоте День культуры. В этом примере, аликвоту дневной культуры был принят и разводили 1: 1 с BHI средах. Наружный диаметр 600 данного разбавленного образца было определено в размере 0,84. Кроме того, 100 мкл аликвоты было принято для определения CFU. Этот образец разбавили 900 мкл BHI сред (10 -1) и промывали и ресуспендировали в 1 мл BHI. Готовили 10-кратное разведение серии этого образца (10 -2 до 10 -9) и разведенные образцы высевали на BHI AGAR пластины (только значения 10 -4 до 10 -9 показаны). На следующий день колонии подсчитывали. Только те плиты , которые имели числа колоний между 30-300 были рассмотрены для расчета (т.е. 10 -6 пластины, выделены желтым цветом). Число колоний на этой пластине (70), затем делили на 0,1 (объем в мл плакированной), чтобы получить КОЕ / мл разведенной пробы. Это значение затем умножается на коэффициент разбавления (10 6) для получения КОЕ / мл чтение неразведенном культуры. TMTC = слишком много, чтобы сосчитать.
Таблица 2: Окрашивание панель для обнаружения IFN- у в НК и НКТ - клеток. Обратите внимание, что либо компенсационные бусин окрашивали антителами потока, используемых в панели или спленоцитов окрашивали с различными флуорохромом версиями CD4 клон антитела GK1.1 могут быть использованы в качестве одного положительного контроля,,
Таблица 3: Окрашивание панель для обнаружения IFN- у в CD4 + и CD8 + клеток. Обратите внимание, что либо компенсационные бусин окрашивали антителами потока, используемых в панели или спленоцитов окрашивали с различными флуорохромом версиями CD4 клон антитела GK1.1 могут быть использованы в качестве одного положительного контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем протокол о том , как проводить основную экспериментальную инфекцию штамма EGD из L. моноцитогенес 25 самок и самцов C57BL / 6J. Этот протокол был создан с целью изучения влияния нового малую молекулу IS001 на производство IFN-gamma врожденным и адаптивным лимфоцитов в естественных условиях 31. Контролируя бактериальный клиренс и выживаемости после инфицирования, идеи были получены в то, как эти изменения в IFN-gamma влияет на способность хозяина контролировать инфекцию.
Критические соображения в Протоколе
Важным фактором при разработке данного вида исследования является то, что каждый эксперимент быть адекватной мощности и надлежащим образом регулировать. Из - за биологической изменчивости иммунного ответа на инфекцию (см рисунки 4 и 6), рекомендуется , чтобы N = 4 - 5 мышей на группу следует использовать для исходных иммунных исследований. Еслиосле эти исследования наблюдается тенденция в данных, но нет существенной разницы между группами очевидно, расчет мощности может быть сделано, чтобы определить наименьшее число животных, необходимых в последующих исследованиях для достижения статистической значимости. Что касается управления, то важно включить неинфицированных контроля для определения исходных реакций IFN-gamma для иммунных исследований и управления транспортного средства, чтобы помочь отличить эффект лечения от стресса, связанного с введением лечения. Другим важным фактором является выбор времени лечения. Так как врожденное ответ на L. моноцитогенес очень быстро, рекомендуется , чтобы первая обработка вводят в день до, или в то же самое время , как, прививки , с тем чтобы обеспечить , что терапевтические уровни реагента быть добились до инициирование врожденного иммунного ответа.
Еще одним важным фактором является доза возбудителя, чтобы использоваться для infectioп. Доза сублетальная рекомендуется для измерения бактериальной нагрузки, так как это увеличивает вероятность того, что возбудитель будет сосредоточено в селезенке и печени, что позволяет для более точного подсчета бактерий. Доза сублетальная также рекомендуется для перечислении IFN-gamma ответов адаптивными лимфоцитов, чтобы гарантировать, что животные не поддаются листериоза до времени расширения пика Т-клеток. В отличие от этого, рекомендуется более высокая инфекционная доза использоваться для измерения раннего ответа НК и НКТ клеток через 24 часа, с тем, чтобы максимизировать производство IFN-gamma этими клетками.
Классическое ЛД 50 является доза патогена , что приводит к 50% летальности мышей. Поскольку смерть не является приемлемой конечной точкой в нашем учреждении, и поскольку многие симптомы листериоз может предсказать животное, является ли вероятность поддаться инфекции, мы использовали определенный список клинических признаков вместо смерти в качестве конечной точки в наших исследованиях. Usiнг этот метод, было установлено , что модифицированный ЛД 50 10 5 КОЕ в течение 8-недельных самцов и 1,5 х 10 5 КОЕ в течение 8-недельных самок мышей C57BL / 6J мышей 31. Эти ЛД50 дозы были определены путем измерения процента выживаемости мышей к конечным точкам в ступенчатых исследованиях эскалации дозы (N = 5 исследований в общей сложности) , что каждый содержал N = 8 мышей на группу (например, мышей инфицировали сначала с 10,000 CFU , то вторая партия с 20,000 CFU и т.д.). Расчет LD 50 определяли из регрессионной участка бревна (КОЕ) (ось х) по отношению к пробит значений выживания процента (ось у) (веб - сайт: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit~~pobj /ProbitAnalysis.pdf).
Обратите внимание , что модифицированный LD 50 дозы определяется в нашей лаборатории может отличаться от той , в другой лаборатории , даже при заражении мышей с того же штамма L. моноцитогенес. Часть этой изменчивости может быть связана с субъективной природы OF мониторинг клинических признаков листериоза по сравнению с более абсолютной конечной смерти. Дополнительная изменчивость может быть результатом различий в экологических факторов, таких как диета мышь или микробиоты или различий в подготовке посевного материала между лабораторий. Таким образом, рекомендуется перед началом любого исследования выживаемости, экспериментальное исследование проводить где самок мышей (N = 8 мышей / группа) заражены 1,5 × 10 5 КОЕ того же штамма L. моноцитогенес, используемый в этом изучить и симптомы отслеживаемые, чтобы определить, является ли эта доза действительно приводит к выживанию 50% до конечных точек. Если выживаемость ниже или выше , чем 50% при этом КОЕ, пошаговый увеличение дозы или дозы исследования Деэскалация может быть выполнена быстро сужаться в от дозы LD 50.
Другим важным фактором является штамм или подштамма мышей, используемых для исследования инфекции. Этот протокол описывает инфекцию часто используемых инбредных штамм мыши C57BL / 6J. Эта Штамм хорошо подходит для измерения IFN-gamma ответов , так как эта мышь считается Th1 - подверженным деформации 33 и , как следствие, относительно устойчив к L. моноцитогенес инфекции ( по сравнению с Th2 , склонных к мыши штаммов , таких как BALB / с) 34,35. Адаптация этот протокол к другим штаммам мыши потребует знания инфекционной дозы возбудителя для конкретного штамма. Кроме того, рекомендуется использовать мышей того же возраста, пола и поставщика, как указано в этом протоколе, с тем чтобы уменьшить количество поиска неисправностей, участвующих в создании модели. Например, мышей C57BL / 6 заказал у одного поставщика (например, C57BL / 6J) могут демонстрировать генетические различия , чем C67BL / 6 мышей , заказанных у другого поставщика (например, C57BL / 6NTac) 36. Кроме того, кишечная микрофлора отличается от C57BL / 6 субштаммах , полученные от разных производителей, которые могут повлиять на баланс Th1 и Th17 ответов у мышей 37.
ove_title "> Потенциальные Изменения в техникеМыши, которые наиболее часто заражают внутрибрюшинно или внутривенно, в отличие от естественного пути инфекции в организме человека, который через желудочно-кишечный тракт. Устные инфекции менее распространены , потому что стандартные штаммы L. моноцитогенес неэффективное заражают кишечный эпителий мышей 38. Это происходит потому , что существует единственное изменение аминокислоты в последовательности мыши E-кадгерина из Е-кадгерина человека , что приводит к потере признания Е-кадгерина по listerial белка вторжения, internalin A (МИС) 39. Чтобы преодолеть этот барьер, исследователи используют мышей , которые являются трансгенными для человеческого белка Е-кадгерина или использовать листериоз , которые были разработаны , чтобы выразить видоизмененный последовательность INIA (МИС MUT) , который связывается с мыши E-кадгерина с такой же аффинностью , как WT ФГДС для Е-кадгерина человека 40. Таким образом, потенциал модификации этого метода является то, чтобы заразить мышей с помощью пероральном, Отсылаем читателя к другой публикации Jove , которая описывает устные методы 38 прививки. Обратите внимание, что изменение режима инфекции будет влиять на инфекционную дозу, а также кинетики распространения возбудителя.
Этот протокол описывает использование убитых нагреванием листериоз , чтобы вызвать продукцию IFN-gamma CD4 + и CD8 + Т - клеток. Термически убит L. моноцитогенес был выбран в качестве стимула в наших исследованиях, потому что этот антиген является недорогим и потому , что наша лаборатория была в первую очередь заинтересованы в ответах CD4 + Т - клеток к возбудителю. Одно ограничение заключается в том , что тепло убитые бактерии эффективно не простые CD8 + ответы Т - клеток либо в пробирке 41 или в естественных условиях 42,43 инфекции. Таким образом, производство CD8 + Т - клеток IFN-γ , который мы наблюдали спленоцитов добываемых на пике инфекции (то есть, рисунок 6) , вероятно , в ответ на остаточнуюживые бактерии , присутствующие в спленоцитов или был индуцированные в результате цитокин-индуцированной цитокином выпуск 41. В качестве альтернативы убитых нагреванием листериоз, можно также вызывать IFN-gamma ответов исключая виво при воздействии Т - клеток пептидов , кодирующих эпитопы на listerial белков. Действительно, иммунодоминантная ГКГ класса II с ограничением эпитопы для listeriolysin O и p60 гидролазы и описаны для мышей C C57BL / 6 и BALB / и иммуногенные детерминанты MHC класса I, были описаны для BALB / C 44. Еще один подход заключается в инфицировании мышей штаммов L. моноцитогенес , которые были сконструированы для экспрессии модели антигены , такие как овальбумин или вирусных антигенов , с тем , чтобы воспользоваться существующими MHC класса I- и МНС класса II-тетрамер реагентов для перечисления антиген-специфических Т - клеток у инфицированных мышей 45,46.
Другие ограничения протокола
Другим ограничением этой модели является то, что он опроизводство олько меры ИФН-γ с помощью иммунных клеток в селезенке. В дополнение к использованию тетрамеров к пронумеровать антиген - специфических Т - клеток (овальбумина , экспрессирующих варианты L. моноцитогенес), проточной цитометрии окрашивания панелей , описанных здесь , может быть легко модифицирован для измерения производства других цитокинов , таких как TNF или IL-2 , или эффекторные молекулы, которые участвуют в CD8 T-клетки или NK-опосредованной гибели возбудителя, таких как перфорина или гранзимом В. Кроме того, этот протокол также может быть адаптирована для изучения IFN-gamma, вырабатываемые иммунной клетки печени.
Будущие приложения
После того, как этот протокол освоен, он может служить простой в модели естественных условиях для скрининга воздействия различных агентов или генов на Th1 и клеточного иммунитета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 1x in ddH2O |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Use one drop per stain |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 ml vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL/6J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 weeks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0 - 300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnostics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A.
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
- Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
