Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية تطعيم C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من المستوحدة الليستيريا (اللستيريا L.) وقياس الإنترفيرون γ (IFN-γ) ردود القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، القاتلة الطبيعية الخلايا التائية (NKT)، والتكيف الخلايا اللمفية تي بعد الإصابة. يصف هذا البروتوكول أيضا كيفية إجراء دراسات البقاء على قيد الحياة في الفئران بعد الإصابة مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض.
Abstract
اللستيريا L. هي نوع من البكتيريا إيجابية الجرام التي هي سبب الأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر. وكانت العدوى التجريبية من الفئران مع هذا الممرض بالمعلومات كبير على دور الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية والسيتوكينات محددة في الحصانة المضيف ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا. إنتاج الإنترفيرون γ الخلايا الفطرية خلال العدوى دون المميت مع المستوحدة L. مهم لتفعيل الضامة والمكافحة المبكرة من مسببات المرض 1-3. وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا الليمفاوية الذاكرة التكيف مهم لفتيلة تنشيط الخلايا الفطرية على الإصابة مرة أخرى 4. وL. المستوحدة نموذج العدوى بالتالي بمثابة أداة عظيمة للتحقيق في ما إذا كانت العلاجات الجديدة التي تهدف إلى زيادة إنتاج الإنترفيرون γ لها تأثير على ردود الإنترفيرون جاما في الجسم الحي ولها آثار بيولوجية الإنتاجية مثل زيادة إزالة البكتيريا أو تحسين البقاء على قيد الحياة الماوس من عندعدوى. وصفت هنا هو بروتوكول الأساسي لكيفية إجراء التهابات في الغشاء البريتوني من C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من المستوحدة L. ولقياس إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، والخلايا الليمفاوية التكيف التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، وصفت الإجراءات ما يلي: (1) النمو وتعد البكتيريا للتلقيح، (2) قياس الحمولة الجرثومية في الطحال والكبد، و (3) بقاء التدبير الحيوان إلى النهاية. يتم توفير بيانات تمثيلية أيضا لتوضيح كيفية هذا النموذج العدوى يمكن استخدامها لاختبار تأثير عوامل معينة على الردود IFN-γ إلى المستوحدة L. وبقاء الفئران من هذه العدوى.
Introduction
IFN-γ هو خلوى أن أمر حاسم للوساطة مناعة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا والسيطرة على نمو الورم 5. أهمية هذا خلوى في مقاومة البكتيريا هو واضح في الملاحظة بأن البشر مع طفرات في إشارة مسار IFN-γ هي عرضة للإصابة مع المتفطرات وsalmonellae 6. وبالمثل، الفئران التي تعاني من نقص في أي من الإنترفيرون γ أو العيوب مستقبلات المعرض الإنترفيرون جاما في مقاومة المتفطرات 7-9 وغيرها من مسببات الأمراض داخل الخلايا بما في ذلك L. المستوحدة 10،11، الليشمانيا الرئيسي 12، السالمونيلا التيفية الفأرية 13، وبعض الفيروسات 11. بالإضافة إلى مسببات الأمراض مكافحة، يلعب IFN-γ دورا حاسما في الدفاع المضيف ضد الأورام 14. على الرغم من ارتفاع إنتاج الإنترفيرون γ هو مفيد في سياق العدوى أو السرطان، والإنتاج لفترات طويلة من هذا خلوى ارتبط رس تطوير مناعة ذاتية جهازية 15-17 وتسارع من نوع الأول من مرض السكري في غير البدناء نموذج الفأر السكري 18.
وتشمل المصادر الرئيسية للIFN-γ الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، γδ خلايا T، المساعد 1 خلايا T (TH1)، والخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL) 5،19،20. IFN-γ يعزز كلا المناعة الفطرية والتكيفية من (1)، حتى تنظيم التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC) من الدرجة الأولى والثانية التعبير، (2) زيادة التعبير عن جزيئات شارك في تنشيطية على خلايا مقدمة للمستضد، (3) تعزيز البلاعم العوامل البلعمة وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات وميكروبات (على سبيل المثال، وأكسيد النيتريك وأنواع الاكسجين التفاعلية)، (4) تعزيز تمايز الخلايا CD4 + T ساذجة إلى خلايا المستجيب TH1، (5) تشجيع التحول من الدرجة الأجسام المضادة للالمناعي ( IG) 2A و IgG3 (في الماوس)، (6) يحفز إنتاج كيموكينات لتجنيد الخلايا المناعية لمواقع طnfection، و (7) تعزيز الخلايا القاتلة الطبيعية وردود CTL 5،19. نظرا للأهمية الحاسمة من الإنترفيرون γ في استجابة المضيف لمسببات الأمراض والأورام، وقد تم اختبار المؤتلف الإنترفيرون γ كعلاج لمختلف الأمراض والأورام الخبيثة (التي استعرضت في 19). ومع ذلك، لأن إدارة النظامية من الإنترفيرون γ أو TH1 تعزيز خلوى انترلوكين 12 (IL-12) ويرتبط مع الآثار الجانبية والسمية 19،21 المتعلقة جرعة، هناك مصلحة في وضع استراتيجيات بديلة لزيادة إنتاج الإنترفيرون جاما من قبل الخلايا المناعية. تطوير البيولوجية الجديدة والجزيئات الصغيرة تتطلب في أدوات فيفو فحص لاختبار ما إذا كان هذه العوامل زيادة إنتاج الإنترفيرون γ خلال الاستجابة المناعية وإذا كان هذا يترجم إلى تأثيرات بيولوجية ذات مغزى مثل الزيادات في البقاء على قيد الحياة الحيوانية.
وكانت العدوى التجريبية من الفئران مع بكتيريا اللستيريا L. إيجابية الجرام نموذج فعال لفك رموز دور الإنترفيرون γ في المضيف مناعة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا 1،22. إصابة الفئران مع الممرض عن طريق الوريد أو داخل الصفاق (IP) يؤدي إلى الانتشار السريع للبكتيريا إلى الطحال والكبد، حيث تصبح داخليا من قبل الضامة المقيمة وخلايا الكبد مع الحمل البكتيري الذروة في الطحال التي تحدث بين 3 و 4 أيام مرحلة ما بعد عدوى 1،3،22. إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية مهم لتنشيط البلاعم والمقاومة الأولى ضد الممرض 3؛ ولكن في جرعات المعدية العالية، وإنتاج الإنترفيرون γ يمكن أيضا أن يكون ضارا لإزالة مسببات المرض 23. خلايا NKT هي أيضا مصدر من الإنترفيرون γ في الطحال والكبد أثناء المكافحة المبكرة من مسببات الأمراض 2،24 ولقد ثبت هذا الإنتاج لتضخيم إنتاج الإنترفيرون γ من أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا القاتلة الطبيعية (2). من ناحية أخرى، في وقت لاحق المفعول الخلايا اللمفية تي التكيف، وخلايا CD8 + T في حزبدائرية، هي مهمة للوساطة في تخليص الممرض وتوفير الحماية ضد 1،4،22 إعادة العدوى.
وكان هذا النموذج العدوى جذابة للباحثين لعدد من الأسباب (التي استعرضت في 1). أولا، والعدوى مع الممرض هو تكرار للغاية ويؤدي الى استجابة مناعية قوية Th1 و الخلوية. ثانيا، خلال العدوى دون المميت، يتركز الحمل البكتيري في الكبد والطحال حيث يمكن قياسه بسهولة. ثالثا، الممرض يمكن التعامل معها بأمان تحت السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) الظروف. رابعا، إن الكائن الحي والاستجابة المناعية أنه يولد اتسمت على نطاق واسع. وأخيرا، وضعت مجموعة متنوعة من سلالات متحولة والمعدلة وراثيا التي تتوفر للاستخدام.
وصفت هنا هو بروتوكول الأساسي للتلقيح C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من L. اللستيريا 25 ولقياس IFN - γ إعادةردود الأفعال التي كتبها NK، NKT، والخلايا الليمفاوية على التكيف في مرحلة ما بعد الإصابة. كما وصفت هو كيفية قياس الحمولة الجرثومية في الطحال والكبد بعد الإصابة دون المميت وإجراء دراسات البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض. وأخيرا، أظهرت بيانات تمثيلية لكيفية هذا البروتوكول يمكن استخدامها لفحص تأثير علاجات جديدة على الردود IFN-γ والبقاء على قيد الحياة الماوس من L. المستوحدة العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان السلامة
يصف هذا البروتوكول إصابة الفئران مع المستوحدة L. الحية. تتم معالجة العوامل المسببة للأمراض بأمان في ظل ظروف BSL2 من قبل أفراد مدربين الذين لا يعانون من نقص المناعة. تشمل الأشخاص القليلي المناعة النساء الحوامل وكبار السن والأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية أو لديهم أمراض مزمنة تتطلب علاجا للمناعة. يجب على العاملين ارتداء معطف واقية المختبر أو ثوب، والقفازات، وقناع، وحماية العين أثناء التعامل مع العينات المصابة. تم تنفيذ العمل الموصوف في هذه الوثيقة تحت شروط BSL2 بموجب شهادة (# 32876) الذي صدر عن شبكة الصحة جامعة (UHN) السلامة الأحيائية منصبه. وكانت جثث من الفئران المصابة أو أي أنسجة غير المستخدمة مزدوجة أكياس والتخلص منها في نفايات بيولوجية. تم تطهير أقفاص من الفئران المصابة أيضا قبل التعقيم.
بيان الأخلاق
واستمرت الفئران وإصابة في quaraوتتم رعاية غرفة ntine داخل مرافق الحيوان UHN ووفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها المجلس الكندي للرعاية الحيوان. تم تنفيذ جميع الإجراءات التي أجريت على الفئران في ظل استخدام الحيوانات بروتوكول # 3214 الذي تمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية الحيوان UHN. نظرا لاعتبارات أخلاقية، لم يستخدم الموت باعتبارها نقطة النهاية للدراسات البقاء على قيد الحياة. لتعديل LD 50 الجرعة ذكرت هنا لL. اللستيريا وإصابة مصممة على أن تكون الجرعة التي بلغت 50٪ من الفئران النهاية المحددة، التي تتألف من فقدان 20٪ في وزن الجسم أو تظهر ان اثنين على الأقل من العلامات السريرية التالية: الخمول، والفراء تكدرت، منحنية الموقف، وصعوبة التنفس، عيون مملة أو الغارقة. الموت الرحيم كانت الفئران عندما وصلوا النهاية عن طريق التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون (CO 2) وفقا للمبادئ التوجيهية منشأة UHN.
1. إعداد الأرصدة الجلسرين للتخزين طويل الأجل
ملاحظة: يصف هذا الإجراء كيفية الأسهم الجلسرين لليتم إعداد EGD السلالة من المستوحدة L. من الأسهم الجلسرين الأصلي. الخطوات التي لديها القدرة على توليد الهباء الجوي يجب أن يتم تنفيذ داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مصدق (BSC).
- إعداد ضخ القلب الدماغ (BHI) لوحات أجار لنمو البكتيريا. لهذا إضافة 3.8٪ (ث / ت) مرق بهي و 1.5٪ (ث / ت) أجار لمضاعفة المقطر H 2 O ([ده 2 O). السائل الأوتوكلاف. مرة يبرد آغار إلى 50 درجة مئوية، والاستغناء السائل في أطباق بتري البكتيرية (25 مل / طبق) والسماح لوحات الجافة (كشف) في BSC لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: نقل BHI أجار في حمام ماء C 50 درجة بعد التعقيم لتجنب تصلب قبل صب لوحات. لوحات BHI تخزينها في 4 درجة مئوية رأسا على عقب (مع الجانب الإعلامي على أعلى) لتصبح جاهزة للاستخدام. - إعداد وسائل الاعلام BHI السائل. لهذا، خلط 3.8٪ (ث / ت) مرق BHI في ده 2 O. الأوتوكلاف.
- إزالة الأسهم الجلسرين المجمدة من سلالة L. اللستيريا EGD من -80 ° C تجميدص وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
- تراجع تلميح ماصة معقمة في الأوراق المالية الجلسرين إذابة وخط فورا طرف ذهابا وإيابا عبر جزء من لوحة BHI. هذا هو خط أساسي.
- تحويل لوحة من 90 درجة مئوية، وذلك باستخدام ماصة جديدة، اسحب من خلال خط أول وانتشاره إلى ربع القادم من لوحة (وهذا هو خط ثانوي). أكرر مرة أخرى لجعل خط العالي.
- تحويل لوحة رأسا على عقب، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. ويجب الحصول على المستعمرات موحدة واحدة في آخر مجموعة من الشرائط وضوحا بين 16 و 24 ساعة.
- الاستغناء عن 10 مل من مرق BHI العقيمة في العقيمة تنفيس أنبوب 50 مل. اختيار مستعمرة واحدة من المستوحدة L. من لوحة باستخدام طرف ماصة معقمة وتلقيح المرق. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية المدارية حاضنة تهتز بين عشية وضحاها أو حتى OD 600 = 1.0 مع الإعدادات في 225 التناوب في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
ملاحظة: الزجاج أو جيش التحرير الشعبى الصينى المتاحويمكن أيضا قوارير مخروطي ستيك استخدامها للبكتيريا الثقافة. بغض النظر عن نوع من الحاويات المستخدمة، وتأكد من أنه غير معقمة، وتنفيس وأن حجم الثقافة لا تتجاوز 20٪ من إجمالي حجم الحاوية لضمان التهوية المناسبة للبكتيريا. - إعداد مخزون الجلسرين عن طريق خلط معقمة 100٪ الجلسرين مع ثقافة السائل البكتيرية بين عشية وضحاها في نسبة 1: 1. توزيع البكتيرية / الجلسرين الخليط في قارورة 2 مل المبردة (500 ميكرولتر / القارورة) وقارورة نقل إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين.
ملاحظة: يمكن أيضا أساليب الأسهم الخرزة أن تستخدم بدلا من الأسهم الجلسرين لتخزين البكتيريا. بهذه الطريقة، يتم تلقيح ميكروبيدات التي يسهل اختراقها مع ثقافة نقية من المستوحدة L. ويتم تخزينها في -80 درجة مئوية. كل حبة يمكن استخدامها لتطعيم ثقافة جديدة حسب الحاجة. انظر قائمة المواد للحصول على مزيد من المعلومات.
2. تحديد منحنى نمو L. اللستيريا في الثقافة يوم ملاحظة: يصف هذا الإجراء كيفية توليد منحنى النمو للالمستوحدة L. الذي يستخدم لتقدير مستعمرة (كفو) للدراسات العدوى. يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات التي لديها القدرة على توليد الهباء الجوي داخل BSC شهادة.
- أخذ 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها ولدت في الخطوة 1.7 إلى وسائل الإعلام BHI 10 مل في تنفيس أنبوب 50 مل وينمو بمعدل 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز (225 دورة في الدقيقة، يميل في زاوية 45 درجة). استخدام أنبوب غير تلقيح كمجموعة تحكم.
- تأخذ 0.5 مل عينات من الثقافة على فترات كل ساعة (1، 2، 3، 4، 5، 6 ساعات، الخ.). تمييع كل قسامة 1: 1 (ت / ت) مع وسائل الاعلام BHI في كفيت بلاستيكية. ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. قياس الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر (OD 600) باستخدام مطياف. مواصلة زراعة البكتيريا حتى OD 600 = 1.
- وفي الوقت نفسه، أخذ عينة 100 ميكرولتر من ثقافة وتمييع مع 900 ميكرولتر BHI وسائل الإعلام في العقيمة 1.5 مل ميكرأنبوب ocentrifuge (وهذا هو 10 -1 تخفيف). أجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 6000 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
- يغسل البكتيريا مرتين عن طريق إعادة التعليق بيليه في 1 مل من وسائل الاعلام BHI، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 6000 x ج، ومن ثم الشفط طاف. resuspend الكرية في 1 مل سائل الإعلام BHI. إعداد 10 أضعاف التخفيف سلسلة من هذه العينة في وسائل الإعلام BHI (10 -2 الى 10 -9). نشر 100 ميكرولتر من كل مخفف على لوحات BHI أجار منفصلة. احتضان لوحات ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة.
- في اليوم التالي، واختيار لوحات التي لديها ما بين 30-300 المستعمرات. تجاهل بقية. عدد المستعمرات على هذه اللوحات. ويبين الجدول 1 مثالا من التهم التي تم الحصول عليها في قسامة كانت تؤخذ عند OD 600 = 0.84. في هذا المثال، واحدة من لوحات (أي 10 -6 تمييع) زيارتها التهم مستعمرة بين 30-300، وكان يستخدم لكفو / مل حساب.
ملاحظة: لوحات مع أكبرلا تستخدم من 300 المستعمرات، منذ الاكتظاظ يمكن أن تعيق نمو البكتيريا وأيضا يجعل من الصعب تمييز وتعداد المستعمرات الفردية. كما لا تستخدم لوحات مع التهم <30 بسبب أخطاء صغيرة في تقنية تخفيف أو وجود الملوثات يمكن أن يكون لها تأثير كبير على دقة التهم في الطرف الأدنى من النطاق. - تقسيم عدد من المستعمرات على حجم مطلي ثم ضرب من قبل عامل تخفيف للحصول على قيمة / مل كفو لتخفيف معين. في المثال في الجدول رقم 1، وكان العدد على التخفيف 10 -6 70. تقسيم هذه القيمة بنسبة 0.1 مل للحصول على قيمة / مل كفو للثقافة المخفف. ثم ضرب هذه القيمة من قبل عامل التخفيف (10 6) للحصول على قيمة / مل كفو للثقافة مخفف (7.0 × 10 8).
- رسم OD 600 (المحور الصادي) مقابل الوقت في ساعة (محور س) لتحديد مرحلة لوغاريتمي النمو 26.
ملاحظة: هذه المنحنيات النمويوفر ه تقديرا لكفو / مل من ثقافة اليوم الذي نمت لقراءة OD معينة. اختيار OD 600 القراءة التي هي في مرحلة لوغاريتمي النمو التي يمكن أن تستخدم OD الهدف 600 لزراعة الثقافات اليوم. هذه البيانات الآن يمكن استخدامها لتقدير كفو في ثقافة لإعداد اللقاح (الإجراء 3).
3. إعداد اللقاح للعدوى التجريبية مع المستوحدة L.
ملاحظة: يصف هذا الإجراء إعداد اللقاح المعدي من ثقافة اليوم الذي بدأ من الثقافة بين عشية وضحاها (المعد في الإجراء 2). يتم تنفيذ كل هذه الخطوات في BSC ما لم ينص على خلاف ذلك.
- احسب عدد كفو المطلوبة للعدوى بناء على عدد من الفئران والتصميم التجريبي للدراسة. إضافة حجم مناسب من وسائل الإعلام BHI إلى قارورة أو ثقافة أنبوب مخروطي تنفيس العقيمة.
ملاحظة: كفو من البكتيريا صسوف repared أن تعتمد على نوع من تجربة يؤديها. لدراسة NK واستجابات الخلايا NKT أثناء الإصابة، يتم تلقيح كل فأر مع 10 5 كفو من البكتيريا (إجراءات 6). إذا كانت الدراسة في التكيف استجابة خلايا T للإصابة أو قياس الحمولة الجرثومية، وتلقيح كل فأر مع 2 × 10 4 CFU من البكتيريا (الإجراءات 8). إذا كانت الدراسة في البقاء على قيد الحياة إلى النهاية، ويلقح كل الفأر مع جرعة LD 50 من الممرض (والذي هو 10 5 كفو للذكور و 1.5 × 10 5 كفو للإناث، انظر الإجراءات 9). - تطعيم الأنبوب الذي يحتوي سائل الإعلام BHI مع 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية المدارية حاضنة تهتز (225 دورة في الدقيقة) حتى OD الهدف 600 يتم التوصل إليه. نقل محتويات الثقافة في أنبوب الطرد المركزي معقمة.
- البكتيريا الطرد المركزي في بيليه لمدة 5 دقائق في 6000 x ج باستخدام جهاز للطرد المركزي. نضح طاف به فراغ تعلق على قارورة فخ التي تحتوي على مواد التبييض.
- غسل بيليه مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الطرد المركزي (5 دقائق في 6000 x ج) في ما بين.
- نضح غسل الثاني وتمييع البكتيريا في التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X لتقديم كفو التي تهم كل فأر في حجم 200 ميكرولتر.
ملاحظة: من الأفضل استخدام مصدر تجاري العقيمة برنامج تلفزيوني 1X لغسل البكتيريا ولإعداد اللقاح، منذ مختبر الأواني الزجاجية يمكن إدخال الملوثات المناعية مثل lipopolysaccharide في.
4. العدوى التجريبية من الفئران مع المستوحدة L.
ملاحظة: يصف هذا الإجراء كيفية تصيب الفئران مع قيحة أعدت في إجراء 3 وكيفية التحقق من كفو الملقاة اللقاح. تتم معالجة الفئران والحقن في BSC.
- طلب عدد كاف من الذكور أو الإناث C57BL / 6J الفئران لتجربتك. طلب أيضا الفئران لخدمة التحكم كما هو غير المصابة.
- السماح الفئران لالتأقلم ل1 أسبوع قبل التلقيح البكتيرى.
ملاحظة: وذلك لأن الإجهاد المرتبطة بالنقل من الحيوانات يمكن أن تؤدي إلى زيادة عابرة في إنتاج هرمون التوتر واللمفاويات 27،28. - في يوم من التلقيح، والحصول على وزن الجسم الأساسي لكل الماوس وتسجيله في دفتر المختبر.
- في BSC، خلط تعليق البكتيرية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة معقمة لضمان أن البكتيريا وتوزع بالتساوي ثم تناول 200 ميكرولتر من اللقاح إلى 1 مل سلامة المحاقن المهندسة مزودة إبرة 25 G.
- حقن الملكية الفكرية الفأر مع 200 ميكرولتر من اللقاح معد سلفا (على سبيل المثال، 10 5 كفو للإصابة الخلايا القاتلة الطبيعية، إجراء 6). لهذا الإجراء، القفا الفئران مع اليد أقل المهيمنة عن طريق الاستيلاء على الجلد المترهل حول الكتفين الفأر. بعد التأكد من أن الفأر هو جيدا ضبط النفس، حقن فأر في الربع السفلي من البطن، فقط الوحشي لمidline لتجنب المثانة.
- التخلص من الإبر والمحاقن في حاوية واقية الحادة.
- كرر الخطوات من 4،3-4،6 حتى يتم حقن جميع الفئران. إجراء خطوات مماثلة مع برنامج تلفزيوني 1X حقن الفئران (الضوابط غير المصابة).
ملاحظة: منذ كفو هو تقدير يستند على منحنى النمو، بل هو أيضا ممارسة جيدة للتحقق من كفو الفعلي في اللقاح. لهذا، وإعداد 3-4 التخفيفات مختلفة من اللقاح استعداد (باستخدام 10 أضعاف سلسلة تمييع) التي تتوقع سيؤدي في المستعمرات المعدودة. نشر 100 ميكرولتر من كل مخفف على طبق من ذهب بهي أجار واحتضان ليلا 37 درجة مئوية. عدد المستعمرات وحساب الفعلية كفو / مل كما هو موضح في الإجراء 2.
5. إعداد المستوحدة L. قتلوا الحرارة للدراسات المناعي
ملاحظة: جميع الخطوات التي لديها القدرة على توليد تتم الهباء الجوي داخل BSC.
- تنمو ثقافة اليوم حتى OD 600 القيم لإعادة وصل التى تقع فى مرحلة لوغاريتمي. الاستغناء عن الثقافة في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
- احتضان الأنابيب في 70 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 1 ساعة لقتل البكتيريا.
- يغسل البكتيريا مرتين مع 1X PBS كما في خطوات 3.3 و 3.4. resuspend في وسائل الاعلام RPMI كاملة العقيمة التي تحتوي على مصل العجل الجنين (FCS) (انظر الملف التكميلي 1 وصفة) بتركيز 4 × 10 6 / مل. قسامة قتل البكتيريا في 2 مل قارورة معقمة المبردة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تأكيد وفاة من البكتيريا عن طريق نشر 100 ميكرولتر من إعداد البكتيريا قتلوا الحرارة على لوحات أجار بهي وتفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن تكون هذه البكتيريا قتل حرارة جاهزة للتحفيز الخلايا الليمفاوية في الثقافة في إجراء 8. إذا كان هناك أي مستعمرات المتزايد على لوحة أجار بهي، كرر الإجراء مما أسفر عن مقتل الحرارة.
6. قياس ردود IFN-γ التي كتبها NK وNKT الخلايا خلال العدوى
ملاحظة: يصف هذا الإجراء كيفية قياس ردود IFN-γ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT في الفئران في 24 ساعة بعد الإصابة مع 10 5 كفو من المستوحدة L.. وتستخدم هذه الجرعة لأنه يدفع الردود IFN-γ قوية من الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT في الطحال (24). إجراء كافة الخطوات في ش. للمساعدة في الحفاظ على بقاء الخلية، والحفاظ على الخلايا على الجليد كلما كان ذلك ممكنا، واستخدام مخازن الجليد الباردة.
- تطعيم الفئران كما هو موضح في إجراء 4 مع 10 5 كفو من المستوحدة L.. في الوقت نفسه، وضخ السيطرة على الفئران غير المصابة IP مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني 1X.
- الموت ببطء الفئران في 24 ساعة بعد التطعيم بواسطة CO 2 الاستنشاق وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- يكذب كل الماوس على الجانب الأيمن، والرطب أسفل الجلد مع 70٪ من الإيثانول باستخدام زجاجة الضغط.
- باستخدام ملقط العقيم أو العقيمة ومقص صعبة قطع، شق الجلد أسفل الجزء السفلي من القفص الصدري.
- رش أسفلالطبقة العضلية يتعرض مع 70٪ من الإيثانول. وينبغي أن يكون الطحال مرئية تحت طبقة العضلات (فتح رأس السهم في الشكل 1).
- باستخدام ملقط العقيم أو العقيمة ومقص غرامة، شق الطبقة العضلية للكشف عن الطحال. انتزاع بلطف الطحال مع ملقط ومقص استخدام غرامة لقطع الطحال بعيدا عن الأنسجة المحيطة الضام.
- وضع الطحال في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على العقيمة برنامج تلفزيوني 1X.
- نصف ملء أطباق بتري معقمة مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. فصل الطحال من خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة في طبق بتري باستخدام نهاية شقة من العقيمة حقنة 3 مل.
- نقل تعليق خلية طحالية إلى 15 مل أنبوب مخروطي العقيمة نظيفة باستخدام العقيمة 10 مل ماصة المصلية.
- عينات الطرد المركزي في 335 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نضح طاف في قارورة فخ التي تحتوي على مواد التبييض. تخفيف بيليه خلية عبها الأنبوب مع إصبع أو عن طريق سحب أنبوب أسفلذهابا وإيابا على طول سطح المموج (على سبيل المثال، وتدفق الهواء تنفيس في BSC).
- ليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة 1.5 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل العازلة (انظر الملف التكميلي 1 وصفة) لكل الطحال. بالضبط بعد 1 دقيقة و 15 ثانية، وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X لوقف تحلل الخلية.
- خلايا الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 6.10. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 10 مل من مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) العازلة (العقيمة برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2٪ FCS).
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. لهذا، واتخاذ اثنين aliquots من تعليق خلية لعد. إضافة 15 ميكرولتر من كل تعليق الخلية إلى حجم مساو من التريبان الأزرق (0.04٪، الذي أدلى به تمييع 0.4٪ التريبان حل الأزرق في ده 2 O). تحميل 15 ميكرولتر من كل خلية / التريبان تعليق الأزرق في غرفة عدادة الكريات (أي واحد في الغرفة العليا، واحدة في الغرفة السفلى).
- باستخدام المجهر، عد كل الخلايا غير زرقاء فيخمسة مربعات كبيرة من الشبكة المركزية في كل غرفة (الشكل 2). أخذ هذا العدد ونقسمه على 10 للحصول على عدد من الخلايا في 10 6 / مل. في المثال في الشكل 2، وعدد 215 الخلايا في 5 الساحات. وبالتالي فإن تركيز الخلية هو 21.5 × 10 6 / مل. متوسط تركيزات الخلية التي تم الحصول عليها من العينتين.
- البذور 1 × 10 6 خلايا لكل بئر / وصمة عار في لوحة 96-جيدا ذهابا وأسفل لالتدفق الخلوي تلطيخ. تأكد أيضا البذور الخلايا لعناصر غير ملوثين ومضان ناقص واحد (FMO). نرى تدفق أوصى الخلوي لوحة تلطيخ في الجدول 2.
ملاحظة: للحصول على الخطوات التالية، فمن المستحسن للحفاظ على الخلايا على الجليد أو على 4 درجات مئوية، وحماية الخلايا من الضوء بورق عند وجود fluorochromes. ماصة متعددة يمكن استخدامها لالاستغناء السوائل في لوحات تلوين 96-جيدا لتسريع المعالجة. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية عندماالشفط طاف من لوحة طرد. تلطيخ يمكن أيضا أن يتم في أنابيب FACS إذا لم يتم تركيب أجهزة الطرد المركزي مع محولات لوحة. تتم جميع الخطوات الطرد المركزي من هذه النقطة في 456 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. - أجهزة الطرد المركزي لوحة ثم يغسل خلايا مرتين مع العازلة FACS. ويتم غسل واحد عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل بئر، الطرد المركزي لوحة، ثم الشفط طاف.
- تنفيذ الخطوة عرقلة من خلال إضافة 50 ميكرولتر / بئر FACS العازلة التي تحتوي على مكافحة فأر CD16 / CD32 (تنقية كتلة بورتو) (0.5 ميكروغرام). احتضان خلايا في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل خلايا مرة واحدة في برنامج تلفزيوني 1X كما هو موضح أعلاه.
- إضافة 100 ميكرولتر الجدوى صبغ (قابل للتثبيت بقاء الصبغة المخفف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الخلايا. خلايا وصمة عار في 4 درجات مئوية في الظلام (في الثلاجة) لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مرتين في المخزن FACS كما هو موضح أعلاه.
- بعد غسل الثاني، إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة سطح الخلية أو tetramers إلى آبار منها وفقا رس لوحة تلطيخ صفت في الجدول 2. خلايا وصمة عار في 4 درجات مئوية في الظلام (في الثلاجة) لمدة 30 دقيقة. في هذا الوقت، أيضا إضافة الأجسام المضادة للتلطيخ الضوابط الإيجابية وFMO واحدة.
ملاحظة: بخصوص الضوابط الإيجابية واحدة، فمن المستحسن إما splenocytes الاستخدام التي هي ملطخة مع مختلف إصدارات تألقي من الأجسام المضادة CD4 أو الخرز تعويض التجارية التي ملطخة الأجسام المضادة المستخدمة في لوحة. قبل إجراء هذا الإجراء تلطيخ، ينبغي معاير كل الأضداد نظام مراقبة الأصول الميدانية في دراسات اختبار لتحديد تركيزات الأمثل لتلطيخ. - غسل الخلايا مرتين في المخزن FACS كما هو موضح أعلاه ثم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة التعليق عليها في 50 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (16٪ الأسهم امتصاص العرق مخففة في ده 2 O) واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: إن امتصاص العرق هي سامة، وينبغي التعامل فقط في غطاء الدخان.
- غسل الخلايا مرتين طن FACS العازلة، الطرد المركزي في بين. و resuspend الخلايا في عازلة FACS. تواصل خلايا خطوة أو مخزن القادمة في الثلاجة محمية من الضوء لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.
- خلايا الطرد المركزي، وإزالة طاف، ويغسل خلايا مرتين مع 150 ميكرولتر من 1X Permeabilization / غسل العازلة (بيرم عازلة / غسيل)، الطرد المركزي في بين. يتم إعداد بيرم / غسيل العازلة من الأسهم 10X عن طريق تمييع 1: 9 (ت / ت) في [ده 2 O.
- بعد غسل الثاني، resuspend الخلايا في 150 ميكرولتر من بيرم / غسيل العازلة واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- خلايا الطرد المركزي مرة أخرى ثم نضح طاف. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة 1X بيرم / غسيل تحتوي على مكافحة IFN-γ واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا مرتين مع العازلة 1X بيرم / غسيل، الطرد المركزي في بين. و resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من FACS العازلة ومن ثم نقل الخلايا إلى أنابيب FACS.
- انتقل إلى التدفق الخلوي الاستحواذ باستخدام cytomet تدفقإيه يحتوي على التكوين الليزر وتصفية مجموعة مناسبة للتمييز fluorochromes المستخدمة في لوحة تلطيخ هو موضح في الجدول رقم 2 29. جمع ما لا يقل عن 200،000 الأحداث في عينة و 10،000 الأحداث لعناصر التعويض.
- تطبيق التعويض مصفوفة وتحليل البيانات باستخدام تدفق cytometric برامج التحليل 30.
7. قياس الحمولة البكتيرية في الطحال والكبد في وقت الذروة العدوى
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات ضمن ش.م.ب ما لم يذكر خلاف ذلك.
- تطعيم الفئران IP مع 2 × 10 4 كفو من مسببات المرض باستخدام الإجراءات الموضحة في إجراء 4.
- في يوم 3 بعد العدوى، وإعداد العقيمة 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، تحتوي كل منها على 500 ميكرولتر من الجليد الباردة العقيمة 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X و0،2-0،3 غرام من 1،5-2 ملم الخرز الزجاجي المعقم غسلها حامض. وزن كل أنبوب.
وحمض غسلها الخرز الزجاجي بواسطة incu ملاحظة:باستثناء في حامض الخليك 10٪ في كوب على محرك مغناطيسي لمدة 1 ساعة. ثم يتم غسل هذه الخرز على نطاق واسع مع [ده 2 O لإزالة الحامض، هي المجفف في الهواء، ومن ثم تعقيمها قبل استخدامها. - الموت ببطء الفئران عن طريق التعرض CO 2.
- لتشريح الأعضاء، ووضع الحيوان على ظهرها على لوحة تشريح ويعلقون الأطراف من الماوس لمجلس باستخدام 25 الإبر G. تطهير الجلد عن طريق تبليل مع 70٪ من الإيثانول.
- استخدام معقم قطع مقص صعبة، وجعل شق خط الوسط في الجلد من الفخذ إلى منتصف الصدر ثم من منتصف الفخذ نحو كل الركبة ومن منتصف الصدر تجاه بعضهم الكوع. تشريح حادة وتعكس يعود الجلد، وتعلق عليه فتح باستخدام 25 الإبر G.
- تطهير طبقة العضلات عن طريق تبليل مع 70٪ من الإيثانول ثم استخدام مقص غرامة معقمة جعل شق خط الوسط في الجدار البريتوني. الاستيلاء على عملية الخنجري مع ملقط. ثم، وذلك باستخدام نفس مقص غرامة، إجراء تخفيضات في الجدار البريتوني من صناعة تج الخنجريSS أفقيا على كل جانب، في أعقاب القفص الصدري، أسفل الحجاب الحاجز للكشف عن الكبد.
- قطع قطعة ملغ ~ 100 من الكبد (استخدام نفس الفص لجميع الفئران) باستخدام مقص العقيمة ووضعه في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وزنه قبل.
- استخدام ملقط لدفع برفق جانبا الأجهزة على الجانب الأيسر من التجويف البريتوني لتصور الطحال. انتزاع بلطف الطحال مع زوج من الملقط والافراج عنها من التجويف البريتوني عن طريق خفض بعيدا الأنسجة الضامة المحيطة بها.
- وضع الطحال في أنبوب وزنه قبل 1.5 مل microcentrifuge تحتوي حبات. نقل الأنسجة إلى المختبر في وعاء يحتوي على الجليد مانعة للتسرب. إعادة التفكير مليا في أنابيب تحتوي على أجهزة لتحديد الأوزان الأنسجة في ملغ.
- تجانس الأنسجة عن طريق هز أنابيب باستخدام حبة مطحنة الخالط لمدة 3 دقائق على تردد 30 هرتز.
ملاحظة: يفضل أسلوب حبة مطحنة للالتجانس كما هو الانقياد لتصنيعغناء عدد كبير من العينات ويخلق أقل فوضى واحتمال التعرض لمسببات المرض. ومع ذلك، المجانسة التلقائي أو تعقيمها 2 مل يمكن أن تستخدم المجانسة النسيج اليدوي الزجاج كبديل. - إعداد سلسلة التخفيف 10 أضعاف من الخليط في 0.1٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني 1X، بدءا من (تتراوح بين مخفف إلى 10 -7).
- نشر 100 ميكرولتر من كل جناسة المخفف على طبق من ذهب بهي أجار (نسختين) باستخدام رش العقيمة. لوحات نقل إلى 37 درجة مئوية الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.
- حافظ على لوحات تحتوي على ما بين 30 و 300 المستعمرات / لوحة، تجاهل بقية. عدد المستعمرات في كل لوحة وتحديد متوسط عدد المستعمرات لينتشر مكررة.
- حساب كفو / ملغ وفقا للمعادلة التالية:
كفو / ملغ = كفو / مل في جناسة، مضروبا في مل من جناسة أعدت، مقسوما على الوزن ملغ من النسيج المتجانس.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان متوسط 30 عموداحصي onies بعد الطلاء 100 ميكرولتر من 10 -2 جناسة المخفف أعدت من قطعة 120 ملغ من الكبد الذي المتجانس في 0.5 مل، والحسابات سيكون على النحو التالي:
كفو (عامل تمييع) / مل = 30 المستعمرات × 100 / 0.1 مل (حجم انتشار) = 30000 خلية / مل.
كفو / ملغ = 30000 خلية / مل س 0.5 مل جناسة / 120 ملغ الأنسجة = 125 كفو / ملغ.
8. آثار المستوحدة L. على الردود IFN-γ من CD4 + و CD8 + الخلايا
ملاحظة: يصف هذا الإجراء كيفية قياس إنتاج الإنترفيرون جاما من قبل الطحال CD4 + والخلايا المستجيب CD8 + T حصادها في وقت ذروة استجابة تكيفية المناعة (~ 7 أيام بعد الإصابة) باستخدام طريقتين: (1) تدفق الخلوي لقياس الإنترفيرون جاما من قبل CD4 + و CD8 + الخلايا عن طريق تلطيخ خلوى داخل الخلايا، و (2) ELISA لقياس المستويات الإجمالية الإنترفيرون جاما التي تنتجها splenocytes (يشمل جميع خلايا T). الإجراءاتتتم داخل BSC.
- تصيب الفئران عن طريق حقن الملكية الفكرية مع 2 × 10 4 كفو من مسببات المرض باستخدام الإجراءات الموضحة في إجراء 4.
- في يوم 7 بعد العدوى، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الاستنشاق وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- تشريح الطحال (كما هو موضح أعلاه) ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. نقل الأنابيب إلى المختبر في وعاء يحتوي على الجليد مانعة للتسرب.
- معالجة الطحال إلى تعليق خلية واحدة، ليز خلايا الدم الحمراء كما هو موضح في قسم 6، وresuspend ثم الخلايا في وسائل الاعلام RPMI كاملة تحتوي على 10٪ FCS. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- إعداد الثقافات لقياس ردود IFN-γ. لهذا خلايا الاستغناء (4 × 10 6 في 1 مل / جيد) إلى 24 لوحات جيدة جنبا إلى جنب مع وعددا مماثلا (4 × 10 6 أو 1 مل / جيد) من إذابة المستوحدة L. قتلوا الحرارة (المعد في إجراء 5) . نقل الخلايا إلى 37° مئوية الحاضنة.
- بعد 20 ساعة من الحضانة، إضافة 0.66 ميكرولتر / مل من البروتين المانع النقل إلى الآبار ومواصلة حضانات.
- بعد أربعة ساعة، لوحة نقل إلى BSC وجمع 500 ميكرولتر من طاف الثقافة وتجميد (-80 درجة مئوية) لقياس وقت لاحق من مستويات الإنترفيرون جاما باستخدام طقم التجارية انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) 31. ثم جمع خلايا في أنبوب 15 مل العقيمة. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني 1X وتجميع هذا يغسل مع الخلايا التي تم جمعها.
- إجراء تلطيخ سطح الخلية وتلطيخ الخلايا لIFN-γ على CD4 + و CD8 + الخلايا كما هو موضح في إجراء 6 باستثناء استخدام لوحة تلطيخ هو موضح في الجدول 3. انتقل إلى تدفق عداد الكريات اقتناء (جمع 200،000 الأحداث / العينة) وتحليل البيانات باستخدام 29 التدفق الخلوي برامج التحليل 30.
9. قياس ماوس البقاء على قيد الحياة لنقاط النهاية بعد L. اللستيريا Infecنشوئها
ملاحظة: يصف هذا الإجراء تأثير عامل على البقاء على قيد الحياة الماوس إلى النهاية بعد العدوى مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض. تتم كل هذه الإجراءات في BSC في منشأة الحيوان.
- حقن الفئران IP مع تعديل LD 50 جرعة من المستوحدة L. كما هو موضح في إجراء 4. هذا وتقرر أن يكون 10 5 كفو (للذكور) أو 1.5 × 10 5 كفو (للإناث) 31.
- اتبع الفئران مرتين يوميا لمدة العلامات السريرية وتسجيل هذه العلامات والأوزان جسم الحيوان في دفتر المختبر. الموت ببطء الفئران إذا كانت تظهر خسارة 20٪ في وزن الجسم أو اثنين من العلامات السريرية لداء الليستريات (الخمول، والفراء تكدرت، والتقوس في الجلوس، صعوبة التنفس، عيون مملة أو الغارقة).
- بعد 14 يوما، الموت ببطء على قيد الحياة الفئران عبر CO 2 الاستنشاق.
- إعداد المؤامرات كابلان ماير من البيانات عن طريق التآمر على البقاء على قيد الحياة في المئة من كل مجموعة ضد الزمن 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويعرض الشكل 3 بعض تدفق نموذجي الخلوي تلطيخ IFN-γ في الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT الطحال في 24 ساعة بعد العدوى مع 10 5 كفو من مسببات المرض. كما يوضح هذا الرقم استراتيجية النابضة لوحة تلطيخ هو موضح في الجدول رقم (2). ويبين الشكل 4 بعض البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها في تجربة واحدة حيث تم علاج ذكور الفئران مع IS001 أو مراقبة المركبات PPARα خصم، مصابا 10 5 اللستيريا كفو L.، ومن ثم تحليلها لIFN-γ في الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT بعد 24 ساعة . ويبين هذا الرقم أن العلاج مع IS001 عززت الردود IFN-γ الخلايا NKT، ولكن الخلايا لا NK بعد العدوى مع الممرض. ويبين الشكل 5 تلطيخ ممثل لIFN-γ في الطحال CD4 + والخلايا CD8 + T في 7 أيام بعد العدوى بعد إعادة التحفيز المجراة سابقا مع السلطة الفلسطينية قتلوا الحرارةthogen. ويظهر هذا الرقم أيضا استراتيجية النابضة لوحة تلطيخ هو موضح في الجدول 3. ويبين الشكل 6 البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها في تجربة واحدة حيث تم علاج ذكور الفئران يوميا مع خصم IS001 أو مراقبة المركبات PPARα، مصابا جرعة دون المميتة من المستوحدة L.، وتحليلها في 7 أيام بعد العدوى. وتبين هذه التجربة أن العلاج مع IS001 عززت الردود الإنترفيرون جاما من قبل كل من CD4 + و CD8 + الخلايا الليمفاوية. ويبين الشكل 7 بيانات تمثيلية من الدراسة أن التحقيق في تأثير مضاد IS001 PPARα على البقاء على قيد الحياة الماوس إلى النهاية بعد الإصابة مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض. دبر هو البقاء على قيد الحياة في المئة من الفئران مع الزمن بعد الإصابة. ويبين هذا الرقم أن العلاج مع IS001 زادت بقاء الفئران الذكور إلى النهاية. معا توضح هذه البيانات كيف أن هذا النموذج يمكن تطبيقه على التحقيقآثار عقاقير أو أدوية على الردود الإنترفيرون جاما في الجسم الحي ولاستكشاف كيفية تأثير هذه التغيرات المناعية البقاء على قيد الحياة الحيوانية من الإصابة.
الشكل 1. تشريح الطحال من الفئران المصابة. هذه السلسلة من الصور تظهر كيفية تشريح الطحال من فأر ميت. (أ) استلقي الماوس على الجانب الأيمن وأسفل رش الجلد مع الايثانول 70٪. (ب) باستخدام ملقط العقيم أو العقيمة ومقص صعبة قطع، شق الجلد أسفل الجزء السفلي من القفص الصدري. (ج) رذاذ أسفل طبقة العضلات يتعرض مع 70٪ من الإيثانول. وينبغي أن يكون الطحال مرئية تحت طبقة العضلات (فتح رأس السهم). (د) استخدام ملقط العقيم أو العقيمة ومقص غرامة، شق الطبقة العضلية للكشف عن الطحال. (ه) انتزاع بلطف الطحال مع ملقط وشحد ذاته مقص غرامة لقطع الطحال بعيدا عن المحيطة النسيج الضام. (و) ضع الطحال في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. Splenocytes العد باستخدام عدادة الكريات. (أ) يدل على الشبكة المركزية للعدادة الكريات. (ب) يظهر موسع للرأي الشبكة المركزية التي تحتوي على 25 الساحات الكبيرة (التي تحتوي كل منها على 16 مربعات صغيرة). وسلط الضوء على خمسة مربعات كبيرة تستخدم لالعد والفرز في الرمادي (4 مربعات الزاوية بالإضافة إلى ساحة المركز في الشبكة المركزية). (ج) معارض موسع للرأي واحد من مربعات رمادية كبيرة. لتحديد حجم الخلية في 10 6 / مل، العد الأولجميع خلايا قابلة للحياة ضمن خمسة مربعات رمادية كبيرة. في المثال المبين، وهذا العدد هو 215. وعند العد، للتأكد من الاعتماد فقط كل من (غير زرقاء) خلايا واضحة، بما في ذلك تلك التي تلامس خطوط مزدوجة على اليمين والجزء السفلي من الشبكة. لا عد الخلايا لمس خطوط مزدوجة على اليسار وأعلى من الشبكة. تتخذ من مجموع خمسة العد مربع، ونقسمه على 10 للحصول على عدد من الخلايا في 10 6 / مل. في المثال، 215 مقسوما على 10 هو 21.5 × 10 6 خلية / مل. لاحظ أن هذه الحسابات تنجح إلا إذا كنت تعول 5 من الساحات الكبيرة وأبرز وتمييع الخلايا الخاصة بك 1: 1 في الزرقاء التريبان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. استراتيجية المحاصرة للكشف IFN-الإنتاج γ في الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT. البوابة الأولى على اللمفاويات على FSC-A من قبل محكمة أمن الدولة-A المؤامرة. ثم البوابة على تلك الأحداث التي هي على قطري على FSC-H / FSC-A المؤامرة. هذه هي singlets ل. ثم البوابة على الهواء مباشرة (AmCyan -) و CD8 - الخلايا. ثم رسم تلطيخ tetramer ضد TCRβ. الخلايا NKT ضمن السكان إيجابي مزدوج والخلايا القاتلة الطبيعية هي بين السكان سلبي مزدوج. بوابة على الخلايا ايجابية مزدوجة، ومؤامرة NKp46 مقابل FSC. بوابة على NKp46 سلبي للسكان، والتي هي خلايا NKT (هذه البوابة يمكن تعيين من خلال إيجاد نقطة من الانقسام في الشعبين من الخلية مؤامرة NK). والخلايا القاتلة الطبيعية هي tetramer - TCRβ - NKp46 + السكان. ضمن بوابات الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT، يتم تحديد IFN-γ + الخلايا في قناة بي بعد وضع بوابة على أساس السيطرة FMO. من فضلك اضغطهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
حصل على الرقم 4. ممثل البيانات للترددات من الإنترفيرون γ + NK وNKT الخلايا في 24 ساعة بعد الإصابة. في هذه التجربة، الذكور C57BL / 6J الفئران - كانت (N = 3 4 / مجموعة) الملكية الفكرية المصاب مع 10 5 كفو من L. اللستيريا أو تركت المصابة من الامم المتحدة. كانت تدار الفئران أيضا IS001 المخدرات أو مركبة (0.5٪ كاربوكسيميثيل السليلوز) في نفس الوقت من التلقيح و 12 ساعة في وقت لاحق. بعد أربع وعشرين ساعة التلقيح، والموت الرحيم الفئران وتم إزالة الطحال وتم معالجتها بشكل فردي والملون لالتدفق الخلوي. المعروضة هي متوسط ± تردد SEM من الإنترفيرون γ + الخلايا في NK (أ) أو بوابات خلية NKT (ب) في الفئران غير المصابة أو المصابة بعد العلاج مع سيارة IS001 أو المخدرات. *تشيرالفرق سا (P <0.05) من السيطرة على السيارة التي كتبها الذيل يومين T-الاختبار. يتم إعادة طباعة البيانات من 31 بإذن من مجلة علم المناعة (حجم 195، ص 5189-5202، 2015). حقوق التأليف والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. استراتيجية المحاصرة لكشف من إنتاج الإنترفيرون γ في خلايا CD4 و CD8. البوابة الأولى على اللمفاويات على FSC-A مؤامرات SSC-A. ثم البوابة على تلك الأحداث التي هي على قطري على FSC-H / FSC-A المؤامرة. هذه هي singlets ل. ضمن هذه البوابة، بوابة على (AmCyan -) الحية خلايا CD45 +. ثم بوابة على أي CD8 + أو CD4 + السكان. داخل كل باب، والإنترفيرون γ +ويتم تحديد الخلايا في قناة PE بمقارنة تلطيخ للتحكم FMO. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
حصل على الرقم 6. ممثل بيانات للترددات من الإنترفيرون γ + CD4 + و CD8 + T الخلايا في 7 أيام بعد الإصابة المستوحدة L. (EGD السلالة). في هذه التجربة، أصيب الذكور C57BL / 6J الفئران الملكية الفكرية مع 2 × 10 4 اللستيريا كفو L. (N = 7 / مجموعة) أو تركت المعافين (N = 3 / مجموعة). كانت تدار الفئران أيضا IS001 المخدرات أو مركبة (0.5٪ كاربوكسيميثيل السليلوز) انطلاق مرتين يوميا في اليوم التلقيح. وبعد سبعة أيام، والموت الرحيم الفئران وتمت إزالة الطحال وتم معالجتها بشكل فردي ل زراعة الخلايا. وقد حفز خلايا وحيدة النواة خلية طحالية لمدة 24 ساعة مع مقتل الحرارة المستوحدة L. مع نقل البروتين المانع مضافة لل4 ساعة الأخيرة من الثقافة. ثم تم صبغ الخلايا للالتدفق الخلوي. المعروضة هي متوسط ± تردد SEM من الإنترفيرون γ + الخلايا في CD4 + (أ) أو بوابات الخلايا CD8 + (ب) في الفئران غير المصابة أو المصابة بعد العلاج مع سيارة (0.5٪ كاربوكسيميثيل السليلوز) أو IS001 المخدرات. * يشير إلى الفرق (P <0.05) من نظيره السيطرة على السيارة وفقا لما يحدده اختبار T-الذيل اثنين. يتم إعادة طباعة البيانات من 31 بإذن من مجلة علم المناعة (حجم 195، ص 5189-5202، 2015) .Copyright عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ف together.within الصفحات = "1"> 
حصل على الرقم 7. الممثل البيانات خلال التجربة التي قارنت أثر على PPARα خصم 1S001 على الماوس البقاء على قيد الحياة لنقاط النهاية بعد العدوى من ذكر C57BL / 6J الفئران مع المستوحدة L. (EGD السلالة). في هذه التجربة، من الذكور C57BL / 6J الفئران (N = 10 الفئران / مجموعة) الملكية الفكرية المصاب مع تعديل LD 50 جرعة من العامل الممرض (10 5 كفو) من المستوحدة L.. كانت تدار الفئران أيضا IS001 المخدرات أو مركبة (0.5٪ كاربوكسيميثيل السليلوز) انطلاق مرتين يوميا في اليوم التلقيح. تمت متابعة الفئران يوميا لعلامات سريرية وكان الموت الرحيم إذا تمت تلبية النهاية إنسانية. أظهرت هو البقاء على قيد الحياة في المئة من الفئران إلى النهاية مع مرور الوقت * يشير إلى وجود اختلاف في البقاء على قيد الحياة بين مجموعات على النحو الذي يحدده اختبار سجل رتبة (P <0.05). يتم إعادة طباعة البيانات من 31 بإذن من مجلة سو علم المناعة (حجم 195، ص 5189-5202، 2015). حقوق التأليف والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: يبين بعض الحسابات التمثيلية لتحديد كفو في قسامة الثقافة يوم. في هذا المثال، تم اتخاذ قسامة من ثقافة اليوم والمخفف 1: 1 مع وسائل الإعلام BHI. كان OD 600 من هذه العينة المخففة مصممة على أن تكون 0.84. وبالإضافة إلى ذلك، أجري قسامة 100 ميكرولتر من أجل تقرير كفو. تم تخفيفه هذه العينة مع 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام BHI (10 -1) وغسلها ومعلق في 1 مل BHI. وتم إعداد التخفيف سلسلة 10 أضعاف من هذه العينة (10 -2 الى 10 -9) وكانت مطلية عينات المخفف على BHI الآغا(تظهر القيم فقط لمدة 10 -4 إلى 10 -9) لوحات ص. احصي المستعمرات في اليوم التالي. واعتبرت فقط تلك اللوحات التي لديها أعداد مستعمرة بين 30-300 لحساب (أي 10 -6 لوحة، وسلط الضوء باللون الأصفر). ثم تم تقسيم عدد من المستعمرات على هذه اللوحة (70) بنسبة 0.1 (حجم في مل مطلي) للحصول على خلية / مل من العينة المخففة. ثم ضرب هذه القيمة من قبل عامل التخفيف (10 6) للحصول على خلية / مل القراءة للثقافة مخفف. TMTC = عدد كبير جدا من العد.
الجدول 2: لوحة تلطيخ للكشف IFN- γ في ناغورني كاراباخ وNKT الخلايا. لاحظ أنه إما الخرز تعويض ملطخة الأجسام المضادة تدفق المستخدمة في لوحة أو splenocytes ملطخة الإصدارات المختلفة تألقي من CD4 الأجسام المضادة استنساخ GK1.1 يمكن أن تستخدم الضوابط الإيجابية واحدة.
الجدول 3: لوحة تلطيخ للكشف IFN- γ في CD4 + و CD8 + الخلايا. لاحظ أن أي تعويض الخرز الملون مع الأجسام المضادة تدفق المستخدمة في لوحة أو splenocytes ملطخة الإصدارات المختلفة تألقي من CD4 الأجسام المضادة استنساخ GK1.1 يمكن استخدام الضوابط الإيجابية واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إجراء العدوى التجريبية الأساسية مع سلالة EGD من L. اللستيريا 25 في الذكور أو الإناث C57BL / 6J الفئران. تم تعيين هذا البروتوكول لهذا الغرض من دراسة تأثير رواية IS001 جزيء صغير على إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا الليمفاوية الفطرية والتكيفية في الجسم الحي 31. من خلال رصد إزالة البكتيريا والبقاء على قيد الحياة بعد الإصابة، وقد اكتسبت نظرة ثاقبة كيف أثرت هذه التغييرات في الإنترفيرون γ قدرة المضيف للسيطرة على العدوى.
اعتبارات حاسمة في البروتوكول
أحد الاعتبارات الهامة في تصميم هذا النوع من الدراسة هو أن كل تجربة أن تعمل بالطاقة بشكل كاف وتسيطر على نحو ملائم. نظرا لاختلاف البيولوجي في الاستجابة المناعية للإصابة (أنظر الشكلين 4 و 6)، فمن المستحسن أن N = 4-5 الفئران في المجموعة ينبغي أن تستخدم للدراسات المناعية الأولية. اذا كانfter هذه الدراسات أن هناك اتجاها في البيانات، ولكن لا يوجد فرق كبير واضح بين المجموعات، يمكن أن يتم على حساب القدرة لتحديد أقل عدد من الحيوانات المطلوبة في دراسات لاحقة لتحقيق دلالة إحصائية. وفيما يتعلق الضوابط، فمن المهم أن تشمل الضوابط غير المصابة لتحديد استجابات IFN-γ الأساسية للدراسات مناعية والمركبات ضوابط لمساعدة التمييز بين تأثير العلاج من الإجهاد المرتبطة بإدارة العلاج. اعتبار آخر مهم هو توقيت العلاج. لأن استجابة فطرية لالمستوحدة L. سريع جدا، فمن المستحسن أن المعالجة الأولى أن تدار في اليوم قبل، أو في نفس الوقت، التلقيح من أجل ضمان أن المستويات العلاجية للكاشف أن يتحقق قبل بدء الاستجابة المناعية الفطرية.
بعد اعتبار آخر مهم هو جرعة من مسببات المرض لاستخدامها في infectioن. ويوصى بإعطاء جرعة دون المميتة لقياس الحمولة الجرثومية، لأنه يزيد من فرصة أن الممرض سيتركز في الطحال والكبد، والسماح للتعداد أكثر دقة من البكتيريا. ويوصى جرعة دون المميتة أيضا تعداد الردود الإنترفيرون جاما من قبل الخلايا الليمفاوية التكيفية للتأكد من أن الحيوانات لا تستسلم لالليستريات قبل وقت الذروة التوسع الخلايا التائية. في المقابل، فمن المستحسن أن يتم استخدام جرعة أعلى المعدية لقياس استجابة الخلية الأولى NK وNKT في 24 ساعة من أجل تعظيم إنتاج الإنترفيرون γ من هذه الخلايا.
وLD الكلاسيكي 50 هي الجرعة من العوامل المسببة للأمراض التي تؤدي إلى 50٪ فتك الفئران. وبما أن الموت ليس نقطة نهاية مقبولة في مؤسستنا ومنذ عدة أعراض داء الليستريات يمكن التنبؤ ما إذا كان الحيوان ومن المرجح أن تستسلم للعدوى، استخدمنا قائمة محددة من العلامات السريرية بدلا من الموت باعتبارها نقطة النهاية في دراساتنا. باليودنانوغرام هذه الطريقة، تقرر أن LD تعديل 50 كان 10 5 كفو للذكور من العمر 8 أسابيع و 1.5 × 10 5 كفو ليبلغ 8 أسابيع الإناث C57BL / 6J الفئران (31). تم تحديد هذه الجرعات LD 50 عن طريق قياس بقاء في المئة من الفئران إلى النهاية في دراسات الجرعة التصعيد تدريجي (N = 5 دراسات في المجموع) أن كل الوارد N = 8 الفئران في مجموعة (على سبيل المثال، أصيب الفئران أولا مع 10،000 كفو ، ثم الدفعة الثانية مع 20،000 كفو، وما إلى ذلك). تم تحديد LD 50 حساب من مؤامرة تراجع سجل (كفو) (محور س) مقابل الاحتمالية القيم في المئة البقاء على قيد الحياة (المحور الصادي) (الموقع: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).
لاحظ أن تعديل LD 50 الجرعة المحددة في مختبرنا قد تختلف عن تلك في مختبر آخر حتى عندما تصيب الفئران مع نفس السلالة من المستوحدة L.. جزء من هذا التباين قد تتصل شخصي طبيعة سو مراقبة العلامات السريرية لداء الليستريات مقابل نقطة النهاية أكثر المطلقة من الموت. تقلب إضافية يمكن أن تنجم عن الاختلافات في العوامل البيئية مثل النظام الغذائي الماوس أو الجراثيم أو الاختلافات في إعداد اللقاح بين المختبرات. وبالتالي، فمن المستحسن أن قبل الشروع في أي دراسات البقاء على قيد الحياة، إجراء دراسة تجريبية حيث الفئران الإناث (ن = 8 الفئران / مجموعة) مصابون 1.5 × 10 5 كفو من نفس السلالة من المستوحدة L. المستخدمة في هذا دراسة وأعراض رصدها لتحديد ما إذا كان هذه الجرعة النتائج فعلا في 50٪ البقاء على قيد الحياة إلى النهاية. إذا بقاء أقل أو أعلى من 50٪ في هذا كفو، يمكن أن يقوم تدريجي التصعيد جرعة أو جرعة الدراسات التصعيد لتضييق بسرعة في على جرعة LD 50.
اعتبار آخر مهم هو سلالة أو substrain من الفئران المستخدمة في دراسات العدوى. يصف هذا البروتوكول إصابة شائعة الاستخدام الفطرية سلالة الماوس C57BL / 6J. هذا ومناسبة تماما سلالة لقياس ردود الإنترفيرون جاما منذ يعتبر هذا الفأر أن يكون TH1-عرضة السلالة 33 و نتيجة لذلك، هو مقاومة نسبيا للعدوى الليسترية المستوحدة (مقارنة مع سلالات الفئران المعرضة للTH2 مثل BALB / ج) 34،35. والتكيف مع هذا البروتوكول لسلالات الفئران الأخرى تتطلب معرفة الجرعة المعدية من مسببات المرض لسلالة معينة. ويوصى أيضا لاستخدام الفئران من نفس العمر والجنس والبائعين على النحو المبين في هذا البروتوكول من أجل تقليل كمية من المتاعب اطلاق النار المشاركة في إعداد نموذج. على سبيل المثال، أمر C57BL / 6 الفئران من بائع واحد (على سبيل المثال، C57BL / 6J) يمكن أن تظهر الاختلافات الوراثية من C67BL / 6 الفئران أمر من بائع آخر (على سبيل المثال، C57BL / 6NTac) 36. وبالإضافة إلى ذلك، تختلف من الجراثيم المعوية بين C57BL / 6 substrains تم الحصول عليها من شركات مختلفة، والتي يمكن أن تؤثر على توازن ردود Th1 و Th17 في الماوس 37.
ove_title "> التعديلات المحتملة للتقنيةهي الأكثر شيوعا تلقيح الفئران الملكية الفكرية أو عن طريق الوريد بدلا من الطريق الطبيعي للعدوى بين البشر، وهو عن طريق الجهاز الهضمي. التهابات الفم هي أقل شيوعا بسبب سلالات قياسية من المستوحدة L. تصيب بكفاءة الظهارة المعوية من الفئران 38. وذلك لأن هناك تغيير حمض أميني واحد في تسلسل الماوس E-كادهيرين من البشر كادهيرين E الذي يؤدي إلى فقدان الاعتراف E-كادهيرين من البروتين الغزو يستري، internalin ألف (INIA) 39. للتغلب على هذا الحاجز، يستخدم الباحثون الفئران التي هي المعدلة وراثيا لالبشري البروتين كادهيرين E أو استخدام الليستريا التي تم تصميمها للتعبير عن تسلسل تحور من INIA (INIA موت) الذي يربط إلى الماوس E-كادهيرين بنفس النسب كما WT EGD ل E-كادهيرين البشري 40. وهكذا، وتعديل محتمل واحد من هذه التقنية هو أن تصيب الفئران عن طريق الفم. يشار إلى القارئ إلى منشور آخر إن الرب الذي يصف أساليب التلقيح عن طريق الفم 38. لاحظ أن تغيير النمط من العدوى سوف تؤثر على الجرعة المعدية وكذلك حركية نشر الممرض.
هذا البروتوكول يصف استخدام الليستيريا قتلوا الحرارة لانتزاع إنتاج الإنترفيرون γ من قبل خلايا CD4 + و CD8 + T. وقد تم اختيار المستوحدة L. قتلوا الحرارة كحافز في دراساتنا، لأن هذا المستضد غير مكلفة، ولأن مختبرنا كان مهتما في المقام الأول في استجابة خلايا CD4 + T إلى الممرض. واحد الحد هو أن البكتيريا قتل حرارة لا كفاءة CD8 استجابات الخلايا + T الرئيسية سواء في المختبر أو 41 في الجسم الحي 42،43 العدوى. وهكذا، فإن إنتاج CD8 + T الخلية IFN-γ أننا لاحظنا من قبل splenocytes تحصد في ذروة العدوى (أي الشكل 6) على الأرجح ردا على المتبقيبكتيريا حية موجودة في الثقافات خلية طحالية أو تم استخلاصها نتيجة خلوى التي يسببها خلوى الافراج عن 41. كبديل لالليستيريا الحرارة قتل واحد ويمكن أيضا الحصول على ردود الإنترفيرون جاما المجراة سابقا من خلال تعريض خلايا T لالببتيدات ترميز الحواتم على البروتينات يستري. في الواقع، سائد مناعيا MHC الدرجة الحواتم ليا listeriolysin وهيدرولاز P60 الثاني المقيدة وتم وصفها لC57BL / 6 و BALB / الفئران C والحواتم MHC من الدرجة الأولى سائد مناعيا وقد وصفت لBALB / ج 44. بعد نهج آخر هو أن تصيب الفئران مع سلالات من المستوحدة L. التي تم تصميمها للتعبير عن مستضدات نموذج مثل ألبومين البيض أو مولدات المضادات الفيروسية من أجل الاستفادة من MHC الدرجة I- والكواشف MHC من الدرجة الثانية، tetramer القائمة لتعداد مستضد معين خلايا تي في الفئران المصابة 45،46.
القيود الأخرى على البروتوكول
الحد آخر من هذا النموذج هو أنه سإنتاج تدابير نلي] IFN-γ من قبل خلايا المناعة في الطحال. بالإضافة إلى استخدام tetramers تعداد مستضد خلايا T معينة (من-ألبومين البيض التعبير عن المتغيرات من المستوحدة L.)، التدفق الخلوي لوحات تلطيخ الموصوفة هنا يمكن تعديلها بسهولة لقياس إنتاج السيتوكينات الأخرى مثل TNF أو IL-2 أو الجزيئات المستجيب التي تشارك في CD8 الخلايا التائية أو قتل بوساطة NK-من مسببات المرض مثل بيرفورين أو جرانزيم B. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول لدراسة IFN-γ التي تنتجها الخلايا المناعية في الكبد.
التطبيقات المستقبلية
بمجرد يتقن هذا البروتوكول، فإنه يمكن أن تكون بسيطة في نموذج الجسم الحي لفحص آثار مختلف وكلاء أو الجينات على Th1 و المناعة الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 1x in ddH2O |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Use one drop per stain |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 ml vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL/6J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 weeks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0 - 300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnostics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A.
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
- Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
