Summary
Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.
Abstract
L. monocytogenes è un batterio gram-positivo che è una causa di origine alimentare malattie negli esseri umani. infezione sperimentale di topi con questo agente patogeno è stato molto istruttivo sul ruolo delle cellule immunitarie innate e adattative e citochine specifiche immunità dell'ospite contro gli agenti patogeni intracellulari. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule innate durante l'infezione subletale con L. monocytogenes è importante per l'attivazione di macrofagi e il controllo precoce del patogeno 1-3. Inoltre, la produzione di IFN-γ da linfociti memoria adattativi è importante per l'innesco l'attivazione delle cellule innate upon reinfezione 4. La L. monocytogenes modello di infezione quindi serve come un ottimo strumento per indagare se le nuove terapie che sono progettati per aumentare la produzione di IFN-γ avere un impatto sulle risposte IFN-γ in vivo e hanno effetti biologici produttivi come l'aumento gioco batterica o migliorare la sopravvivenza del mouse da parte diinfezione. Qui descritto è un protocollo di base per il modo di condurre le infezioni intraperitoneale di C57BL / 6J topi con il ceppo EGD di L. monocytogenes e per misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK, cellule NKT e linfociti adattivi mediante citometria di flusso. Inoltre, le procedure sono descritte a: (1) crescere e preparare i batteri per l'inoculazione, (2) misurare carica batterica nella milza e nel fegato, e (3) la sopravvivenza misura animale endpoint. Dati rappresentativi sono inoltre forniti per illustrare come questo modello infezione può essere utilizzato per testare l'effetto di agenti specifici sulle risposte IFN-y a L. monocytogenes e la sopravvivenza di topi da questa infezione.
Introduction
IFN-γ è una citochina che è cruciale per mediare l'immunità contro i patogeni intracellulari e per il controllo della crescita tumorale 5. L'importanza di questa citochina nella resistenza batterica è evidente nell'osservazione che gli esseri umani con mutazioni nel percorso di segnalazione di IFN-γ sono altamente suscettibili all'infezione con micobatteri e salmonelle 6. Allo stesso modo, i topi carenti di entrambi IFN-γ o difetti del recettore espositive IFN-γ nella resistenza alla micobatteri 7-9 e altri agenti patogeni intracellulari, tra cui L. monocytogenes 10,11, Leishmania importante 12, Salmonella typhimurium 13, e alcuni virus 11. Oltre agli agenti patogeni Lotta contro, IFN-γ gioca un ruolo cruciale in Host-difesa contro i tumori 14. Sebbene maggiore produzione di IFN-γ è utile nel contesto di infezione o tumore, la produzione prolungata di questa citochina è stato collegato to lo sviluppo di autoimmunità sistemica 15-17 e l'accelerazione del diabete di tipo I nei diabetici non obesi modello di topo 18.
Le principali fonti di IFN-γ includono le cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T helper, le cellule T 1 (Th1), e linfociti T citotossici (CTL) 5,19,20. IFN-γ migliora sia innata e adattativa per: (1) up-regolazione complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II espressione, (2) aumentare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulle cellule presentanti l'antigene, (3) macrofagi migliorare fattori fagocitosi e la produzione di citochine pro-infiammatorie e microbicidi (ad esempio, l'ossido di azoto e le specie reattive dell'ossigeno), (4) promuovere la differenziazione delle cellule T CD4 + naive in cellule effettrici Th1, (5) promuovere il passaggio di classe di anticorpi di immunoglobuline ( Ig) 2a e IgG3 (nel topo), (6) inducendo la produzione di chemochine reclutare cellule immunitarie di siti di infection, e (7) miglioramento delle cellule NK e le risposte CTL 5,19. Data l'importanza cruciale di IFN-γ in risposta dell'ospite agli agenti patogeni e tumori, ricombinante IFN-γ è stato testato come trattamento per varie infezioni e neoplasie (recensito in 19). Tuttavia, a causa somministrazione sistemica di IFN-γ o citochina Th1 promuovere l'interleuchina-12 (IL-12) è associato ad effetti collaterali e dose-correlati tossicità 19,21, vi è interesse a sviluppare strategie alternative per aumentare la produzione di IFN-γ by cellule immunitarie. Sviluppo di nuovi farmaci biologici e piccole molecole richiede in strumenti di screening vivo per verificare se tali agenti aumentare la produzione di IFN-γ durante una risposta immunitaria e se questo si traduce in effetti biologici significativi come l'aumento della sopravvivenza degli animali.
Infezione sperimentale di topi con i gram-positivi batterio L. monocytogenes è stato un modello strumentale perdecifrare il ruolo di IFN-γ in host-immunità contro patogeni intracellulari 1,22. L'infezione dei topi con l'agente patogeno per via endovenosa o per via intraperitoneale (ip) porta alla rapida diffusione dei batteri alla milza e nel fegato, dove diventano internalizzati dai macrofagi residenti e epatociti con cariche batteriche picco nella milza che si verificano tra il 3 e 4 giorni post infezione 1,3,22. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK è importante per l'attivazione dei macrofagi e la resistenza precoce contro l'agente patogeno 3; tuttavia a dosi elevate infettive, la produzione di IFN-γ può anche essere dannoso alla clearance dei patogeni 23. Cellule NKT sono anche una fonte di IFN-γ nella milza e nel fegato durante il controllo precoce di agenti patogeni 2,24 e questa produzione è stato dimostrato per amplificare la produzione di IFN-γ da altri tipi di cellule, tra cui le cellule NK 2. D'altra parte, in seguito ad azione adattativi linfociti T, cellule T CD8 + in partilare, sono importanti per mediare il gioco del patogeno e della protezione contro reinfezione 1,4,22.
Questo modello di infezione è stato interessante per i ricercatori per una serie di ragioni (rivisto in 1). Innanzitutto, l'infezione con il patogeno è altamente riproducibile e induce una forte Th1 e cellulare risposta immunitaria. In secondo luogo, durante l'infezione subletali, carica batterica è concentrata nel fegato e nella milza dove può essere facilmente misurata. In terzo luogo, l'agente patogeno può essere tranquillamente gestita sotto biosicurezza di livello 2 (BSL2) condizioni. In quarto luogo, l'organismo e la risposta immunitaria che genera sono stati ampiamente caratterizzati. Infine, una varietà di ceppi mutanti e geneticamente modificati sono stati sviluppati che sono disponibili per l'uso.
Qui descritto è un protocollo di base per l'inoculazione di C57BL 6J topi / con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 e per la misura di IFN - γ resposte da NK, NKT e linfociti adattivi post-infezione. Inoltre descritto è come misurare carica batterica nella milza e nel fegato dopo l'infezione subletali e di effettuare studi di sopravvivenza dopo infezione con un modificata LD 50 dose del patogeno. Infine, dati rappresentativi sono mostrati di come questo protocollo può essere usata per selezionare l'effetto di nuovi trattamenti sulle risposte IFN-gamma e la sopravvivenza mouse dalla L. monocytogenes infezione.
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Protocol
Dichiarazione di sicurezza
Questo protocollo descrive infezione di topi con vivo L. monocytogenes. L'agente patogeno è gestito in modo sicuro in condizioni BSL2 da personale addestrato che non sono immunocompromessi. persone immunocompromessi includono le donne incinte, gli anziani e le persone che sono HIV-infetti o che hanno patologie croniche che richiedono un trattamento con la terapia immunosoppressiva. Il personale deve indossare un camice protettivo laboratorio o camice, guanti, maschera e occhiali di protezione durante la manipolazione dei campioni infetti. Il lavoro descritto nel presente documento sono state eseguite in BSL2 sotto un certificato (# 32876) che è stato rilasciato dalla University Health Network (UHN) Biosicurezza ufficio. Le carcasse di topi infetti o eventuali tessuti inutilizzati erano doppio insaccato e smaltiti nella raccolta rifiuti a rischio biologico. Gabbie da topi infetti sono stati decontaminati anche in autoclave.
Dichiarazione etica
I topi sono stati mantenuti e infettati in un Quaracamera ntine all'interno UHN strutture animali e sono stati curati in conformità con le linee guida stabilite dal Consiglio canadese sulla cura degli animali. Tutte le procedure sui topi sono stati eseguiti sotto il protocollo uso animale # 3214 che è stato approvato dal comitato di cura degli animali UHN. A causa di considerazioni etiche, la morte non è stata usata come un endpoint per gli studi di sopravvivenza. La DL 50 dosaggio modificato riportato qui per L. monocytogenes infezione è stato determinato per essere la dose alla quale il 50% dei topi raggiunto endpoint specifici, consistenti in una perdita del 20% in peso o mostrando almeno due dei seguenti segni clinici: letargia, pelliccia arruffata, la postura ingobbita, respiro affannoso, gli occhi spenti o infossati. I topi sono stati sacrificati quando hanno raggiunto gli endpoint tramite l'esposizione al biossido di carbonio (CO 2) in base alle linee guida impianto uhn.
1. Preparazione degli stock glicerolo per la conservazione a lungo termine
NOTA: Questa procedura descrive come scorte glicerolo dellaEGD ceppo di L. monocytogenes sono preparati da un stock di glicerolo originale. I passaggi che hanno il potenziale di generare aerosol devono essere eseguite all'interno di un armadio biosicurezza certificata (BSC).
- Preparare piastre di agar infuso cuore cervello (BHI) per la crescita batterica. Per questo aggiunge 3,8% (w / v) di brodo BHI e 1,5% (w / v) di agar bidistillata H 2 O (DDH 2 O). liquido Autoclave. Una volta che l'agar si raffredda a 50 ° C, erogare liquido in capsule di Petri batteriche (25 ml / piatto) e lasciare lastre secche (scoperti) nel BSC per 1 ora.
NOTA: Trasferimento BHI agar in un bagno a 50 ° C acqua dopo la sterilizzazione in autoclave per evitare la solidificazione prima di versare piatti. piastre BHI Conservare a 4 ° C a testa in giù (con il lato del supporto in alto) fino al momento dell'uso. - Preparare supporti BHI liquido. Per questo, mescolare 3,8% (w / v) di brodo BHI in DDH 2 O. Autoclave.
- Rimuovere glicerolo congelato magazzino del ceppo L. monocytogenes EGD dal -80 ° C congelamentor e disgelo a temperatura ambiente.
- Immergere una punta di pipetta sterile in stock di glicerolo scongelati e subito striscia la punta avanti e indietro attraverso una sezione di una piastra di BHI. Questa è la striscia primaria.
- Ruotare la piastra di 90 ° C e con una punta di pipetta, trascinare attraverso la prima striscia e stenderlo al prossimo ¼ della piastra (questa è la striscia secondario). Ripetere una volta di più per rendere la striscia terziario.
- Girare piatto a testa in giù e incubare a 37 ° C durante la notte. colonie uniformi singole devono essere ottenuti nella ultima serie di striature e visibile tra 16 e 24 ore.
- Dispensare 10 ml di brodo BHI sterile in un ventilato tubo da 50 ml sterile. Scegliere una colonia di L. monocytogenes dalla piastra utilizzando un puntale sterile e inoculare il brodo. Incubare la cultura in un 37 ° C incubatore orbitale agitazione durante la notte o fino a OD 600 = 1.0 con le impostazioni a 225 giri al minuto (rpm).
NOTA: Vetro o PLA usa e gettaSTIC beute possono essere utilizzati anche per batteri coltura. Indipendentemente dal tipo di contenitore utilizzato, assicurarsi che è sterile, ventilati e che il volume di coltura non superi il 20% del volume totale del contenitore per garantire un'adeguata aerazione dei batteri. - Preparare scorte glicerolo mescolando sterile 100% glicerolo con pernottamento coltura liquida batterica in un rapporto 1: 1. Distribuire la miscela batterica / glicerolo in 2 ml fiale criogeniche (500 microlitri / flacone) e fiale di trasferimento a -80 ° C per una conservazione.
NOTA: i metodi azionari tallone può essere utilizzato anche al posto di scorte glicerolo per memorizzare i batteri. Con questo metodo, microsfere porosi vengono inoculati con una coltura pura di L. monocytogenes e conservati a -80 ° C. Ciascun tallone può essere utilizzato per inoculare una coltura fresca come necessario. Vedi l'elenco dei materiali per ulteriori informazioni.
2. Determinazione della crescita curva di L. monocytogenes in Cultura Giorno Nota: questa procedura viene descritto come generare la curva di crescita per L. monocytogenes che viene utilizzato per stimare le unità formanti colonie (CFU) per gli studi di infezione. Tutte le fasi che hanno il potenziale di generare aerosol devono essere eseguite all'interno di un BSC certificata.
- Prendere 100 ml di coltura durante la notte generato nel passo 1.7 a 10 ml mezzi BHI in un tubo di sfiato 50 ml e crescere a 37 ° C in un incubatore scuotimento (225 rpm, inclinato di 45 °). Utilizzare una provetta non inoculata come controllo.
- Prendere 0,5 ml campioni della cultura a intervalli di un'ora (1, 2, 3, 4, 5, 6 hr, ecc.). Diluire ciascuna aliquota 1: 1 (v / v) con BHI media in una cuvetta di plastica. Pipetta su e giù per mescolare. Misurare la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrometro. Continuare la coltura dei batteri, fino OD 600 = 1.
- Allo stesso tempo, prendere un campione di 100 microlitri della cultura e diluire con 900 ml BHI media in una sterile 1,5 ml MICRtubo ocentrifuge (questa è la diluizione 10 -1). Centrifugare i batteri a 6.000 xg per 5 min, e aspirare il surnatante.
- Lavare batteri due volte da risospendere il pellet in 1 ml di BHI media, centrifugazione per 5 minuti a 6000 xg, e quindi aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml BHI media. Preparare una serie di diluizioni di 10 volte di questo campione a BHI mezzi (10 -2 a 10 -9). Distribuire 100 ml di ogni diluente su piastre di agar BHI separati. Incubare le piastre per una notte a 37 ° C in un incubatore.
- Il giorno successivo, scegliere piatti che hanno tra 30-300 colonie. Scartare il resto. Contare le colonie su queste tavole. La tabella 1 mostra un esempio di conteggi ottenuti in un'aliquota che è stata presa quando OD 600 = 0,84. In questo esempio, una delle piastre (cioè, 10 -6 diluizione) avevano conteggio delle colonie tra 30 minuti - 300 ed è stato utilizzato per il calcolo CFU / ml.
NOTA: Piastre con maggioredi 300 colonie non vengono utilizzati, dal momento che il sovraffollamento può ostacolare la crescita batterica e rende anche difficile da discernere e enumerare le singole colonie. Piastre con conteggi <30 non vengono utilizzate anche perché piccoli errori di tecnica di diluizione o la presenza di contaminanti possono avere un grande impatto sulla precisione dei conteggi all'estremità inferiore della gamma. - Dividere il numero di colonie dal volume placcato e poi moltiplicare per il fattore di diluizione per ottenere il valore / ml CFU per una particolare diluizione. Nell'esempio della Tabella 1, il conteggio alla diluizione 10 -6 era 70. dividere questo valore di 0,1 ml per ottenere il valore / ml CFU per coltura diluita. Poi moltiplicare questo valore per il fattore di diluizione (10 6) per ottenere il valore / ml CFU della coltura diluito (7,0 x 10 8).
- Tracciare la OD 600 (asse y) in funzione del tempo in ore (asse x) per identificare la fase logaritmica di crescita 26.
NOTA: Questo curv crescitae fornisce una stima del CFU / ml della coltura giorno se coltivate in una certa lettura OD. Scegliere un OD 600 lettura che è in fase logaritmica di crescita che può essere utilizzato come OD porta 600 per la coltivazione di colture giorno. Questi dati possono ora essere utilizzati per stimare la CFU in una cultura per la preparazione di inoculo (Procedura 3).
3. Preparazione dell'inoculo per infezione sperimentale con L. monocytogenes
NOTA: Questa procedura descrive la preparazione dell'inoculo infettante da una cultura giorno che è stato avviato da una coltura durante la notte (preparato in Procedura 2). Tutte queste operazioni vengono eseguite nel BSC se non diversamente indicato.
- Calcolare il numero di CFU richiesti per l'infezione in base al numero di topi e il disegno sperimentale dello studio. Aggiungere un volume adeguato di BHI media per un pallone o una cultura tubo Erlenmeyer ventilati sterile.
NOTA: Il CFU di batteri prepared dipenderà dal tipo di esperimento condotto. Per studiare NK e le risposte delle cellule NKT durante l'infezione, ogni mouse viene inoculato con 10 5 CFU di batteri (Procedura 6). Se lo studio adattative risposte delle cellule T a infezioni o di misura della carica batterica, ogni mouse viene inoculato con 2 x 10 4 CFU di batteri (Procedura 8). Se lo studio di sopravvivenza agli endpoint, ogni mouse viene inoculato con il DL 50 dosi del patogeno (che è 10 5 CFU per i maschi e 1,5 x 10 5 CFU per le femmine, vedere Procedura 9). - Seminare il tubo contenente mezzi BHI con 100 ml di cultura durante la notte. Incubare la cultura in un 37 ° C incubatore agitazione orbitale (225 rpm) fino a destinazione OD 600 è raggiunto. Trasferire contenuti della cultura in una provetta sterile.
- batteri centrifuga in un pellet per 5 minuti a 6000 xg utilizzando una centrifuga. Aspirare il surnatante con un aspirapolvere attaccato ad un pallone trappola contenente candeggina.
- Lavare pellet due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugazione (5 min a 6000 xg) in mezzo.
- Aspirare il secondo lavaggio e diluire i batteri alla concentrazione adeguata in PBS 1x per consegnare il CFU di interesse per ogni mouse in un volume di 200 ml.
NOTA: Si consiglia di utilizzare una fonte commerciale di sterile PBS 1x per i batteri lavaggio e per la preparazione della inoculo, in quanto laboratorio di vetreria può introdurre contaminanti immunologiche, come lipopolisaccaride.
4. infezione sperimentale di topi con L. monocytogenes
NOTA: Questa procedura descrive come infettare i topi con l'inoculo preparato in Procedura 3 e come verificare l'CFU consegnato nel inoculo. Manipolazione di topi e iniezioni vengono eseguite in un BSC.
- Ordinare un numero sufficiente di C57BL 6J topi maschio o femmina / per l'esperimento. ordinare anche i topi per servire come controlli non infetti.
- Lasciare i topi aacclimatarsi per 1 settimana prima inoculazione batterica.
NOTA: Questo è perché lo stress associato con il trasporto degli animali può innescare un aumento transitorio nella produzione di ormoni dello stress e linfopenia 27,28. - Il giorno di inoculazione, ottenere un peso corporeo iniziale per ogni mouse e registrare nel quaderno laboratorio.
- Nel BSC, miscelare la sospensione batterica su e giù con una pipetta sterile per garantire che i batteri siano distribuiti uniformemente e poi prendere 200 ml di inoculo in una siringa multistrato 1 ml sicurezza con ago 25 G.
- Iniettare un IP mouse con 200 ml di inoculo preparato (ad esempio, 10 5 CFU per l'infezione delle cellule NK, Procedura 6). Per questa procedura, collottola topi con la mano meno dominante afferrando la pelle flaccida intorno alle spalle del mouse. Dopo aver verificato che il mouse sia ben trattenuto, iniettare il mouse nel quadrante inferiore dell'addome, appena lateralmente al midline per evitare la vescica.
- Smaltire l'ago e la siringa in un contenitore a rischio biologico taglienti.
- Ripetere i passaggi 4,3-4,6 fino a quando tutti i topi vengono iniettati. Condurre le operazioni simili con 1x PBS iniettato topi (controlli non infetti).
NOTA: Dal momento che l'UFC è una stima basata sulla curva di crescita, è anche buona norma verificare l'effettiva CFU nel inoculo. Per questo, preparare 3 - 4 diverse diluizioni del inoculo preparato (con serie di diluizioni di 10 volte) che ci si aspetta si tradurrà in colonie numerabili. Distribuire 100 ml di ogni diluente su una piastra di agar BHI e incubare una notte a 37 ° C. Contare le colonie e calcolare il reale CFU / ml, come descritto nella procedura 2.
5. Preparazione al calore ucciso L. monocytogenes per gli Studi immunitario
NOTA: Tutte le fasi che hanno il potenziale di generare aerosol sono svolte all'interno del BSC.
- Grow cultura giorno fino a OD 600 valori di unri raggiunto che sono all'interno della fase logaritmica. Dispensare cultura in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
- Incubare le provette a 70 ° C in un bagno d'acqua per 1 ora per uccidere i batteri.
- Lavare i batteri due volte con PBS 1x come nei passaggi 3.3 e 3.4. Risospendere in mezzi RPMI completo sterili contenenti siero di vitello fetale (FCS) (vedi supplementare File 1 per ricetta) ad una concentrazione di 4 x 10 6 / ml. Aliquota ha ucciso i batteri in 2 ml fiale criogeniche sterile e conservare a -80 ° C.
- Confermare la morte dei batteri attraverso la diffusione di 100 ml di preparazione batteri ucciso al calore sulle piastre di agar BHI e incubando overnight a 37 ° C.
NOTA: Questi batteri ucciso al calore dovrebbe essere pronto per stimolare i linfociti in coltura in Procedura 8. Se ci sono colonie che crescono sulla piastra di agar BHI, ripetere la procedura di calore-uccisione.
6. Misure di IFN-gamma Risposte da NK e NKT cellule durante l'infezione
NOTA: Questa procedura descrive come misurare le risposte IFN-gamma da parte delle cellule NK e NKT nei topi a 24 ore dopo l'infezione con 10 5 CFU dei L. monocytogenes. Questa dose viene utilizzato perché induce robuste risposte IFN-gamma da parte delle cellule NK e NKT nella milza 24. Esegue tutte le fasi della BSC. Per aiutare a mantenere la vitalità delle cellule, a mantenere le cellule in ghiaccio, quando possibile e utilizzare i buffer ghiacciate.
- Seminare topi come descritto nella Procedura 4 con 10 5 CFU dei L. monocytogenes. Allo stesso tempo, iniettare topi di controllo non infetti IP con un volume uguale di 1x PBS.
- Euthanize topi a 24 ore post-inoculazione da CO 2 inalazione secondo le linee guida istituzionali.
- Lie ogni mouse sul lato destro e bagnare la pelle con il 70% di etanolo con una bottiglia a spruzzo.
- Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici duri taglio, incidere la pelle appena sotto la parte inferiore della gabbia toracica.
- Spray giùlo strato muscolare esposta con il 70% di etanolo. La milza dovrebbe essere visibile sotto lo strato muscolare (aperta freccia testa nella figura 1).
- Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici sottili, incidere lo strato muscolare per rivelare la milza. afferrare delicatamente la milza con le pinze e usare le forbici per tagliare bene la milza lontano da tessuto connettivo circostante.
- Posizionare la milza in un tubo da 15 ml contenente sterile PBS 1x.
- Half-riempire capsule di Petri sterili con sterili 1x PBS. Dissociare la milza attraverso un colino 70 micron cella nylon nella capsula di Petri con la parte piatta di una siringa sterile da 3 ml.
- Trasferire la sospensione splenocyte in una sterile tubo da 15 ml per mezzo di una sterile 10 ml pipetta sierologica.
- Centrifugare i campioni a 335 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante in un pallone trappola contenente candeggina. Allentare il pellet di cellule muovendo il tubo con un dito o trascinando il tubo in bassoavanti e indietro lungo una superficie corrugata (es flusso sfiato nel BSC).
- Lyse globuli rossi con l'aggiunta di 1,5 ml di ammonio-cloruro-Potassio (ACK) tampone di lisi (vedi Supplemental File 1 per ricetta) per ogni milza. Dopo esattamente 1 minuto e 15 secondi, riempire il tubo con PBS 1x per fermare la lisi cellulare.
- cellule centrifuga come descritto al punto 6.10. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di cellule di fluorescenza-attivato (FACS) Buffer (sterile 1x PBS contenente 2% FCS).
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per questo, prendere due aliquote di sospensione cellulare per il conteggio. Aggiungere 15 ml di ciascuna sospensione cellulare in un uguale volume di Trypan blue (0,04%, fatta diluendo 0,4% trypan blue soluzione in DDH 2 O). Carico 15 ml di ciascuna cella / Trypan blue sospensione nella camera del emocitometro (cioè, uno nella camera superiore, uno nella camera inferiore).
- Utilizzando un microscopio, contare tutte le cellule non-blu incinque grandi piazze della griglia centrale in ciascuna camera (Figura 2). Prendere questo conteggio e dividerlo per 10 per ottenere il numero di cellule in 10 6 / ml. Nell'esempio di figura 2, il conteggio è di 215 cellule nei 5 quadrati; Pertanto, la concentrazione cellulare è 21,5 x 10 6 / ml. Calcolare la media dei concentrazioni cellulari ottenute dai due campioni.
- Seed 1 x 10 6 cellule per pozzetto / macchia in un piatto fondo rotondo a 96 pozzetti per citometria a flusso colorazione. Assicurati di seminare anche le cellule per uno senza macchia e la fluorescenza meno controlli (FMO). Vedere flusso consigliato citometria pannello colorazione nella tabella 2.
NOTA: Per le seguenti operazioni, si raccomanda di mantenere le cellule in ghiaccio o a 4 ° C e per proteggere le cellule dalla luce con un foglio quando fluorocromi sono presenti. Una pipetta multicanale può essere usato per erogare liquidi in piastre a 96 pozzetti di colorazione per accelerare l'elaborazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet quandoaspirare il supernatante dalla piastra centrifugato. La colorazione può essere effettuata anche in tubi FACS se la centrifuga non è dotato di adattatori piastra. Tutte le fasi di centrifugazione da questo punto in poi sono fatte a 456 xg per 5 minuti a 4 ° C. - Centrifugare la piastra e poi lavare le cellule due volte con tampone FACS. Un lavaggio è fatto aggiungendo 200 microlitri di tampone FACS a ciascun pozzetto, centrifugazione la piastra, e quindi aspirare il surnatante.
- Eseguire il passaggio di blocco con l'aggiunta di 50 ml / pozzetto di tampone FACS contenente anti-topo CD16 / CD32 (purificata blocco Fc) (0,5 mg). Incubare le cellule a 4 ° C per 15 min. Lavare le cellule una volta in PBS 1x come descritto sopra.
- Aggiungere 100 microlitri vitalità colorante (dye vitalità risolvibile diluito 1: 1000 in PBS 1x) per le cellule. cellule Stain a 4 ° C al buio (in frigorifero) per 30 min. Lavare le cellule due volte in tampone FACS come descritto sopra.
- Dopo un secondo lavaggio, aggiungere 100 ml di anticorpi di superficie cellulare o tetrameri a rispettivi pozzetti secondo to il pannello colorazione descritte nella Tabella 2. cellule Stain a 4 ° C al buio (in frigorifero) per 30 min. A questo punto, aggiungere anche gli anticorpi per la colorazione singoli controlli positivi e FMO.
NOTA: Per quanto riguarda singoli controlli positivi, si consiglia di entrambi splenociti d'uso che sono macchiati con le varie versioni fluorocromi dell'anticorpo CD4 o sfere di compensazione commerciali che si sono macchiati con gli anticorpi utilizzati nel pannello. Prima di svolgere questa procedura di colorazione, tutti gli anticorpi FACS deve essere aggiustato con studi di prova per determinare le concentrazioni ottimali per la colorazione. - Lavare le cellule due volte in tampone FACS come sopra descritto e quindi fissare le cellule da essi risospendere in 50 ml di paraformaldeide al 4% (16% paraformaldeide magazzino diluita in DDH 2 O) e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato solo nella cappa.
- Lavare le cellule due volte in buffer di FACS, centrifugazione in mezzo. Risospendere le cellule in tampone FACS. Continuare a successivi cellule step o conservare in frigorifero al riparo dalla luce per un massimo di tre giorni.
- cellule centrifuga, rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte con 150 ml di 1x Permeabilizzazione / Wash Buffer (tampone di Perm / Wash), centrifugazione in mezzo. Il / Wash Buffer Perm viene preparato da uno stock 10x diluendo 1: 9 (v / v) in DDH 2 O.
- Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in 150 microlitri di Perm / tampone di lavaggio e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
- cellule centrifuga di nuovo e poi aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 50 ml di tampone 1x Perm / Wash contenenti anti-IFN-γ e incubare per 1 ora a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule due volte con tampone 1x Perm / Wash, centrifugazione in mezzo. Risospendere le cellule in 250 ml di buffer di FACS e poi trasferire le cellule a tubi FACS.
- Procedere alla citometria a flusso acquisizione utilizzando un flusso cytometer che ha una configurazione laser e filtro insieme appropriato di discriminare fluorocromi usati nel pannello colorazione descritto nella Tabella 2 29. Raccogliere almeno 200.000 eventi per campione e 10.000 eventi per i controlli di compensazione.
- Applicare matrice di compensazione e analizzare i dati utilizzando citometria a flusso software di analisi 30.
7. Misura della carica batterica nella milza e il fegato al momento dell'infezione Peak
NOTA: Tutte le operazioni vengono eseguite all'interno di un BSC se non diversamente specificato.
- Inoculare topi IP con 2 x 10 4 CFU del patogeno utilizzando procedure descritte in Procedura 4.
- Il giorno 3 dopo l'infezione, preparare sterili provette da 1,5 ml microcentrifuga, ciascuna contenente 500 ml di ghiacciata sterile 0,1% Triton X-100 in PBS 1x e 0.2 - 0.3 g di 1,5 - perline di vetro sterile d'acido 2 mm. Pesare ogni tubo.
NOTA: Perle di vetro sono l'acido lavati da incumacerazione in acido acetico al 10% in un becher su un agitatore magnetico per 1 ora. Queste perle sono poi ampiamente lavati con DDH 2 O per rimuovere l'acido, sono essiccati all'aria, e poi in autoclave prima dell'uso. - Euthanize topi di esposizione CO 2.
- Per la dissezione degli organi, gettare l'animale sul dorso su una tavola di dissezione e pin le membra del mouse al bordo con 25 aghi G. Disinfettare la pelle bagnando con il 70% di etanolo.
- Utilizzando sterili forbici taglio difficili, fare una incisione mediana nella pelle dall'inguine alla metà petto e poi dalla metà inguine verso ciascun ginocchio e dalla metà petto verso ogni curva. sezionare Blunt e riflettere indietro la pelle, pinning è aperto con 25 aghi G.
- Disinfettare strato muscolare bagnando con il 70% di etanolo e poi con le forbici sottili sterili fare una incisione mediana nella parete peritoneale. Afferra il processo xifoideo con una pinza. Poi, usando le stesse forbici sottili, fare dei tagli nella parete peritoneale dalla proce xifoidess lateralmente su ciascun lato, a seguito della gabbia toracica, appena sotto il diaframma per rivelare il fegato.
- Tagliare un pezzo mg ~ 100 del fegato (utilizzare lo stesso lobo per tutti i mouse) con le forbici sterili e collocarlo in un tubo di 1,5 ml di pre-pesato microcentrifuga.
- Utilizzare pinze di spingere da parte gli organi sul lato sinistro della cavità peritoneale per visualizzare la milza. afferrare delicatamente la milza con un paio di pinze e rilasciarlo dalla cavità peritoneale tagliando via il tessuto connettivo circostante.
- Posizionare la milza nel tubo pre-pesato 1,5 ml microcentrifuga contenente microsfere. Transport tessuti al laboratorio in un recipiente contenente ghiaccio a perfetta tenuta. Re-pesare i tubi contenenti gli organi per determinare i pesi dei tessuti in mg.
- Omogeneizzare i tessuti agitando i tubi utilizzando un cordone mulino omogeneizzatore per 3 min a frequenza 30 Hertz.
NOTA: Il metodo mulino tallone è preferito per omogeneizzazione in quanto è suscettibile di procescantare un gran numero di campioni e crea meno confusione e potenziale esposizione al patogeno. Tuttavia, omogeneizzatori automatiche o sterilizzati in autoclave 2 ml omogeneizzatori di tessuto di vetro manuale potrebbero essere utilizzati come alternativa. - Preparare una serie di diluizioni di 10 volte degli omogenati a 0,1% Triton-X-100 in PBS 1x, che vanno da (da non diluito a 10 -7).
- Distribuire 100 ml di ogni omogenato diluito su una piastra di agar BHI (in duplice copia) utilizzando una spatola sterile. piastre di trasferimento ad un 37 ° C incubatore e incubare una notte.
- Mantenere le piastre che contengono da 30 a 300 colonie / piastra, scartare il resto. Contare colonie su ciascuna piastra e determinare il numero medio di colonie per spread duplicati.
- Calcolare il CFU / mg secondo la seguente equazione:
CFU / mg = CFU / ml nel omogeneizzato, moltiplicata per i ml di omogenato preparati, diviso per il peso mg del tessuto omogeneizzato.
NOTA: Ad esempio, se una media di 30 colOnies state contate dopo la placcatura 100 pl di 10 -2 omogenato diluito preparata da un pezzo 120 mg di fegato che è stato omogeneizzato in 0,5 ml, i calcoli sarebbe come segue:
(Fattore di diluizione) / ml = 30 colonie x 100 CFU / ml (0,1 volumi spread) = 30.000 CFU / ml.
CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml omogeneizzato / 120 mg di tessuto = 125 CFU / mg.
8. Effetti di L. monocytogenes sulle risposte IFN-gamma da parte CD4 + e CD8 + cellule
NOTA: Questa procedura descrive come misurare la produzione di IFN-γ da milza CD4 + e cellule effettrici T CD8 + raccolte al momento del picco della risposta adattativa immunitaria (~ 7 d post-infezione) utilizzando due metodi: (1) il flusso citometria di misurare IFN-gamma da CD4 + e CD8 + da intracellulare colorazione delle citochine, e (2) ELISA per misurare i livelli totali di IFN-γ prodotti da splenociti (include tutte le cellule T). procedurevengono eseguite all'interno del BSC.
- Infect topi iniettando ip con 2 x 10 4 CFU del patogeno utilizzando procedure descritte nella Procedura 4.
- Il giorno 7 dopo l'infezione, eutanasia topi da CO 2 inalazione secondo le linee guida istituzionali.
- Sezionare la milza (come descritto sopra) e mettere in un tubo da 15 ml contenente sterile PBS 1x. Trasportare i tubi al laboratorio in un recipiente contenente ghiaccio a tenuta stagna.
- Elaborare la milza in una sospensione singola cella, la lisi dei globuli rossi come descritto nella sezione 6, e poi risospendere le cellule in mezzi RPMI completo contenente il 10% FCS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Impostare le culture per la misurazione delle risposte IFN-g. Per queste cellule di erogazione (4 x 10 6 in 1 ml / pozzetto) in piastre da 24 pozzetti insieme e uguale numero (4 x 10 6 o 1 ml / pozzetto) di calore ucciso scongelati L. monocytogenes (preparato in Procedura 5) . Trasferire le cellule in un 37° C incubatore.
- Dopo 20 ore di incubazione, aggiungere 0,66 microlitri / ml di inibitore della proteina di trasporto di pozzi e continuare incubazione.
- Quattro ore più tardi, piastra di trasferimento BSC e raccogliere 500 ml di cultura surnatante e congelamento (a -80 ° C) per la misura successiva di livelli di IFN-gamma utilizzando un kit commerciale 31 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Poi raccogliere le cellule in una provetta sterile 15 ml. Lavare i pozzetti con PBS 1x e in comune questo lavaggio insieme con cellule raccolte.
- Effettuare la colorazione della superficie cellulare e colorazione intracellulare per IFN-γ on CD4 + e CD8 +, come descritto nella Procedura 6 eccezione di usare il pannello di colorazione descritta nella Tabella 3. Procedere al citofluorimetro acquisizione (la raccolta di 200.000 eventi / campione) e analizzare i dati 29 citometria a flusso software di analisi 30.
9. Misurare il mouse di sopravvivenza agli endpoint dopo L. monocytogenes infezione
NOTA: Questa procedura descrive l'effetto di un agente sulla sopravvivenza del mouse per gli endpoint post-infezione con il DL 50 modificato la dose del patogeno. Tutte queste procedure sono condotte nel BSC nel stabulario.
- Iniettare topi IP con il DL 50 modificato dose di L. monocytogenes, come descritto nella Procedura 4. Questo è stato determinato per essere 10 5 CFU (per i maschi) o 1,5 x 10 5 CFU (per le femmine) 31.
- Seguire topi due volte al giorno per i segni clinici e registrare questi segni e peso corporeo degli animali in un quaderno di laboratorio. Euthanize topi se mostrano una perdita del 20% del peso corporeo o due segni clinici di listeriosi (letargia, pelliccia arruffata, la postura ingobbita, respiro affannoso, gli occhi spenti o incavati).
- Dopo 14 giorni, sopravvivendo eutanasia topi con CO 2 inalazione.
- Preparare Kaplan-Meier appezzamenti di dati tracciando la sopravvivenza per cento di ogni gruppo contro il tempo 32.
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Representative Results
La figura 3 presenta alcune tipico flusso citometria colorazione di IFN-γ in cellule NK e NKT milza a dopo l'infezione 24 ore con 10 CFU 5 del patogeno. Questa figura illustra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritto nella Tabella 2. La figura 4 mostra alcuni dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati con la IS001 o il veicolo di controllo PPARa antagonista, infettati con 10 CFU 5 L. monocytogenes, e poi analizzato per IFN-γ in cellule NK e NKT dopo 24 ore . Questo dato dimostra che il trattamento con IS001 potenziato le risposte IFN-gamma da parte delle cellule NKT, ma le cellule NK non dopo l'infezione con l'agente patogeno. La Figura 5 mostra colorazione rappresentante per IFN-γ in cellule T CD8 + milza CD4 + e 7 giorni dopo l'infezione dopo la ri-stimolazione ex vivo con pa ucciso al calorethogen. Questa figura mostra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritta nella Tabella 3. La figura 6 mostra i dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati giornalmente con l'antagonista IS001 o di un veicolo di controllo PPARa, infettati con una dose subletale di L. monocytogenes, e analizzati a 7 giorni dopo l'infezione. Questo esperimento dimostra che il trattamento con IS001 migliorato risposte IFN-gamma da parte sia CD4 + e CD8 + linfociti. La Figura 7 mostra i dati rappresentativi di uno studio che ha studiato l'effetto dell'antagonista IS001 PPARa sulla sopravvivenza mouse per endpoint dopo l'infezione con il modificata DL 50 dose del patogeno. Tracciata è la sopravvivenza per cento dei topi contro il tempo dopo l'infezione. Questo dato dimostra che il trattamento con IS001 ha aumentato la sopravvivenza dei topi maschi agli endpoint. Insieme, questi dati dimostrano come questo modello può essere applicato per indagaregli effetti di nuovi farmaci o trattamenti sulle risposte IFN-γ in vivo e per esplorare come questi cambiamenti immunitari impatto sopravvivenza degli animali dall'infezione.
Figura 1. Dissezione la milza di topi infetti. Questa serie di foto mostra come sezionare la milza da un topo morto. (a) Lie il mouse sul lato destro e spruzzare giù la pelle con il 70% di etanolo. (b) Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici difficili taglio, incidere la pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica. (c) Spray giù lo strato muscolare esposta con il 70% di etanolo. La milza dovrebbe essere visibile sotto lo strato muscolare (aperto punta di freccia). (d) Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici sottili, incise lo strato muscolare per rivelare la milza. (e) afferrare delicatamente la milza con le pinze e uSE forbici sottili per tagliare la milza dal circostante tessuto connettivo. (f) Posizionare la milza in un tubo da 15 ml contenente sterile PBS 1x. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. splenociti di conteggio con un emocitometro. (a) mostra la griglia centrale del emocitometro. (b) mostra una vista ingrandita della griglia centrale che contiene 25 grandi piazze (che contengono ciascuno 16 quadrati più piccoli). I cinque grandi piazze utilizzati per il conteggio sono evidenziate in grigio (4 piazze d'angolo, più il quadrato centrale nella griglia centrale). (c) mostra una vista ingrandita di uno dei grandi quadrati grigi. Per determinare il volume della cella in 10 6 / ml, primo conteggiotutte le cellule vitali all'interno dei cinque grandi quadrati grigi. Nell'esempio illustrato, questo conteggio è 215. Quando il conteggio, assicurarsi di contare solo tutti i (non-blu) cellule chiare, comprese quelle che toccano il doppie linee a destra e inferiore della griglia. Non contare le cellule che toccano le doppie linee a sinistra e la parte superiore della griglia. Prendere totale cinque conteggio quadrata e dividerlo per 10 per ottenere il numero di cellule in 10 6 / ml. Nell'esempio, 215 diviso 10 è 21,5 x 10 6 cellule / ml. Si noti che questi calcoli funzionano solo se si contano 5 delle grandi piazze come evidenziato e diluire le cellule 1: 1 in trypan blu. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. strategia di gating per il rilevamento di IFN-γ Produzione in cellule NK e NKT. Prima porta sui linfociti in FSC-A di SSC-Una trama. Poi cancello a quegli eventi che sono sulla diagonale sul FSC-H / FSC Una trama. Queste sono le canottiere. Poi cancello dal vivo (AmCyan -) e CD8 - cellule. Poi tracciare la colorazione tetramero contro TCRβ. Le cellule NKT sono all'interno della popolazione doppia positivo e le cellule NK sono all'interno della popolazione doppia negazione. Porta sulle cellule doppio positive, e la trama NKp46 contro FSC. Porta sulla popolazione negativo NKp46, che sono le cellule NKT (questa porta può essere impostato trovare il punto di divisione nei due popolazioni di trama cellule NK). Le cellule NK sono tetramero - TCRβ - NKp46 + popolazione. All'interno NK e NKT porte delle celle, le celle + IFN-gamma nel canale PE sono identificati dopo aver impostato un cancello basato sul controllo FMO. Si prega di fare clicqui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentante dati ottenuti per le frequenze di cellule NK e NKT IFN-γ + a 24 ore dopo l'infezione. In questo esperimento, maschi C57BL / 6J (N = 3 - 4 / gruppo) sono stati infettati con ip 10 5 CFU di L. monocytogenes o sono stati lasciati non-infetti. I topi sono stati somministrati anche il IS001 farmaco o veicolo (0,5% carbossimetilcellulosa) allo stesso tempo di inoculazione e 12 ore più tardi. Ventiquattro ore dopo l'inoculazione, i topi sono stati sacrificati e le milze sono stati rimossi e sono stati elaborati singolarmente e colorate per citometria a flusso. Vengono mostrati la media ± SEM di frequenza delle cellule NK IFN-γ + (a) o cancelli cellule NKT (b) nei topi non infetti o infetti dopo il trattamento con un veicolo o IS001 droga. *Indicaredifferenza sa (P <0.05) dal controllo del veicolo da T-test a due code. I dati sono ri-stampati da 31 con il permesso del Journal of Immunology (volume 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. strategia di gating per il rilevamento di IFN-γ produzione nelle cellule CD4 e CD8. Prima porta sui linfociti in FSC-A di trame SSC-A. Poi cancello a quegli eventi che sono sulla diagonale sul FSC-H / FSC Una trama. Queste sono le canottiere. All'interno di questa porta, cancello a (AmCyan -) dal vivo le cellule CD45 +. Poi porta sulle popolazioni sia CD8 + e CD4 +. All'interno di ogni porta, la IFN-γ +cellule nel canale PE sono identificate confrontando la colorazione al controllo FMO. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Rappresentante dati ottenuti per le frequenze di cellule CD4 + e CD8 + IFN-γ + a 7 giorni dopo l'infezione da L. monocytogenes (ceppo EGDS). In questo esperimento, maschio / 6J C57BL sono stati infettati con ip 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / gruppo) o sono stati lasciati non infetti (N = 3 / gruppo). I topi sono stati somministrati anche il IS001 farmaco o veicolo (0,5% carbossimetilcellulosa) due volte al giorno a partire dal giorno di inoculazione. Sette giorni dopo, i topi sono stati sacrificati e le milze sono stati rimossi e sono stati trattati singolarmente percoltura cellulare. Cellule mononucleate splenocyte sono state stimolate per 24 ore con calore ucciso L. monocytogenes con il trasporto di proteine inibitore per la finale 4 ore della cultura. Le cellule sono state poi colorate per citometria a flusso. Vengono visualizzati i media ± SEM di frequenza di IFN-γ + cellule CD4 in (a) + o cancelli delle cellule CD8 + (B) nei topi non infetti o infetti dopo il trattamento con un veicolo (carbossimetilcellulosa 0,5%) o la IS001 di droga. * Indica una differenza (P <0.05) dalla controparte controllo del veicolo, come determinato mediante il test T a due code. I dati sono ri-stampati da 31 con il permesso del Journal of Immunology (volume 195, pp. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Rappresentante dati ottenuti nel corso di un esperimento che ha confrontato l'effetto di un antagonista PPARa 1S001 sul mouse sopravvivenza agli endpoint dopo l'infezione di Male C57BL / 6J con L. monocytogenes (ceppo EGDS). In questo esperimento, maschi C57BL / 6J (N = 10 topi / gruppo) sono stati infettati con il ip modificato DL 50 dosi del patogeno (10 CFU 5) di L. monocytogenes. I topi sono stati somministrati anche il IS001 farmaco o veicolo (0,5% carbossimetilcellulosa) due volte al giorno a partire dal giorno di inoculazione. I topi sono stati seguiti tutti i giorni per i segni clinici e sono stati sottoposti ad eutanasia se gli endpoint umane sono state soddisfatte. Viene mostrato la sopravvivenza per cento dei topi per endpoint nel tempo * indica una differenza nella sopravvivenza tra i gruppi come determinato dal log-rank test (P <0,05). I dati sono ri-stampati da 31 con il permesso del Journal of Immunologia (volume 195, pp. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: mostra alcuni calcoli rappresentativi per la determinazione CFU in una frazione della cultura Giorno. In questo esempio, una aliquota della coltura giorno è stata presa e fu diluito 1: 1 con BHI media. La OD 600 di questo campione diluito è stato determinato per essere 0,84. Inoltre, un'aliquota di 100 microlitri è stata presa per la determinazione CFU. Questo campione è stato diluito con 900 ml di BHI supporti (10 -1) e fu lavato e risospeso in 1 ml BHI. Una serie di diluizioni di 10 volte di questo campione è stato preparato (10 -2 a 10 -9) e campioni diluiti sono stati placcati in BHI agapiastre r (valori solo per 10 -4 a 10 -9 sono mostrati). Le colonie giorno dopo sono stati contati. Solo i piatti che avevano i numeri di colonie tra 30-300 sono stati considerati per il calcolo (ad esempio, 10 -6 piatto, evidenziato in giallo). Il numero di colonie su questa piastra (70) è stato poi diviso per 0,1 (volume in ml placcato) per ottenere il CFU / ml del campione diluito. Questo valore è stato quindi moltiplicato per il fattore di diluizione (10 6) per ottenere la lettura / ml CFU della coltura non diluito. TMTC = troppi per contare.
Tabella 2: Pannello di colorazione per il rilevamento di IFN-γ in NK e NKT cellule. Si noti che entrambi sfere di compensazione colorate con gli anticorpi di flusso utilizzati nel pannello o splenociti macchiati con le varie versioni di fluorocromi CD4 anticorpi clone GK1.1 possono essere utilizzati come singoli controlli positivi.
Tabella 3: Pannello di colorazione per il rilevamento di IFN-γ in CD4 + e CD8 + cellule. Si noti che entrambi sfere di compensazione colorate con gli anticorpi di flusso utilizzati nel pannello o splenociti macchiati con le varie versioni di fluorocromi CD4 anticorpi clone GK1.1 possono essere utilizzati come singoli controlli positivi.
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Discussion
Qui si descrive un protocollo di come effettuare una infezione sperimentale di base con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 in C57BL 6J maschi o femmine /. Questo protocollo è stato istituito con lo scopo di studiare l'effetto di un romanzo piccola molecola IS001 sulla produzione di IFN-γ da parte dei linfociti innata e adattativa in vivo 31. Monitorando la clearance batterica e la sopravvivenza dopo l'infezione, intuizioni sono state acquisite in modo questi cambiamenti nella IFN-γ influenzato la capacità del padrone di casa per controllare l'infezione.
Considerazioni critiche nel protocollo
Una considerazione importante nella progettazione di questo tipo di studio è che ogni esperimento sia adeguatamente alimentato e controllata in modo appropriato. A causa di variazione biologica nella risposta immunitaria all'infezione (vedi figure 4 e 6), si raccomanda che N = 4 - 5 topi per gruppo deve essere usato per gli studi immunitarie iniziali. Se unopo questi studi c'è una tendenza nei dati, ma nessuna differenza significativa tra i gruppi apparente, un calcolo di potenza potrebbe essere fatto per determinare il minor numero di animali necessari in studi successivi per raggiungere la significatività statistica. Per quanto riguarda i controlli, è importante includere i controlli non infetti per la determinazione del valore basale risposte IFN-gamma per gli studi immunitarie e veicolo controllo per aiutare a distinguere l'effetto del trattamento da parte lo stress associato con la somministrazione del trattamento. Un'altra considerazione importante è la tempistica del trattamento. Poiché la risposta innata di L. monocytogenes è molto rapida, si raccomanda che il primo trattamento essere somministrato il giorno prima o contemporaneamente come, inoculazione per assicurare che i livelli terapeutici di reagente essere raggiunto prima l'inizio della risposta immunitaria innata.
Un'altra considerazione importante è la dose del patogeno da utilizzare per infection. Una dose subletale è raccomandato per la misura della carica batterica, in quanto aumenta la probabilità che il patogeno sarà concentrata all'interno milza e del fegato, consentendo l'enumerazione più accurata dei batteri. Una dose subletale è consigliato anche per enumerare le risposte IFN-gamma da parte dei linfociti adattivi per garantire che gli animali non soccombere alla listeriosi prima del momento di espansione delle cellule T di picco. Al contrario, si raccomanda una dose più alta infettiva essere usato per misurare la risposta cellulare precoce NK e NKT a 24 ore al fine di massimizzare la produzione di IFN-γ da queste cellule.
Il LD classica 50 è la dose di agente patogeno che provoca il 50% di mortalità dei topi. Dal momento che la morte non era un endpoint accettabile a nostro istituto e dal momento che molti sintomi di listeriosi possono predire se un animale rischia di soccombere ad una infezione, abbiamo utilizzato un elenco definito di segni clinici, invece della morte come un endpoint nei nostri studi. Using questo metodo, si è stabilito che il LD modificato 50 era 10 5 CFU per 8 settimane di età maschi e 1,5 x 10 5 CFU per 8 settimane di età femminile C57BL / 6J topi 31. Questi LD 50 dosi sono stati determinati misurando la percentuale di sopravvivenza di topi per endpoint in studi di dose-escalation graduale (N = 5 studi in totale) che contenevano N = 8 topi per gruppo (ad esempio, i topi sono stati infettati prima con 10.000 CFU , poi un secondo lotto di 20.000 CFU, ecc). Il calcolo DL 50 è stata determinata da un terreno regressione del log (CFU) (asse x) rispetto al probit dei valori percento sopravvivenza (asse y) (sito: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).
Si noti che la modifica DL 50 dosi determinato nel nostro laboratorio può differire da quello in un altro laboratorio, anche quando infettare i topi con lo stesso ceppo di L. monocytogenes. Parte di questa variabilità può riguardare il soggettivo la natura of monitoraggio segni clinici di listeriosi rispetto al punto finale più assoluto di morte. variabilità aggiuntiva può derivare da differenze nei fattori ambientali come la dieta mouse o il microbiota o le differenze nella preparazione di inoculo tra i laboratori. Pertanto, si raccomanda che prima di intraprendere studi di sopravvivenza, uno studio pilota essere effettuato nel luogo topi femmina (N = 8 topi / gruppo) sono infettati da 1,5 x 10 5 CFU dello stesso ceppo di L. monocytogenes usati in questo studiano e sintomi controllati per accertare se questa dose si traduce infatti nel 50% di sopravvivenza agli endpoint. Se la sopravvivenza è inferiore o superiore al 50% in questa CFU, studi de-escalation graduale aumento della dose o dosi potrebbero essere eseguite per restringere rapidamente la dose DL 50.
Un'altra considerazione importante è il ceppo o sottoceppo di topi utilizzati per gli studi di infezione. Questo protocollo descrive l'infezione del comunemente usato inbred ceppo di topi C57BL / 6J. Questo ceppo è ben adatto per la misurazione delle risposte IFN-y poiché questo mouse è considerato un Th1-inclini ceppo 33 e, di conseguenza, è relativamente resistente alla L. monocytogenes infezione (rispetto ai ceppi Th2 inclini topo come BALB / c) 34,35. Adattamento questo protocollo per altri ceppi di topi richiede la conoscenza della dose infettiva del patogeno per il particolare ceppo. Si raccomanda inoltre di utilizzare i topi della stessa età, il sesso e il venditore, come descritto in questo protocollo, al fine di ridurre la quantità di risoluzione dei problemi coinvolti nella creazione del modello. Ad esempio, C57BL / 6 topi ordinato da un fornitore (ad esempio, C57BL / 6J) può esibire differenze genetiche rispetto C67BL / 6 topi ordinati da un altro fornitore (ad esempio, C57BL / 6NTac) 36. Inoltre, il microbiota intestinale differisce tra C57BL / 6 substrains ottenuti da fornitori diversi, che possono influenzare l'equilibrio delle risposte Th1 e Th17 nel topo 37.
ove_title "> Possibili modifiche alla tecnicaI topi sono più comunemente inoculati ip o endovenosa in contrasto con la via naturale di infezione nell'uomo, che è attraverso il tratto gastrointestinale. Infezioni orali sono meno comuni a causa ceppi standard di L. monocytogenes inefficiente infettano l'epitelio intestinale di topi 38. Questo è perché c'è un singolo cambiamento aminoacido nella sequenza di topo E-caderina da E-caderina umana che si traduce in perdita di riconoscimento della E-caderina dalla proteina dall'invasione listerial, internalin A (Inia) 39. Per superare questo ostacolo, i ricercatori utilizzano topi che sono transgenici per la proteina E-caderina uso umano o listeria che sono state progettate per esprimere una sequenza mutata di Inia (Inia mut) che si lega al topo E-caderina con la stessa affinità come WT EGD per umano E-caderina 40. Così, una modifica potenziale di questa tecnica è quello di infettare topi per via orale. Il lettore si riferisce a un'altra pubblicazione JoVE che descrive i metodi di inoculazione orale 38. Notare che modificando la modalità di infezione influenzare la dose infettiva e le cinetiche di diffusione del patogeno.
Questo protocollo descrive usando listeria calore ucciso a suscitare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule CD4 + e CD8 +. Ucciso al calore L. monocytogenes è stato scelto come stimolo nei nostri studi, perché questo antigene è poco costoso e perché il nostro laboratorio era interessato principalmente le risposte delle cellule T CD4 + al patogeno. Una limitazione è che i batteri uccisi al calore non fanno efficiente primi CD8 risposte delle cellule T sia in vitro o in vivo 41 42,43 infezione. Così, la produzione di cellule CD8 + T IFN-γ che abbiamo osservato da splenociti raccolti al picco di infezione (cioè, la figura 6) probabile è in risposta alla residuabatteri vivi presenti nelle colture splenocyte o è stata evidenziata come risultato di citochina citochine indotta rilascio 41. Come alternativa alla listeria ucciso al calore, si potrebbe anche ottenere risposte IFN-gamma ex vivo esponendo le cellule T di peptidi che codificano epitopi sulle proteine listerial. Infatti, epitopi per listeriolysin O e l'idrolasi p60 immunodominante MHC di classe II-limitata e sono stati descritti per immunodominanti epitopi MHC di classe I C57BL / 6 e BALB / C di topo e sono state descritte per BALB / c 44. Un altro approccio è quello di infettare i topi con ceppi di L. monocytogenes che sono state ingegnerizzate per esprimere antigeni modello, come ovalbumina o antigeni virali, al fine di trarre vantaggio da esistente MHC di classe I e reagenti MHC di classe II-tetramero per enumerare antigene-specifica Le cellule T nei topi infettati 45,46.
Le limitazioni del protocollo
Un altro limite di questo modello è che ola produzione di misure NLY IFN-γ da cellule immunitarie nella milza. Oltre all'uso di tetrameri enumerare specifiche cellule antigene T (di ovalbumina esprimono varianti di L. monocytogenes), citofluorimetria pannelli di colorazione descritti qui può essere facilmente modificato per misurare la produzione di altre citochine quali TNF o IL-2 o molecole effettrici che partecipano a cellule T CD8 o l'uccisione NK-mediata del patogeno, come perforina o granzyme B. inoltre, questo protocollo potrebbero anche essere adattati per esaminare IFN-γ prodotto dalle cellule del sistema immunitario nel fegato.
Applicazioni future
Una volta che questo protocollo è padroneggiata, può servire come un semplice modello in vivo per lo screening gli effetti dei vari agenti o geni Th1 e immunità cellulare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 1x in ddH2O |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Use one drop per stain |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 ml vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL/6J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 weeks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0 - 300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnostics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
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