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Immunology and Infection

La infección experimental con Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

Abstract

L. monocytogenes es una bacteria gram-positiva que es una causa de enfermedad transmitida por alimentos en seres humanos. La infección experimental de ratones con este patógeno ha sido altamente informativo sobre el papel de las células inmunes innatas y adaptativas y citocinas específicas en la inmunidad del huésped contra los patógenos intracelulares. La producción de IFN-γ por las células innatas durante la infección subletal con L. monocytogenes es importante para la activación de los macrófagos y el control temprano del patógeno 1-3. Además, la producción de IFN-γ por los linfocitos de memoria de adaptación es importante para la imprimación de la activación de las células innatas a la reinfección 4. La L. monocytogenes modelo de infección por lo tanto sirve como una gran herramienta para investigar si las nuevas terapias que están diseñados para aumentar la producción de IFN-γ tener un impacto en las respuestas de IFN-γ in vivo y tienen efectos biológicos productivos, tales como el aumento de la eliminación de bacterias o la mejora de la supervivencia del ratón deinfección. Se describe aquí es un protocolo básico para cómo llevar a cabo las infecciones intraperitoneales de ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y para medir la producción de IFN-γ por las células NK, células NKT, y linfocitos de adaptación por citometría de flujo. Además, los procedimientos se describen a: (1) crecer y preparar las bacterias para la inoculación, (2) medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado, y (3) la supervivencia medida de los animales a los puntos finales. También se proporcionan datos representativos para ilustrar cómo este modelo de infección se puede utilizar para probar el efecto de agentes específicos en las respuestas de IFN-gamma a L. monocytogenes y la supervivencia de los ratones de esta infección.

Introduction

IFN-γ es una citoquina que es crucial para la mediación de la inmunidad contra los patógenos intracelulares y para controlar el crecimiento del tumor 5. La importancia de esta citocina en la resistencia bacteriana es evidente en la observación de que los seres humanos con mutaciones en la vía de señalización de IFN-γ son altamente susceptibles a la infección por micobacterias y salmonelas 6. De manera similar, los ratones deficientes en IFN-γ o los defectos de exhibición receptor de IFN-γ en la resistencia a las micobacterias 7-9 y otros patógenos intracelulares, incluyendo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, y ciertos virus 11. Además de los agentes patógenos que combaten, IFN-γ juega un papel crucial en la defensa de huésped contra tumores 14. Aunque una mayor producción de IFN-γ es beneficioso en el contexto de la infección o el cáncer, la producción prolongada de esta citocina se ha relacionado to el desarrollo de autoinmunidad sistémica 15-17 y la aceleración de la diabetes tipo I en el modelo de ratón diabético no obeso 18.

Las principales fuentes de IFN-γ incluyen células NK, células NKT, delta gamma células T, células T auxiliares 1 (Th1) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto la inmunidad innata y adaptativa por: (1) hasta la regulación de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II expresión, (2) el aumento de la expresión de moléculas co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno, (3) los macrófagos mejora la fagocitosis y la producción de citoquinas pro-inflamatorias y microbicidas factores (por ejemplo, óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno), (4) la promoción de la diferenciación de células T CD4 + vírgenes en células efectoras Th1, (5) la promoción de cambio de clase de anticuerpo a la inmunoglobulina ( Ig) 2a y IgG3 (en el ratón), (6) la inducción de la producción de quimiocinas para reclutar células inmunes a sitios de iNFECCIÓN, y (7) el aumento de células NK y las respuestas de CTL 5,19. Dada la importancia crucial de IFN-γ en la respuesta del huésped a patógenos y tumores, IFN-γ recombinante ha sido probado como tratamiento para diversas infecciones y neoplasias (revisado en 19). Sin embargo, ya que la administración sistémica de IFN-γ o la citoquina Th1 promoción de la interleucina-12 (IL-12) está asociada con efectos secundarios y la toxicidad relacionada con la dosis 19,21, existe un interés en el desarrollo de estrategias alternativas para aumentar la producción de IFN-γ por células inmunes. El desarrollo de nuevos productos biológicos y moléculas pequeñas requiere herramientas de cribado in vivo para probar si tales agentes aumentan la producción de IFN-γ durante una respuesta inmune y si esto se traduce en efectos biológicos significativos tales como el aumento en la supervivencia animal.

La infección experimental de ratones con la bacteria L. monocytogenes gram positivas ha sido un modelo Instrumental paradescifrar el papel del IFN-γ en el huésped-inmunidad contra patógenos intracelulares 1,22. La infección de ratones con el patógeno por vía intravenosa o por vía intraperitoneal (ip) conduce a la rápida difusión de las bacterias en el bazo y el hígado, donde quedan internalizadas por los macrófagos residentes y los hepatocitos con cargas bacterianas pico en el bazo se producen entre 3 y 4 días post 1,3,22 infección. La producción de IFN-γ por las células NK es importante para la activación de macrófagos y la resistencia temprana contra el patógeno 3; Sin embargo, a dosis altas infecciosas, producción de IFN-γ también puede ser perjudicial para aclaramiento patógeno 23. Células NKT son también una fuente de IFN-γ en el bazo y el hígado durante el control temprano de patógenos 2,24 y esta producción se ha demostrado para amplificar la producción de IFN-γ por otros tipos de células incluyendo las células NK 2. Por otra parte, después de acción linfocitos T de adaptación, las células T CD8 + en particular, son importantes para mediar en la eliminación del patógeno y proporcionando protección contra 1,4,22 reinfección.

Este modelo de infección ha sido atractivo para los investigadores para una serie de razones (revisado en 1). En primer lugar, la infección con el patógeno es altamente reproducible e induce una fuerte respuesta inmune Th1 y celular. En segundo lugar, durante la infección subletal, la carga bacteriana se concentra en el hígado y el bazo en los que se puede medir fácilmente. En tercer lugar, el patógeno puede ser manejado con seguridad bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) condiciones. En cuarto lugar, el organismo y la respuesta inmune que genera se han caracterizado ampliamente. Por último, una variedad de cepas mutantes y genéticamente modificados han sido desarrollados que están disponibles para su uso.

Aquí se describe un protocolo básico para la inoculación de los ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y 25 para la medición de IFN - γ rerespuestas por NK, NKT, y los linfocitos de adaptación después de la infección. También se describe cómo medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado después de la infección subletal y para llevar a cabo estudios de supervivencia después de la infección con un LD 50 dosis modificada del patógeno. Finalmente, los datos representativos se muestran de cómo este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de los nuevos tratamientos en las respuestas de IFN-gamma y la supervivencia del ratón de L. monocytogenes infección.

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Protocol

Notificación de seguridad

Este protocolo describe la infección de ratones con L. monocytogenes en vivo. El patógeno se maneja con seguridad bajo condiciones BSL2 por personal capacitado que no están inmunocomprometidos. Las personas inmunocomprometidas son las mujeres embarazadas, los ancianos y las personas que están infectadas con el VIH o que tienen enfermedades crónicas que requieren tratamiento con la terapia inmunosupresora. El personal debe ponerse una capa protectora de laboratorio o una bata, guantes, máscara y protección para los ojos durante la manipulación de las muestras infectadas. El trabajo descrito en este documento se realizó en condiciones BSL2 con un certificado (# 32876) que fue emitido por la Red de Salud de la Universidad (UHN) Bioseguridad oficina. Los cadáveres de los ratones infectados o cualquier tejidos utilizados fueron doble bolsa y desecharse de residuos biológicos peligrosos. Las jaulas de los ratones infectados también fueron descontaminados en autoclave.

Declaración de Ética

Los ratones fueron mantenidos y se infectaron en un quarasala de ntine dentro de las instalaciones de animales UHN y fueron atendidos de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo Canadiense de Protección de los Animales. Todos los procedimientos realizados en ratones se llevaron a cabo en virtud de la utilización de animales protocolo # 3214, que fue aprobado por el comité de cuidado de los animales UHN. Debido a consideraciones éticas, la muerte no se utilizó como un punto final para estudios de supervivencia. La DL 50 dosis modificada presentada aquí por L. monocytogenes se determinó que la dosis a la cual el 50% de los ratones alcanzó criterios de valoración específicos, que consistía en una pérdida del 20% en el peso corporal o que presenten al menos dos de los siguientes signos clínicos: letargo, pelo erizado, postura encorvada, dificultad para respirar, los ojos apagados o hundidos. Los ratones fueron sacrificados cuando alcanzaron los puntos finales a través de la exposición al dióxido de carbono (CO 2) de acuerdo con normas de su institución UHN.

1. Preparación de reservas de glicerina para el almacenamiento a largo plazo

NOTA: Este procedimiento describe cómo las existencias de glicerol de laEGD cepa de L. monocytogenes se preparan a partir de un stock de glicerol originales. Pasos que tienen el potencial de generar aerosoles deben llevarse a cabo dentro de una cabina de bioseguridad certificada (BSC).

  1. Preparar placas de agar de infusión de cerebro y corazón (BHI) para el crecimiento bacteriano. Para ello coloca el 3,8% (w / v) de caldo BHI y el 1,5% (w / v) de agar a doblemente destilada H2O (ddH2O). líquido autoclave. Una vez que el agar se enfría a 50 ° C, dispensar líquido en placas de petri bacterianas (25 ml / placa) y dejar que las placas secas (no cubierto) en el BSC para 1 hr.
    NOTA: BHI agar de transferencia en un 50 ° C baño de agua después de la esterilización en autoclave para evitar la solidificación antes de verter las placas. Almacene las planchas BHI a 4 ° C al revés (con la cara de impresión hacia arriba) hasta que esté listo para su uso.
  2. Preparar medios BHI líquido. Para esto, la mezcla 3,8% (w / v) de caldo de BHI en ddH 2 O. Autoclave.
  3. Retire el glicerol congelada balance de la cepa de L. monocytogenes EGD de la congelación de -80 ° Cr y descongelación a temperatura ambiente.
  4. Sumergir la punta de pipeta estéril en el stock de glicerol descongelados e inmediatamente consecutivas la punta hacia atrás y adelante a través de una sección de una placa BHI. Esta es la racha primaria.
  5. Gire la placa a 90 ° C y con una punta de pipeta nueva, arrastre a través de la primera racha y se extendió a la siguiente cuarta parte de la placa (esto es la racha secundaria). Repetir una vez más para hacer que la racha terciaria.
  6. Invertir la placa y se incuba a 37 ° C durante la noche. Las colonias individuales uniformes deben ser obtenidos en la última serie de rayas y visible entre 16 y 24 horas.
  7. Dispensar 10 ml de caldo de BHI estéril en un tubo de ml estéril con ventilación 50. Elige una colonia de L. monocytogenes de la placa usando una punta de pipeta estéril e inocular el caldo. Incubar el cultivo en un incubador con agitación orbital 37 ° C durante la noche o hasta DO600 = 1,0 con ajustes a 225 revoluciones por minuto (rpm).
    NOTA: El vidrio desechable o plamatraces Erlenmeyer STIC también se pueden utilizar para cultivar bacterias. Independientemente del tipo de recipiente utilizado, asegurarse de que es estéril, ventilación y que el volumen de cultivo no exceda del 20% del volumen total del recipiente para asegurar la aireación adecuada de la bacteria.
  8. Preparar las existencias de glicerol mezclando glicerol estéril 100% con cultivo líquido bacteriano durante la noche a una proporción de 1: 1. Distribuir la mezcla de bacterias / glicerol en viales de 2 ml criogénicos (500 l / vial) y viales de transferencia a -80 ° C congelador para su almacenamiento.
    NOTA: métodos de valores del grano también se pueden utilizar en lugar de las existencias de glicerol para almacenar las bacterias. Mediante este método, microperlas porosas se inoculan con un cultivo puro de L. monocytogenes y se almacenan a -80 ° C. Cada cuenta puede ser utilizado para inocular un cultivo fresco como sea necesario. Ver la lista de materiales para obtener más información.

2. Determinación de la curva de crecimiento de L. monocytogenes en el Día de la Cultura NOTA: Este procedimiento describe cómo generar la curva de crecimiento de L. monocytogenes que se utiliza para estimar las unidades formadoras de colonias (UFC) para estudios de infección. Todos los pasos que tienen el potencial de generar aerosoles deben realizarse dentro de un BSC certificada.

  1. Tomar 100 l de cultivo de una noche generada en la etapa 1.7 a los medios BHI 10 ml en un tubo de ventilación 50 ml y crecer a 37 ° C en una incubadora con agitación (225 rpm, inclinado en 45 ° de ángulo). Use un tubo no inoculado como control.
  2. Tomar muestras de 0,5 ml del cultivo a intervalos de una hora (1, 2, 3, 4, 5, 6 hr, etc.). Diluir cada alícuota 1: (v / v) 1 con los medios BHI en una cubeta de plástico. Pipetear arriba y abajo para mezclar. Medir la densidad óptica (DO) a 600 nm (OD 600) usando un espectrómetro. Continuar el cultivo de bacterias hasta que OD 600 = 1.
  3. Al mismo tiempo, tomar una muestra de 100 l de la cultura y se diluye con 900 l de medios BHI en una estéril 1,5 ml micrtubo ocentrifuge (esta es la dilución 10 -1). Centrifugar las bacterias a 6000 xg durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
  4. Lavar dos veces las bacterias resuspendiendo el sedimento en 1 ml de medio BHI, centrifugación durante 5 min a 6.000 xg, a continuación, aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio BHI. Preparar una serie de diluciones de 10 veces de esta muestra en medios BHI (10 -2-10 -9). Spread 100 l de cada diluyente en placas de agar BHI separadas. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C en una incubadora.
  5. Al día siguiente, recoger placas que tienen encuentre entre 30 - 300 colonias. Desechar el resto. Contar las colonias de estas placas. Tabla 1 muestra un ejemplo de los recuentos obtenidos en una parte alícuota que se tomó cuando OD 600 = 0,84. En este ejemplo, una de las placas (es decir, 10 -6 dilución) tenían recuentos de colonias entre 30 a 300 y se utilizó para el cálculo CFU / ml.
    NOTA: Las placas con mayorde 300 colonias no se utilizan, ya que el hacinamiento puede obstaculizar el crecimiento bacteriano y también hace que sea difícil de discernir y enumerar las colonias individuales. Las placas con recuentos de <30 también no se utilizan debido a pequeños errores en la técnica de dilución o la presencia de contaminantes pueden tener un gran impacto en la precisión de los recuentos en el extremo inferior de la gama.
  6. Se divide el número de colonias por el volumen plateado y luego se multiplica por el factor de dilución para obtener el valor de ufc / ml para una dilución particular. En el ejemplo de la Tabla 1, el recuento a la dilución 10 -6 era 70. Dividir este valor en 0,1 ml para obtener el valor ufc / ml para el cultivo diluido. Entonces multiplicar este valor por el factor de dilución (10 6) para obtener el valor de ufc / ml del cultivo no diluido (7,0 x 10 8).
  7. Trazar la OD 600 (eje y) frente al tiempo en h (eje x) para identificar la fase logarítmica de crecimiento 26.
    NOTA: Este curv crecimientoE proporciona una estimación de la UFC / ml del cultivo de día cuando se cultiva a una cierta lectura de la DO. Elija una lectura de DO 600 que está en la fase logarítmica de crecimiento que puede ser utilizado como un OD de destino 600 para el cultivo de cultivos de día. Estos datos ahora pueden ser utilizados para estimar el UFC en una cultura para la preparación del inóculo (Procedimiento 3).

3. Preparación del inóculo para la infección experimental con L. monocytogenes

NOTA: Este procedimiento describe la preparación del inóculo infeccioso de una cultura día en que se inició a partir de un cultivo de una noche (preparado en el Procedimiento 2). Todos estos pasos se realizan en el BSC a menos que se indique lo contrario.

  1. Calcular el número de CFU necesaria para la infección sobre la base del número de ratones y el diseño experimental del estudio. Añadir un volumen apropiado de medios BHI a un matraz o tubo de cultivo Erlenmeyer de ventilación estéril.
    NOTA: La UFC de bacterias preparados será dependiente del tipo de experimento realizado. Para el estudio de NK y respuestas de las células NKT durante la infección, cada ratón se inocula con 10 5 UFC de bacterias (Procedimiento 6). Si el estudio de respuestas de células T de adaptación a la infección o la medición de la carga bacteriana, cada ratón se inoculó con 2 x 10 4 UFC de bacterias (Procedimiento 8). Si el estudio de la supervivencia a los puntos finales, cada ratón se inocula con la dosis LD 50 del patógeno (que es de 10 5 UFC para los hombres y 1,5 x 10 5 UFC para las mujeres, véase el Procedimiento 9).
  2. Inocular el tubo que contiene el medio BHI con 100 l de cultivo durante la noche. Incubar el cultivo en una incubadora a 37 ° C agitación orbital (225 rpm) hasta OD diana 600 se alcanza. Transferir el contenido de cultivo en un tubo de centrífuga estéril.
  3. bacterias de centrífuga en un gránulo durante 5 min a 6000 xg utilizando una centrífuga. Aspirar el sobrenadante utilizando un vacío unido a un matraz trampa que contiene cloro.
  4. Lavado de pellets dos veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS), centrifugación (5 min a 6.000 xg) en el medio.
  5. Aspirar el segundo lavado y diluir las bacterias a la concentración apropiada en PBS 1x para entregar la CFU de interés para cada ratón en un volumen de 200 l.
    NOTA: Lo mejor es utilizar una fuente comercial de PBS estéril 1x para el lavado de las bacterias y para la preparación del inóculo, ya que la cristalería de laboratorio puede introducir contaminantes inmunológicas tales como lipopolisacárido.

4. La infección experimental de ratones con L. monocytogenes

NOTA: Este procedimiento describe cómo infectan los ratones con el inóculo preparado en el paso 3 y cómo comprobar el UFC entregado en el inóculo. Manipulación de los ratones y las inyecciones se realizan en un BSC.

  1. Pedir un número suficiente de ratones C57BL macho o hembra / 6J para su experimento. También ordenan los ratones que sirven como controles no infectados.
  2. Permitir a los ratonesaclimatar durante 1 semana antes de la inoculación bacteriana.
    NOTA: Este es debido a que el estrés asociado con el transporte de los animales puede desencadenar un aumento transitorio en la producción de la hormona del estrés y linfopenia 27,28.
  3. En el día de la inoculación, obtener un peso corporal inicial para cada ratón y la inscribirá en el cuaderno de laboratorio.
  4. En el BSC, mezclar la suspensión bacteriana arriba y hacia abajo utilizando una pipeta estéril para asegurar que las bacterias se distribuyen uniformemente y luego tomar hasta 200 l de inóculo en una jeringa de 1 ml de ingeniería de seguridad provista de una aguja 25 G.
  5. Inyectar una ip ratón con 200 l de inóculo preparado (por ejemplo, 10 5 UFC por la infección de las células NK, Procedimiento 6). Para este procedimiento, pescuezo ratones con la mano menos dominante por el acaparamiento de la piel suelta alrededor de los hombros del ratón. Después de asegurarse de que el ratón está bien contenida, inyectar el ratón en el cuadrante inferior del abdomen, justo lateral a la midline para evitar la vejiga.
  6. Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente previsto.
  7. Repetir los pasos 4.3 a 4.6 hasta que se inyectan todos los ratones. Llevar a cabo medidas similares con 1x PBS inyectaron a los ratones (controles no infectados).
    NOTA: Dado que el UFC es una estimación basada en la curva de crecimiento, sino que también es una buena práctica para comprobar el UFC real en el inóculo. Para ello, se prepara 3 - 4 diluciones diferentes del inóculo preparado (utilizando series de dilución de 10 veces) que haya indicado dará lugar a colonias contables. Spread 100 l de cada diluyente sobre una placa de agar BHI y se incuba durante la noche a 37 ° C. Contar las colonias y calcular los reales UFC / ml como se describe en el Procedimiento 2.

5. Preparación de L. monocytogenes muertas por calor para Estudios inmune

NOTA: Todos los pasos que tienen el potencial de generar aerosoles se llevan a cabo dentro del BSC.

  1. Cultive hasta el día hasta 600 OD valores de unare alcanzado que están dentro de la fase logarítmica. Prescindir de la cultura en 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
  2. Incubar los tubos en un 70 ° C en un baño de agua durante 1 hora para matar las bacterias.
  3. Lavar las bacterias dos veces con 1x PBS que en los pasos 3.3 y 3.4. Resuspender en medios RPMI completo estériles que contienen suero de ternera fetal (FCS) (véase el archivo de consulta 1 para la receta) a una concentración de 4 x 10 6 / ml. Alícuota mató bacterias en viales de 2 ml criogénicos estériles y se almacena a -80 ° C.
  4. Confirmar la muerte de las bacterias mediante la difusión de 100 l de la preparación de bacterias muertas por calor en placas de agar BHI y se incubó durante la noche a 37 ° C.
    NOTA: Estas bacterias muertas por calor deben estar preparados para estimular los linfocitos en cultivo in Procedimiento 8. Si hay colonias que crecen en la placa de agar BHI, repita el procedimiento para matar el calor.

6. Medición de las respuestas de IFN-gamma por células NK y NKT durante la infección

NOTA: Este procedimiento describe cómo medir las respuestas de IFN-gamma por las células NK y NKT en los ratones a las 24 horas después de la infección con 10 5 UFC de L. monocytogenes. Esta dosis se utiliza debido a que induce respuestas robustas IFN-gamma por las células NK y NKT en el bazo 24. Llevar a cabo todos los pasos en el BSC. Para ayudar a mantener la viabilidad celular, a mantener las células en hielo siempre que sea posible y utilizar tampones fríos como el hielo.

  1. Inocular a los ratones como se describe en el Procedimiento 4 con 10 5 UFC de L. monocytogenes. Al mismo tiempo, se inyectan ratones de control no infectados IP con un volumen igual de PBS 1x.
  2. La eutanasia a los ratones a las 24 horas después de la inoculación mediante inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales.
  3. Mentir cada ratón sobre su lado derecho y humedecer la piel con etanol al 70% usando un frasco lavador.
  4. El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras-difíciles de cortar, una incisión en la piel justo por debajo de la parte inferior de la caja torácica.
  5. rocíela capa muscular expuesta con 70% de etanol. El bazo debe ser visible debajo de la capa muscular (cabeza de flecha abierta en la figura 1).
  6. El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras finas, una incisión en la capa muscular para revelar el bazo. agarrar suavemente el bazo con las pinzas y el uso de tijeras finas para cortar el bazo lejos del tejido conectivo circundante.
  7. Coloque el bazo en un tubo cónico de 15 ml que contenía 1x estéril PBS.
  8. La mitad de llenado en placas de Petri estériles con estéril 1x PBS. Disociar el bazo a través de un filtro de células de nylon 70 micras en la placa de Petri con el extremo plano de una jeringa estéril de 3 ml.
  9. Transferir la suspensión de esplenocitos en un tubo cónico de 15 ml estéril limpia utilizando una pipeta serológica de 10 ml estéril.
  10. Centrifugar las muestras a 335 xg durante 10 min a 4 ° C.
  11. Aspirar el sobrenadante en un matraz trampa que contiene cloro. Aflojar el sedimento celular colocando el tubo con un dedo o arrastrando el tubo inferiorde ida y vuelta a lo largo de una superficie corrugada (por ejemplo, el flujo de salida de aire en el BSC).
  12. Lisar las células rojas de la sangre mediante la adición de 1,5 ml de amonio-cloruro y potasio (ACK) de tampón de lisis (ver Archivo Suplementario para la receta 1) a cada bazo. Después de exactamente 1 min y 15 segundos, llenar el tubo con 1x PBS para detener la lisis celular.
  13. centrifugar las células como se describe en el paso 6.10. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de células activadas por fluorescencia (FACS) Buffer (estéril 1x PBS que contenía 2% FCS).
  14. Contar las células utilizando un hemocitómetro. Para ello, tomar dos alícuotas de la suspensión celular para contar. Añadir 15 l de cada suspensión celular a un volumen igual de Trypan azul (0,04%, preparada diluyendo una solución de azul de tripano al 0,4% en ddH 2 O). Carga de 15 l de cada suspensión celular azul / tripán en la cámara del hemocitómetro (es decir, uno en la cámara superior, una en la cámara inferior).
  15. Usando un microscopio, contar todas las células no azules encinco grandes plazas de la red central en cada cámara (Figura 2). Tome este recuento y se divide por 10 para obtener el número de células en 10 6 / ml. En el ejemplo de la Figura 2, el recuento es de 215 células en los 5 cuadrados; Por lo tanto, la concentración de células es de 21.5 x 10 6 / ml. La media de los concentraciones de células obtenidas a partir de las dos muestras.
  16. Semillas 1 x 10 6 células por pocillo / mancha en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para la tinción de citometría de flujo. Asegúrese también de sembrar las células sin teñir y menos de uno de fluorescencia controles (FMO). Ver citometría de flujo recomendada panel de tinción en la Tabla 2.
    NOTA: Para los siguientes pasos, se recomienda mantener las células en hielo oa 4 ° C y para proteger las células de la luz con papel de aluminio cuando fluorocromos están presentes. Una pipeta multicanal puede ser utilizado para dispensar líquidos en placas de 96 pocillos de tinción para acelerar el procesamiento. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento celular cuandoaspirar el sobrenadante de la placa de centrifugado. La tinción también se puede hacer en los tubos de FACS si la centrífuga no está equipado con adaptadores de placas. Todas las etapas de centrifugación partir de este momento se llevan a cabo en 456 g durante 5 min a 4 ° C.
  17. Se centrifuga la placa y lavar las células dos veces con tampón FACS. Uno de lavado se realiza mediante la adición de 200 l de tampón de FACS a cada pocillo, centrifugación de la placa, y luego aspirar el sobrenadante.
  18. Realizar etapa de bloqueo mediante la adición de 50 l / pocillo de tampón FACS que contiene anti-ratón CD16 / CD32 (bloque Fc purificada) (0,5 g). Se incuban las células a 4 ° C durante 15 min. Lavar las células una vez en 1 x PBS como se describe anteriormente.
  19. Añadir 100 ml de colorante de viabilidad (tinte viabilidad fixable diluyó 1: 1000 en 1 x PBS) a las células. células de la mancha a 4 ° C en la oscuridad (en el refrigerador) durante 30 min. Lavar las células dos veces en tampón FACS como se describe anteriormente.
  20. Después de un segundo lavado, añadir 100 l de anticuerpos de la superficie celular o tetrámeros a respectivos pozos de acuerdo to El panel de tinción se describe en la Tabla 2. células de la mancha a 4 ° C en la oscuridad (en el refrigerador) durante 30 min. En este momento, también añadir anticuerpos para la tinción de controles positivos y FMO individuales.
    NOTA: En cuanto a los controles positivos individuales, se recomienda a cualquiera de los esplenocitos de uso que se tiñen con diferentes versiones fluorocromo del anticuerpo CD4 o bolas de compensación comerciales que se tiñen con los anticuerpos utilizados en el panel. Antes de la realización de este procedimiento de tinción, todos los anticuerpos FACS se deben titular en los estudios de prueba para determinar las concentraciones óptimas para la tinción.
  21. Lavar las células dos veces en tampón FACS como se describe anteriormente y a continuación, fijar las células mediante resuspensión en 50 l de 4% de paraformaldehído (16% de paraformaldehído Stock diluido en ddH 2 O) e incubando durante 10 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El paraformaldehido es tóxico y sólo debe ser utilizado de la campana de humos.
  22. Lavar las células dos veces in tampón FACS, centrifugación en el medio. Resuspender las células en tampón de FACS. Continuar con las células del paso o almacenar en el refrigerador próximos protegida de la luz durante un máximo de tres días.
  23. centrifugar las células, eliminar el sobrenadante, y se lavan las células dos veces con 150 ml de 1x permeabilización / tampón de lavado (tampón / lavado Perm), centrifugando en el medio. El / tampón de lavado Perm se prepara de una reserva de 10 veces mediante la dilución de 1: 9 (v / v) en ddH 2 O.
  24. Después del segundo lavado, resuspender las células en 150 l de Perm / Wash Buffer y se incuba durante 15 min a 4 ° C en la oscuridad.
  25. Centrifugar las células de nuevo y luego aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 50 l de 1 x tampón Perm / Wash que contienen anti-IFN-γ e incubar durante 1 hora a 4 ° C en la oscuridad.
  26. Lavar las células dos veces con 1 x tampón Perm / Wash, centrifugación en el medio. Resuspender las células en 250 l de tampón de FACS y luego transferir las células a tubos de FACS.
  27. Proceder a la adquisición de la citometría de flujo utilizando un flujo cytometer que tiene un conjunto de configuración láser y filtro adecuado para discriminar fluorocromos utilizados en el panel de tinción se describe en la Tabla 2 29. Recoge al menos 200.000 eventos por muestra y 10.000 eventos para los controles de compensación.
  28. Aplicar matriz de compensación y analizar datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo 30.

7. Medición de la carga bacteriana en el bazo y el hígado en el momento de la infección máxima

NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo dentro de un BSC a menos que se indique lo contrario.

  1. Inoculan los ratones ip con 2 x 10 4 UFC del patógeno utilizando los procedimientos descritos en el Procedimiento 4.
  2. En días después de la infección 3, la obtención de 1.5 ml tubos de microcentrífuga estériles, que contienen cada uno 500 l de helado estéril 0,1% de Triton X-100 en PBS 1x y 0,2 - 0,3 g de 1,5 - perlas de vidrio estéril lavado con ácido 2 mm. Pesar cada tubo.
    NOTA: Las cuentas de vidrio son lavadas con ácido por incurendido en ácido acético al 10% en un vaso de precipitados sobre un agitador magnético durante 1 hr. Estas perlas se lavaron exhaustivamente con ddH 2 O para eliminar el ácido, se secan al aire, y luego en autoclave antes de su uso.
  3. La eutanasia a los ratones por exposición al CO 2.
  4. Para la disección de los órganos, poner el animal en su parte posterior en una tabla de disección y el pin de las extremidades del ratón a la placa utilizando 25 g de agujas. Desinfectar la piel humedeciendo con un 70% de etanol.
  5. Con unas tijeras de corte difíciles estéril practicar una incisión en la línea media en la piel desde la ingle hasta la mitad del pecho y luego a partir de mediados de la ingle hacia cada rodilla y desde el pecho hacia mediados de cada codo. disección roma y refleja de nuevo la piel, clavándolo abrirá mediante 25 g de agujas.
  6. Desinfectar capa muscular mojándolo con un 70% de etanol y luego con unas tijeras finas estériles hacen una incisión en la línea media en la pared peritoneal. Coge el proceso xifoides con unas pinzas. Luego, usando las mismas tijeras finas, hacer recortes en la pared peritoneal del proce xifoidesss lateralmente en cada lado, a raíz de la caja torácica, justo por debajo del diafragma para revelar el hígado.
  7. Cortar un trozo mg ~ 100 del hígado (utilizar el mismo lóbulo para todos los ratones) con unas tijeras estériles y colocarlo en un tubo de microcentrífuga previamente pesado de 1,5 ml.
  8. El uso de fórceps para empujar suavemente a un lado los órganos en el lado izquierdo de la cavidad peritoneal para visualizar el bazo. agarrar suavemente el bazo con un par de pinzas y liberarlo de la cavidad peritoneal cortando el tejido conectivo circundante.
  9. Coloque el bazo en el tubo previamente pesados ​​de 1.5 ml contiene perlas. Transporte tejidos al laboratorio en un recipiente que contenga hielo a prueba de fugas. Volver a pesar de los tubos que contienen los órganos para determinar los pesos de los tejidos en mg.
  10. Homogeneizar los tejidos por agitación de los tubos usando un molino homogeneizador de microesferas durante 3 min a una frecuencia de 30 Hertz.
    NOTA: Se prefiere el método de molino de bolas para la homogeneización, ya que es susceptible de procescantar un gran número de muestras y crea menos lío y la posible exposición al patógeno. Sin embargo, homogeneizadores automáticos o en autoclave 2 ml homogeneizadores de tejidos de vidrio manual pueden ser utilizados como una alternativa.
  11. Preparar una serie de diluciones de 10 veces de los homogeneizados en 0,1% Triton-X-100 en PBS 1x, que van desde (que van desde sin diluir a 10 -7).
  12. Extender 100 l de cada homogeneizado diluido en una placa de agar BHI (por duplicado) utilizando un esparcidor estéril. placas de transferencia a una incubadora a 37 ° y se incuban durante la noche.
  13. Mantener las placas que contienen entre 30 y 300 colonias / placa, desechar el resto. Recuento de las colonias en cada placa y determinar el número medio de colonias para los diferenciales de duplicados.
  14. Calcular la CFU / mg según la siguiente ecuación:
    CFU / mg = CFU / ml en el homogenado, multiplicado por los ml de homogeneizado preparado, dividido por el peso mg del tejido homogeneizado.
    NOTA: Por ejemplo, si una media de 30 colOnies fueron contados después de la siembra de 100 l de 10 -2 homogeneizado diluido preparado a partir de una pieza de 120 mg de hígado que se homogeneizó en 0,5 ml, el cálculo sería el siguiente:
    CFU (factor de dilución) / ml = 30 colonias x 100 / 0,1 ml (volumen de cálculo) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30 000 CFU / ml x 0,5 ml de homogeneizado / 120 mg de tejido = 125 CFU / mg.

8. Efectos de L. monocytogenes sobre las respuestas de IFN-gamma por las células CD4 + y CD8 + células

NOTA: Este procedimiento describe cómo medir la producción de IFN-γ por esplénica CD4 + y células efectoras T CD8 + cosechada en el momento del pico de la respuesta adaptativa inmune (~ 7 días post-infección) mediante dos métodos: (1) el flujo de citometría para medir IFN gamma por CD4 + y CD8 + por tinción intracelular de citoquinas, y (2) ELISA para medir los niveles totales de IFN-γ producidos por los esplenocitos (incluye todas las células T). procedimientosse llevan a cabo dentro del BSC.

  1. Infectar los ratones mediante la inyección ip con 2 x 10 4 CFU del patógeno usando los procedimientos descritos en el Procedimiento 4.
  2. En el día 7 después de la infección, la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales.
  3. Diseccionar el bazo (como se describió anteriormente) y se coloca en un tubo cónico de 15 ml que contenía 1x estéril PBS. Transportar los tubos al laboratorio en un recipiente que contenga hielo a prueba de fugas.
  4. Procesar los bazos en una suspensión de células individuales, la lisis de las células rojas de la sangre tal como se describe en la sección 6, y luego volver a suspender las células en medio RPMI completo que contenía 10% de FCS. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
  5. Creados culturas para la medición de las respuestas de IFN-gamma. Por estas células de dispensación (4 x 10 6 en 1 ml / pocillo) en placas de 24 pocillos y junto con el mismo número (4 x 10 6 o 1 ml / pocillo) de L. monocytogenes descongelados muertas por calor (preparado en el Procedimiento 5) . La transferencia de células a un 37° C incubadora.
  6. Después de 20 horas de incubación, añadir 0,66 l / ml de inhibidor de la proteína de transporte de pozos y continuar incubaciones.
  7. Cuatro horas más tarde, la transferencia de placa a BSC y recoger 500 l de sobrenadante de cultivo y la congelación (a -80 ° C) para la medición posterior de los niveles de IFN-gamma utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima comercial (ELISA) 31. A continuación, recoger las células en un tubo estéril de 15 ml. Lavar los pocillos con PBS 1x y poner en común este lavado junto con las células recogidas.
  8. Llevar a cabo la tinción de la superficie celular y la tinción intracelular para IFN-γ en CD4 + y CD8 + como se describe en el Procedimiento 6, salvo el uso del panel de tinción descrito en la Tabla 3. Continúe con el citómetro de flujo adquisición (recogida de 200.000 eventos / muestra) y analizar los datos 29 utilizando citometría de flujo software de análisis 30.

9. Medición de ratón La supervivencia a los puntos finales después de L. monocytogenes Infección

NOTA: Este procedimiento describe el efecto de un agente de supervivencia de los ratones a los puntos finales después de la infección con la dosis DL50 modificada del patógeno. Todos estos procedimientos se llevan a cabo en el BSC en las instalaciones de animales.

  1. Inyectamos ratones IP con la dosis DL50 modificada de L. monocytogenes como se describe en el Procedimiento 4. Esto se determinó que era de 10 5 UFC (para hombres) o 1,5 x 10 5 UFC (para mujeres) 31.
  2. Siga los ratones dos veces al día en busca de signos clínicos y registrar estas señales y los pesos corporales de los animales en un cuaderno de laboratorio. La eutanasia a los ratones si muestran una pérdida del 20% en el peso corporal o dos signos clínicos de listeriosis (letargo, pelo erizado, postura encorvada, dificultad para respirar, los ojos apagados o hundidos).
  3. Después de 14 días, la eutanasia a los ratones supervivientes a través de inhalación de CO2.
  4. Preparar gráficos de Kaplan-Meier de los datos representando el porcentaje de supervivencia de cada grupo contra el tiempo 32.
    (Figura 7).

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Representative Results

La Figura 3 presenta un poco de flujo típico de citometría de tinción de IFN-γ en las células NK y NKT esplénicas a las 24 horas después de la infección con 10 5 CFU del patógeno. Esta figura también ilustra la estrategia de gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 2. La Figura 4 muestra algunos datos representativos que se obtuvieron en un experimento donde los ratones macho se trataron con el antagonista de PPAR IS001 o vehículo de control, infectados con 10 5 CFU L. monocytogenes, y después se analizó para IFN-γ en las células NK y NKT después de 24 hr . Esta figura muestra que el tratamiento con IS001 impulsó respuestas IFN-gamma por las células NKT, pero las células no NK después de la infección con el patógeno. La Figura 5 muestra la tinción representativa de IFN-γ en esplénica CD4 + y células T CD8 + a los 7 días después de la infección después de la re-estimulación ex vivo con pa muertos por calorthogen. Esta figura también muestra la estrategia gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 3. La figura 6 muestra datos representativos que se obtuvieron en un experimento en ratones machos fueron tratados diariamente con el antagonista IS001 o un vehículo de control de PPAR, infectados con una dosis subletal de L. monocytogenes, y analizados a los 7 días después de la infección. Este experimento muestra que el tratamiento con IS001 mejorada respuestas IFN-gamma por tanto CD4 + y linfocitos CD8 +. La Figura 7 muestra los datos representativos de un estudio que investigó el efecto de la IS001 antagonista de PPAR en la supervivencia del ratón para puntos finales después de la infección con el LD 50 dosis modificada del patógeno. Plotted es el porcentaje de supervivencia de los ratones contra el tiempo después de la infección. Esta figura muestra que el tratamiento con IS001 aumentó la supervivencia de ratones macho a los puntos finales. En conjunto, estos datos ilustran cómo este modelo se puede aplicar a investigarlos efectos de nuevos medicamentos o tratamientos sobre las respuestas de IFN-γ en vivo y para explorar cómo estos cambios afectan a la supervivencia del animal inmune contra la infección.

Figura 1
Figura 1. La disección de los bazos de ratones infectados. Esta serie de fotos muestra cómo diseccionar el bazo de un ratón muerto. (a) Se encuentran el ratón sobre su lado derecho y rocíe la piel con etanol al 70%. (b) El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras-difíciles de cortar, una incisión en la piel justo por debajo de la parte inferior de la caja torácica. (c) de pulverización hacia abajo la capa muscular expuesta con 70% de etanol. El bazo debe ser visible debajo de la capa muscular (cabeza de flecha abierta). (d) El uso de pinzas asépticas o estériles y tijeras finas, haga una incisión de la capa muscular para revelar el bazo. (e) agarrar suavemente el bazo con las pinzas y USE finas tijeras para cortar el bazo de distancia de alrededor del tejido conectivo. (f) Colocar el bazo en un tubo cónico de 15 ml que contenía 1x estéril PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Los esplenocitos recuento usando un hemocitómetro. (a) muestra la red central del hemocitómetro. (b) muestra una vista ampliada de la red central que contiene 25 cuadrados grandes (que contienen cada uno 16 cuadrados más pequeños). Los cinco grandes plazas utilizados para el recuento se resaltan en (4 cuadrados de las esquinas más el cuadrado central de la cuadrícula central) grises. (c) muestra una vista ampliada de uno de los grandes cuadrados grises. Para determinar el volumen de las células en 10 6 / ml, primero recuentotodas las células viables dentro de los cinco grandes cuadrados grises. En el ejemplo mostrado, este recuento es 215. Al contar, sólo para asegurarse de contar con todas las células claras (no-azul), incluidos los que estén en contacto con las líneas dobles en la derecha y abajo de la parrilla. No contar las células que tocan las líneas dobles en la izquierda y la parte superior de la rejilla. Tome el recuento de cinco cuadrados totales y se divide por 10 para obtener el número de células en 10 6 / ml. En el ejemplo, 215 dividido por 10 es de 21,5 x 10 6 células / ml. Tenga en cuenta que estos cálculos sólo funcionan si usted está contando 5 de las grandes plazas como se destaca y diluyen las células de 1: 1 en azul tripán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Estrategia de apertura de puerta para la detección de IFNγ producción en las células NK y NKT. Primera puerta a los linfocitos en FSC-A por SSC-Una trama. Luego de compuerta en aquellos eventos que están en la diagonal en el FSC-H / FSC-Una parcela. Estos son los singletes. Luego de compuerta en vivo (AmCyan -) y CD8 - células. Se representa la tinción de tetrámero contra el TCR. Las células NKT se encuentran dentro de la población doble positivo y las células NK son dentro de la población doble negación. Puerta de las células dobles positivas, y la trama NKp46 frente a FSC. Puerta de la población negativa NKp46, que son las células NKT (esta puerta se puede ajustar mediante la búsqueda del punto de división en las dos poblaciones de la trama de las células NK). Las células NK son el tetrámero - TCR - NKp46 + población. Dentro de NK y NKT puertas de células, las células + IFN-gamma en el canal de PE se identifican después de configurar una puerta basado en el control FMO. Por favor haz clickaquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Los datos representativos obtenidos para las frecuencias de las células NK y NKT IFN-γ + a las 24 horas post-infección. En este experimento, machos C57BL / 6J (N = 3 - 4 / grupo) fueron infectados ip con 10 5 UFC de L. monocytogenes o se dejaron un-infectados. Los ratones también se les administró el IS001 fármaco o vehículo (0,5% de carboximetilcelulosa) al mismo momento de la inoculación y 12 horas más tarde. Veinticuatro horas después de la inoculación, los ratones fueron sacrificados y los bazos se retiraron y se procesaron de forma individual y se tiñeron para citometría de flujo. Se muestra son la media ± SEM de frecuencia de células en el NK IFN-γ + (a) o puertas de células NKT (b) en los ratones no infectados o infectados después del tratamiento con un vehículo o el IS001 de drogas. *Indicarsa diferencia (P <0,05) de control del vehículo mediante la prueba t de dos colas. Los datos se vuelven a imprimir desde el 31 con el permiso del Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5.189-5202, 2015). Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Estrategia de apertura de puerta para la detección de la producción de IFN-γ en las células CD4 y CD8. Primera puerta a los linfocitos en FSC-A por parcelas SSC-A. Luego de compuerta en aquellos eventos que están en la diagonal en el FSC-H / FSC-Una parcela. Estos son los singletes. Dentro de esta puerta, puerta de AmCyan (-) en vivo las células CD45 +. Entonces la puerta en las poblaciones ya sea CD8 + o CD4 +. Dentro de cada puerta, el IFN-γ +las células en el canal de PE se identifican mediante la comparación de la tinción con el control FMO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Los datos representativos obtenidos para las frecuencias de células CD4 + y CD8 + IFN-γ + a los 7 días después de la infección con L. monocytogenes (cepa EGD). En este experimento, ratones C57BL / 6J machos fueron infectadas ip con 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / grupo) o se dejaron sin infectar (N = 3 / grupo). Los ratones también se les administró el IS001 fármaco o vehículo (0,5% de carboximetil celulosa) de partida dos veces al día en el día de la inoculación. Siete días después, los ratones fueron sacrificados y los bazos se retiraron y se procesaron individualmente paracultivo de células. Las células mononucleares de esplenocitos fueron estimulados durante 24 horas con inhibidores añadidos para la final de 4 horas de cultivo destruidas por calor L. monocytogenes con el transporte de proteínas. Las células fueron teñidas para la citometría de flujo. Se muestra son la media ± SEM de frecuencia de IFN-γ + células en el CD4 + (A) o puertas de células CD8 + (B) en ratones no infectados o infectados después del tratamiento con un vehículo (carboximetilcelulosa 0,5%) o el IS001 de drogas. * Indica una diferencia (P <0,05) de la contraparte control del vehículo según se determina mediante la prueba t de dos colas. Los datos se vuelven a imprimir desde el 31 con el permiso del Journal of Immunology (volumen 195, pp. 5.189-5202, 2015) .Copyright 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 7. Los datos representativos obtenidos durante un experimento que comparó el efecto de un antagonista PPAR 1S001 de ratón La supervivencia a los puntos finales después de la infección de ratones macho C57BL / 6J ratones con L. monocytogenes (cepa EGD). En este experimento, machos C57BL / 6J (n = 10 ratones / grupo) fueron ip infectado con el LD 50 dosis modificada del patógeno (10 5 CFU) de L. monocytogenes. Los ratones también se les administró el IS001 fármaco o vehículo (0,5% de carboximetil celulosa) de partida dos veces al día en el día de la inoculación. Los ratones fueron observados diariamente para detectar signos clínicos y se sometieron a eutanasia si se cumplían puntos finales. Se muestra la supervivencia de ratones por ciento a lo largo del tiempo los puntos finales * indica una diferencia en la supervivencia entre los grupos según lo determinado por la prueba de log-rank (p <0,05). Los datos se vuelven a imprimir desde el 31 con el permiso del Diario Of Inmunología (volumen 195, pp. 5189 a 5.202, 2015). Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1: Muestra algunos cálculos representativo para determinar UFC en una alícuota del Día de la Cultura. En este ejemplo, una parte alícuota de la cultura días fue tomada y se diluyó 1: 1 con medio de BHI. La OD 600 de esta muestra diluida se determinó que era 0,84. Además, una parte alícuota de 100 l fue tomada para la determinación de CFU. Esta muestra se diluyó con 900 l de medios BHI (10 -1) y se lavó y se resuspendió en 1 ml BHI. Se preparó una serie de dilución de 10 veces de esta muestra (10 -2-10 -9) y muestras diluidas se depositaron sobre placas BHI aga(sólo se muestran los valores de 10 -4 10 -9) placas r. Se contaron las colonias día siguiente. Sólo aquellas placas que tenían los números de colonias entre 30-300 fueron considerados para el cálculo (es decir, 10 -6 placa, resaltado en amarillo). A continuación, el número de colonias en esta placa (70) se dividió por 0,1 (volumen en ml chapado) para obtener el UFC / ml de la muestra diluida. Este valor se multiplica por el factor de dilución (10 6) para obtener la lectura / ml CFU del cultivo sin diluir. TMTC = demasiados para contarlos.

Tabla 2
Tabla 2: Panel de tinción para la detección de IFN-γ en células NK y NKT. Tenga en cuenta que bolas de compensación teñidas con los anticuerpos de flujo utilizado en el panel o los esplenocitos se tiñeron con varias versiones fluorocromo de CD4 GK1.1 clon de anticuerpo pueden ser usados ​​como controles positivos individuales.

Tabla 3
Tabla 3: Panel de tinción para la detección de IFN-γ en CD4 + y CD8 +. Tenga en cuenta que bolas de compensación teñidas con los anticuerpos de flujo utilizado en el panel o los esplenocitos se tiñeron con varias versiones fluorocromo de CD4 GK1.1 clon de anticuerpo pueden ser usados ​​como controles positivos individuales.

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Discussion

Aquí se describe un protocolo sobre cómo llevar a cabo una infección experimental básico con la cepa EGD de L. monocytogenes en 25 ratones C57BL / 6J macho o hembra. Este protocolo se creó con el fin de estudiar el efecto de una novela pequeña molécula IS001 en la producción de IFN-γ por los linfocitos innata y adaptativa in vivo 31. Mediante el control de la eliminación bacteriana y la supervivencia después de la infección, se adquirieron conocimientos sobre cómo estos cambios en IFN-γ afectadas la capacidad del huésped para controlar la infección.

Consideraciones críticas en el Protocolo

Una consideración importante en el diseño de este tipo de estudio es que cada experimento sea adecuadamente alimentados y controlados de forma adecuada. Debido a la variación biológica en la respuesta inmune a la infección (ver las figuras 4 y 6), se recomienda que N = 4-5 ratones por grupo se debe utilizar para los estudios inmune inicial. Si unaespués de estos estudios existe una tendencia en los datos, pero no hubo diferencia significativa aparente entre los grupos, un cálculo de potencia se podría hacer para determinar el menor número de animales necesarios en estudios posteriores para lograr la significación estadística. En cuanto a los controles, es importante incluir controles no infectados para la determinación de las respuestas de IFN-gamma de línea de base para los estudios inmunológicos y vehículo controla para ayudar a distinguir el efecto del tratamiento del estrés asociado con la administración del tratamiento. Otra consideración importante es el momento del tratamiento. Puesto que la respuesta innata de L. monocytogenes es muy rápida, se recomienda que el primer tratamiento puede administrar en el día antes de, o al mismo tiempo que, la inoculación con el fin de asegurar que los niveles terapéuticos del reactivo lograrse antes de la la iniciación de la respuesta inmune innata.

Sin embargo, otra consideración importante es la dosis del agente patógeno que se utilizará para INFECTIOnorte. Una dosis subletal se recomienda para la medición de la carga bacteriana, ya que aumenta la posibilidad de que el patógeno se concentrará en el bazo y el hígado, lo que permite la enumeración más exacta de las bacterias. Una dosis subletal también se recomienda para la enumeración de las respuestas de IFN-gamma por los linfocitos de adaptación para asegurar que los animales no sucumben a la listeriosis antes del momento de la expansión de células T pico. Por el contrario, se recomienda que una dosis más alta infecciosa se utiliza para la medición de la respuesta temprana de células NK y NKT a las 24 horas con el fin de maximizar la producción de IFN-γ por estas células.

El LD clásica 50 es la dosis de agente patógeno que resulta en 50% de letalidad de ratones. Ya que la muerte no fue un criterio de valoración aceptable en nuestra institución y puesto que muchos de los síntomas de listeriosis pueden predecir si un animal es probable que sucumbir a una infección, se utilizó una lista definida de los signos clínicos en lugar de la muerte como un punto final en nuestros estudios. Using este método, se determinó que la LD modificado 50 era 10 5 CFU para 8 semanas de edad, macho y 1,5 x 10 5 CFU para 8 semanas de edad, hembra C57BL / 6J 31. Estos LD 50 dosis se determinaron midiendo el porcentaje de supervivencia de los ratones a los puntos finales en los estudios de escalada de dosis graduales (N = 5 estudios en total) que contenían cada uno N = 8 ratones por grupo (por ejemplo, los ratones se infectaron primero con 10.000 CFU , a continuación, un segundo lote con 20.000 CFU, etc.). El cálculo LD 50 se determina a partir de un gráfico de regresión del log (CFU) (eje x) frente a la probit de los valores de porcentaje de supervivencia (eje y) (página web: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).

Tenga en cuenta que la LD 50 dosis modificado determinado en nuestro laboratorio puede diferir de la de otro laboratorio, incluso cuando la infección de los ratones con la misma cepa de L. monocytogenes. Parte de esta variabilidad puede relacionarse con la naturaleza subjetiva of monitoreo de signos clínicos de listeriosis en comparación con el punto final más absoluto de muerte. variabilidad adicional puede ser resultado de diferencias en los factores ambientales tales como la dieta del ratón o la microbiota o las diferencias en la preparación de inóculo entre laboratorios. Por lo tanto, se recomienda que antes de embarcarse en cualquier estudio de supervivencia, se realizó un estudio piloto donde los ratones hembra (n = 8 ratones / grupo) están infectados con 1,5 x 10 5 UFC de la misma cepa de L. monocytogenes tal como se utiliza en este estudian y síntomas monitorizados para determinar si este hecho se traduce en dosis de supervivencia del 50% a los puntos finales. Si la supervivencia es inferior o superior a 50% en este UFC, la escalada de dosis paso a paso o de dosis estudios de apaciguamiento podrían llevar a cabo para una rápida optimización de la dosis LD 50.

Otra consideración importante es la cepa o subcepa de ratones utilizados para estudios de infección. Este protocolo describe la infección de la comúnmente utilizada endogámica cepa de ratón C57BL / 6J. Esta cepa es muy adecuado para la medición de las respuestas de IFN-gamma desde este ratón se considera que es un Th1 propensas cepa 33 y, como resultado, es relativamente resistente a L. monocytogenes infección (en comparación con las cepas de Th2-propensas ratón tales como BALB / c) 34,35. La adaptación de este protocolo para otras cepas de ratón requerirá el conocimiento de la dosis infecciosa del patógeno de la cepa en particular. También se recomienda el uso de ratones de la misma edad, el sexo y el proveedor como se describe en este protocolo con el fin de reducir la cantidad de solución de problemas que conlleva la creación del modelo. Por ejemplo, C57BL / 6 ratones ordenó de un proveedor (por ejemplo, C57BL / 6J) pueden exhibir diferencias genéticas que C67BL / 6 ratones ordenados de otro proveedor (por ejemplo, C57BL / 6NTac) 36. Además, la microbiota intestinal difiere entre C57BL / 6 subcepas obtenidos de diferentes proveedores, que pueden influir en el equilibrio de las respuestas Th1 y Th17 en el ratón 37.

ove_title "> Modificaciones potenciales a la Técnica

Los ratones se inoculan más comúnmente ip o por vía intravenosa en lugar de la ruta natural de la infección en los seres humanos, que es a través del tracto gastrointestinal. Las infecciones orales son menos comunes debido a cepas estándar de L. monocytogenes ineficiente infectan el epitelio intestinal de los ratones 38. Esto es porque hay un solo cambio de aminoácido en la secuencia de ratón E-cadherina de la cadherina E humana que resulta en la pérdida de reconocimiento de E-cadherina por la proteína invasión listerial, internalina A (INIA) 39. Para superar esta barrera, los investigadores utilizan ratones que son transgénicos para la proteína E-cadherina humana o utilizan listeria que se han diseñado para expresar una secuencia mutada del INIA (INIA mut) que se une al ratón E-cadherina con la misma afinidad que WT EGD para E-cadherina humana 40. Por lo tanto, una modificación potencial de esta técnica es infectar ratones por vía oral. Se remite al lector a otra publicación JoVe que describe métodos de inoculación por vía oral 38. Tenga en cuenta que la alteración de la modalidad de la infección afectará a la dosis infecciosa, así como la cinética de difusión del patógeno.

Este protocolo describe el uso de listeria muertas por calor para provocar la producción de IFN-γ por las células CD4 + y T CD8 +. Muertas por calor L. monocytogenes fue elegido como un estímulo en nuestros estudios, ya que este antígeno es barato y porque nuestro laboratorio estaba interesado principalmente en las respuestas de células T CD4 + al patógeno. Una limitación es que las bacterias muertas por calor no lo hacen de manera eficiente las respuestas principales CD8 + de células T ya sea in vitro o in vivo 41 42,43 infección en. Por lo tanto, la producción de células CD8 + T IFN-γ que observamos por esplenocitos cosechadas en el pico de la infección (es decir, la Figura 6) probablemente es en respuesta a la residualbacterias vivas presentes en los cultivos de esplenocitos o se obtuvo como resultado de citoquinas inducidas por citoquinas liberan 41. Como alternativa a la listeria muertos por calor, también se podría provocar respuestas IFN-gamma ex vivo mediante la exposición de las células T a los péptidos que codifican epítopos en proteínas listeria. De hecho, inmunodominante MHC Clase epítopos para listeriolisina O y la hidrolasa p60 II-restringido y se han descrito para los ratones C C57BL / 6 y BALB / y epítopos inmunodominantes MHC de clase I se han descrito para BALB / c 44. Sin embargo, otro enfoque es infectar ratones con cepas de L. monocytogenes que han sido diseñados para expresar antígenos modelo, tales como ovoalbúmina o antígenos virales con el fin de tomar ventaja de existente MHC de Clase I y Clase II reactivos MHC-tetrámero para enumerar específica de antígeno células T en ratones infectados 45,46.

Otras limitaciones del protocolo

Otra limitación de este modelo es que oproducción medidas ólo IFN-γ por las células inmunes en el bazo. Además de la utilización de tetrámeros para enumerar las células T específicas de antígeno (de ovoalbúmina que expresan variantes de L. monocytogenes), citometría de flujo paneles de tinción descritos aquí podría ser fácilmente modificado para medir la producción de otras citoquinas tales como TNF o IL-2 o moléculas efectoras que participan en CD8 de células T o la destrucción mediada por NK del patógeno tal como perforina o granzima B. Además, este protocolo también podrían adaptarse para examinar IFN-γ producido por las células inmunes en el hígado.

Las aplicaciones futuras

Una vez que se domina este protocolo, que puede servir como un simple modelo in vivo para examinar los efectos de varios agentes o genes en Th1 y la inmunidad celular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

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References

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La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma
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Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

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