Summary
우리는 쉬고 강글리오사이드 활성화 인간 나이브 CD4 + T 세포의 세포막 발현 및 위치 파악을 결정 현미경에 사용하기위한 표준 항체 염색 프로토콜을 설명한다. 또한 실시간 PCR 실험은 <추가 낮은 입력 RNA 키트를 필요로하지 않는 40,000 세포를 사용하는 기술.
Abstract
서스펜션의 순진한 CD4 + T 세포의 활성화를 위해 본원에 기술 된 방법 및 공 초점 현미경 분석 된 커버에서의 준수는 실험을 프로파일 링하는 보수 표현 유동 세포 계측법 등의 CD4 + T 세포 활성화에 관여하는 강글리오사이드의 공간 현지화 및 시각화를 허용, 서부 블 롯팅 또는 실시간 PCR. 유동 세포 계측법 및 현미경을 통해 세포 지역화 통해 강글리오사이드 발현의 정량화는 높은 친화력과 특이성 안티 - 강글리오사이드 항체의 사용에 의해 얻을 수있다. 그럼에도 불구하고, 현탁액 중의 세포의 적절한 처리가 형광 또는 초점 현미경 취득 요구 필요한 접착 성을 촉진하는 배양 플레이트의 치료를 포함한다. 이 작품에서 우리는 순진한 CD4 + T 세포 활성화하는 동안 GD3 및 GD2 강글 리오 시드의 표현과 TCR와 colocalization을 결정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 리얼 t<40,000 세포를 사용 IME PCR 실험은 세포의 낮은 숫자 및 추가 저 입력 RNA 키트의 필요없이 수행 될 수있는 유전자 분석 실험을 보여주는 상기 GD3 및 GM2 / GD2 합성 효소 유전자의 결정을 위해 설명된다.
Introduction
CD4 + T 세포는 항원 제시 세포에 의해 활성화 한 후 자신의 이펙터 기능을 통해 면역 반응을 조율. 활성화 과정에서 변조 된 세포 메커니즘 연구는 면역 기능의 기본 과정에 대한 통찰력을 할 수 있습니다. 그들이 주변 혈액이 세포의 매우 작은 모집단을 대표하기 때문에, 나이브 CD4 + T 세포의 연구는 복잡해질 수있다.
형광 현미경을 통해 여러보고 CD4 + T 세포 활성화에 관여하는 다른 분자 플라즈마 막 (3)에 주로 연관 단백질의 위치 파악을 연구 하였다. 강글리오사이드는 시알 산 함유 글리 고스되어 있으며 광범위가 같은 면역 세포로서 풍부한 다른 세포 인 신경 세포 연구되었지만 또한 생물학적으로 중요한 기능과 4,5- 강글리오사이드를 표현한다. 우리는 이전에 그쪽을보고ST8Sia 1 (GD3 합성 효소)과 GM2 / GD2 합성 효소 시알 산 전이 효소 α2,8의 상향 조절이 인간의 순진한 CD4 + T 세포의 활성화 동안 t, 즉 GD2의 중요한 표면 neoexpression 및 GD3의 강글 리오 시드 (6)의 상향 조절을 유도한다. 면역 세포 GD3, GD2 강글 리오 시드 등의 추가의 연구는 면역 기능의 단백질 기반의 부분도를 보완 할 필요가있다.
일반적 갱글 발현 연구는 박층 크로마토 그래피 (TLC) (7)과 같은 기술에 기초하지만, 이러한 기술은 생물학적 분석을 제한하는 세포막 또는 세포 내 구획 강글리오사이드의 공간적 위치 파악을 허용하지 않는다.
이 작품에서 우리는 항 CD3 / 안티 CD28 활성화 후 인간의 순진한 CD4 + T 세포와 PBMC를에 GD3 및 GD2 강글리오사이드의 항체 매개 식별 및 위치 파악을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 IT 내가 함께림프구의 작은 크기 (9 μm의)을 고려하여, 고품질의 화상 (6)의 획득과, 현탁액 중의 세포의 낮은 숫자의 강글리오사이드의 유전자 발현 및 분자를 분석하는 것도 가능하다.
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Protocol
건강한 남성 기증자로부터 말초 혈액 동의하고 센트로 드 Investigaciòn 엔 DINAMICA Celular- 대학교 자치시 델 에스 타도 데 모렐 로스의 생명 윤리위원회의 승인을 얻었다.
1. 분리 및 인간 나이브 CD4 + T 세포의 활성화
- 동의서를 통해 건강한 인간 기증자로부터 유래 말초 혈액 2 ㎖를 수집하고 멸균 PBS-EDTA 2 ㎖로 희석 (1 배 인산염 완충 식염수 (PBS), 2 mM의 EDTA, pH를 7.4). 이전 8 설명한 바와 같이 1.077 밀도 자당 용액 3 ㎖의 상단에 천천히 희석 혈액을 추가합니다.
주 : 밀도 차이에 의한 원심 분리시 차등 마이그레이션 적혈구 침강 완전히 발생할 덜 조밀 한 단핵 세포의 층 위에 형성된다. 말초 혈액 2 ㎖를 purificati 후 약 0.5 × 106 나이브 CD4 + T 세포를 렌더링단계에. - 더 휴식 21 ° C (30mm의 고정 된 각도 둥근 바닥 튜브를 사용 로터) 250 XG에 원심 분리기 30 분 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 기울기를 생성합니다. 원심 분리 후, PBMC를 명확히 백색 링으로서 관찰 될 수있다. 피펫으로 PBMC를 수집하고 세척 멸균 튜브에 전송합니다.
- 10 분 동안 250 XG에 PBS-EDTA 용액으로 세척 한 후 세 나이브 CD4 + T 세포의 정제를 진행. 정렬 방법 또는 정제 키트 여러 종류의 이러한 목적으로 사용할 수있다. 바람직하게는, 정제> 1 × 10 7 PBMC를 사용합니다.
- 자기 구슬과 음의 선택에 의해 순진한 CD4 + T 세포를 정화. 안티 CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, 안티 TCRγ / δ, 안티 HLA-DR 및 CD235a (글리코 포린의 A) 항체와 부정적인 선택을 수행합니다. F 통한 CD4 + CD45RA + 세포를 측정하여 순도의 비율을 평가낮은 세포 계측법.
주 : 선택적으로, 밤새 37 ° C, 5 % 단핵 세포 부착을 촉진하고 나이브 CD4 + T 세포를 정제하여 계속 보충 된 10 ml의 배지에 1 × 106 세포 / ml의 농도로 CO 2에서 한 PBMC 배양 진행. 말초 혈에서 나이브 CD4 + T 세포의 효율적인 복구가 크게 정화 시스템에 의존한다.
- 자기 구슬과 음의 선택에 의해 순진한 CD4 + T 세포를 정화. 안티 CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, 안티 TCRγ / δ, 안티 HLA-DR 및 CD235a (글리코 포린의 A) 항체와 부정적인 선택을 수행합니다. F 통한 CD4 + CD45RA + 세포를 측정하여 순도의 비율을 평가낮은 세포 계측법.
- 5 μg의 / ㎖의 항 CD3 모노클로 날 항체와 PBS의 웰 당 250 μL를 첨가하여 24 웰 세포 배양 플레이트를 준비하고, 37 ℃에서 적어도 2 시간 동안 배양한다.
참고 : 96 웰 플레이트와 함께 사용할 수있다 나이브 CD4 + T 세포로부터 작은 수를 사용하는 경우 (예를 들어, X10 -1 2 × 105 (4)). - 24도 또는 96 웰 플레이트에서 항 CD3 항체 희석을 제거하고 두 번 멸균 1X PBS를 이용하여 접시를 씻으십시오.
- + 순도> 95 %로 나이브 CD4 + T 세포 (CD4 희석소 태아 혈청을 3 %로 보충 고급 RPMI 1640 배지에 1 × 106 세포 / ml의 밀도 CD45RA +)가 (혹은 RPMI 혈청의 10 %), 2 mM의 글루타민 및 항생제 (1 U / ㎖ 페니실린, 1 보충 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신).
참고 : 강글 리오 시드 현지화가 PBMC를 요구하는 경우 아래에 설명 된대로, 희석 및 자극에 대해 동일한 프로토콜을 따릅니다. - 항 CD3 코팅 우물과 24 웰 플레이트에서 비 코팅 된 웰 (대조군 세포)에 세포 희석 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 상기 96 웰 플레이트에 세포 희석액 100 ㎕를 추가한다.
- 항 CD28 항체 1 μg의 / ㎖를 첨가하여 항 CD3 피복 웰 나이브 CD4 + T 세포의 자극 조건을 완료.
- 항 CD28 항체를 첨가하지 않은 웰의 코팅 대조군으로서 휴지 CD4 + T 세포를 유지한다. 37 °의 표준 조건 하에서 72 시간 0의 휴식과 활성화 된 CD4 + T 세포를 품어C, 5 % CO 2.
- 37 ° C에서 배양 순진한 CD4 + T 세포를 휴식의 CD69 초기 활성화 마커 (16 시간 포스트 활성화) 또는 CD25 늦은 활성화 마커 (48 시간 포스트 활성화)의 발현 유동 세포 계측법에 의해 평가하고 활성화 적절한 활성화를 확인하려면 5 % 없거나 항 CD3 / CD28 항체 9,10의 존재하에 CO 2.
2. 휴식의 준수 및 활성화 나이브 CD4 + T 세포
- 적어도 15 분간 고압 증기 멸균 및 자외선 노출에 의해 12mm 라운드 커버 슬립을 소독.
- 멸균 24 웰 세포 배양 접시에 배치 된 커버.
주 : 1 미만 × 105 세포 배양의 경우는 커버 슬립에 세포의 분산을 방지하도록 작은 우물와 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 바람직하다. - 코팅 된 커버 폴리 -L- 라이신으로 200 μL (또는 슬라이드 챔버) (MW 150-300 KDa의) 0.1 % (w / v)의 용액을 (R)에서 5 분 동안 배양움 온도 (RT)는 실온에서 적어도 1 시간 동안 제거하고 건조.
- 신중하게 혼합하고 24 웰 플레이트에서 휴식 및 활성화 순진한 CD4 + T 세포를 수집합니다. 세포를 세어 필요한 경우 폴리 -L- 리신 코팅 된 커버 슬립을 1 × 105 세포를 전송할 새로운 보충 배지로 조정한다. 37 O C에서 6 시간의 최소 5 % CO 2 세포를 품어.
3. 나이브 CD4 + T 세포를 수집 및 휴식의 고정 및 활성화
- 조심스럽게 배양 휴식 및 활성화 순진한 CD4 + T 세포에서 매체를 제거합니다.
- RT 멸균 PBS 500 μl를 천천히를 추가합니다.
참고 : 우물에서 솔루션의주의 추가 및 제거는 커버 슬립에서 세포의 분리를 방지 할 수 있습니다. - PBS를 폐기하고 철저하게 문화 매체를 제거하기 위해 또 다른 500 μl의 PBS를 추가합니다.
- 500 μL 여과하고 4 % 파라 포름 알데히드의 첨가 (FILT하여 세포를 고정배급은 현미경 분석에 방해) 및 (선호) 또는 밤새 4 ° C에서 RT에서 30 분 동안 배양 할 수 미립자를 제거합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 독성 및 휘발성 화합물이다. 인간 발암 물질로 알려져있다. 적절한 안전 프로토콜을 신중하게 사용합니다. - 정착액을 제거하고 RT에서 PBS로 두 배 이상 씻는다.
- 다음 단계로 진행 또는 염색까지 몇 일 동안 4 ° C에서 PBS 500 μL와 함께 접시 우물을 유지한다.
참고 :이 과정에서 불임은 미생물의 성장을 방지 할 수 있습니다.
4. 염색, 공 초점 현미경에 의해 설치 및 시각화
- 우물에서 PBS를 제거합니다. 차가운 블로킹 완충액 500 ㎕를 추가 (1X PBS, 0.5 %의 표준 등급의 소 혈청 알부민, 1 % 소 태아 혈청의 pH 7.4). 얼음에 20 분 동안 품어.
- 신중하게 차단 버퍼를 제거하고 일차 항체 추가 (항 강글리오사이드 GD3 클론 R24을, GD2 클론 14G2a)PE-복합 항 CD25 및 APC - 복합 안티 TCR 및 2.5 μg의 / ㎖로 버퍼를 차단에 희석 컨트롤을 아이소 타입.
- 얼음에 2 시간 또는 밤새 4 ° C를 품어.
주 : 느린 오비탈 교반이 바람직하다. - 조심스럽게 항체를 제거하고 PBS의 천천히 500 μl를 추가합니다. 두 번 반복합니다.
- 이차 항체 0.1 μg의 / ㎖로 버퍼를 차단에 희석 (R24 안티 GD3, 알렉사 플 루어 14G2a 방지 GD2에 대한 488 공역 또는 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티의 IgG2a에 대한 FITC 복합 항 IgG3)를 추가합니다.
- 흔들림없이 어둠 속에서 얼음에 1 시간 동안 품어.
- 4.4에 설명 된대로) PBS에 세 번 씻으십시오. 샘플의 탈수를 피하기 위해 충분한 PBS로 우물을 유지합니다.
- 0.1 ㎍ / ml의 PBS에 희석 훽스트 333258 얼룩을 추가합니다.
- 실온에서 15 분을 품어 제거합니다. PBS로 세 번 씻으십시오.
- 종이 타월에 슬라이드를 삽입하고 설치 솔루션 (PBS에 50 % 글리세롤) 또는 상업적 장착 용액 20 μl를 추가들 페이딩 및 샘플에서 담금질 방지 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 고급 핀셋으로 커버 슬립을 선택하고 설치 솔루션에 놓습니다. 세포가 부착 된 커버 슬립의 측면이 용액과 접촉에 있는지 확인합니다. 매니큐어로 된 커버를 밀봉 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다.
RNA의 5 격리
- 항 CD3 항체 (5 μg의 / ㎖) 코팅 된 96 웰 플레이트를 준비합니다. 자극을 완료하기 위해 4 × 104 나이브 CD4 + T 세포 / 웰의 항 CD28 항체 (1 μg의 / ㎖)이 보충 된 배양 배지 100 μl를 부화. 0 ~ 72 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %.
- 다른 후 활성화 시간 후 microcentrifuge 관에 세포를 배치합니다.
- RT에서 5 분 250 XG에 500 PBS의 μL와 원심 분리기를 추가합니다.
- 상층 액을 제거하고 1ml의 트리 졸 시약을 추가합니다.
- RT에서 5 분 동안 품어에서 샘플을 유지 -8076 적어도 24 시간 동안 C. 필요할 때 RNA 분리를 진행합니다.
참고 : 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 떠난다는 RNA 수율을 향상시킨다. 또한, 손 장갑 RNases 사용하여 RNA 분해를 방지하는 데 필수적이다. - 수욕에서 2 분 동안 37 ℃에서 항온 처리 샘플을 해동.
- 200 μl의 클로로포름을 추가하고 30 초 (텍싱에 의해 RNA의 적극적인 혼합을 방지하기 위해)을 위해 손으로 격렬하게 흔들어. 실온에서 5 분 품어.
- 4 ℃에서 12,000 XG에 원심 분리기 15 분.
- 새로운 microcentrifuge 관에 수상을 복구 할 수 있습니다.
- 500 ㎕의 이소프로판올을 추가하고 튜브를 세 번 반전.
- 4 ° C에서 12,000 XG에 10 분 동안 10 RT에서 분 원심 분리기를 품어.
- 반전에 의해 상층 액을 버린다.
- 4 ℃에서 12,000 XG에 얼음 차가운 75 % 에탄올과 원심 분리기 10 분의 1 ML을 추가합니다.
- 완전히 뜨는을 버리고 오픈 튜브의 캡을 떠나는하여 RNA 펠렛을 건조.
아니E :이 시점에서 펠릿을 명확하게 표시되지 않습니다. 어쨌든 진행합니다. - 분자 수준의 물 20 μL에 펠렛을 재현 탁. nanodrop를 사용하여 260 nm 내지 280 nm의 흡광도를 측정함으로써 농도 및 핵산의 순도를 계산한다.
- 임의의 통상적 인 역전사 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성 심하게 진행.
주 : 약 0.5 μg의 RNA는 4 × 104 나이브 CD4 + T 세포로부터 얻어진다. cDNA를 RNA 100에서 NG synthetized 낮은 RNA 입력 장비의 필요없이 실시간 PCR 반응에서 사용될 수있다.
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Representative Results
이 논문에 기술 된 프로토콜은 배양의 좋은 품질과 접착 휴식 및 활성화 인간의 순진한 CD4 + T 세포 (그림 1) 렌더링합니다. 활성화 된 CD4 + T 세포는 휴면 상태 (도 1A)와 비교하여 특징적인 증식 프로파일 (도 1B)를 도시한다. CD25 늦은 활성화 마커 공 초점 현미경 (그림 1C)에 의해 관찰 72 시간의 효율적인 활성화를 평가하는 데 유용합니다. CD69 마커는 유동 세포 계측법 또는 현재 현미경 조기 활성화 마커로서 사용된다. 폴리 -L- 라이신으로 코팅 된 커버 슬립에 휴식의 준수 및 활성화 순진한 CD4 + T 세포는 안티 GD3 및 안티 TCR 항체 (그림 2)와 이중 라벨로 보여 GD3 및 TCR의 발현 및 현지화를 연구하는데 유용하다. 우리가 이전에보고 된 바와 같이, 활성화는 리모델링을 동반세포에서 GD3의 ING 및 GD2 강글리오사이드는 6 표면. 또한, GD3 및 GM2 / GD2 합성 효소의 유전자 발현의 정량화를 4 × 104 세포에서 수행된다 (도 2 및도 3). 관성 (GD2)의 강글 리오 시드와 TCR의 colocalization을의 신 표현은 적절 그림 4. 활성화 (그림 3) 중 TCR 클러스터링에 GD2의 가능한 역할을 보여주는, 공 초점 현미경으로 관찰 활성화 CD4 동시에 스테인드 GD3 및 GD2 강글 리오 시드의 현지화를 보여줍니다 + T 세포. 또한, 활성화 된 PBMC 항 GD3,이 프로토콜은 모든 활성 PMBCs에서 발현되는 (도 5)를 발견 하였다 GD2 특히 PMBCs 검색된 다른 면역 세포 집단에서 사용할 수 있음을 나타내는 항 GD2 항체로 염색 하였다.
그림 1 : 순진한 CD4 + T 세포의 시각화 준수하고 효율적인 항 CD3 / 안티 CD28 활성화 후 (A) 휴식 CD4 + T 세포 폴리 -L- 라이신 처리 된 커버 슬립에 부착 된 72 시간 게시물 활성화에 시야에서 관찰된다. 현미경 사용. 폴리 -L- 라이신 처리 된 커버 슬립 상에 부착 72 시간에서 CD4 + T 세포를 활성화 (B). 72 시간 게시물 활성화에 항 CD3 / 안티 CD28 활성화 된 CD4 + T 세포의 (C) CD25 마커의 발현 (적색) 및 훽스트 333258 스테인드 핵 (파란색). 스케일 바는 50 μm의 =. 이미지가 2 배 디지털 줌과 60X S / 1.3 오일 목적으로 공 초점 현미경으로 얻을 수 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 휴식에 GD3의 강글 리오 시드와 TCR 염색 및 현미경 현지화 및 72 시간 후 활성화에 순진한 CD4 + T 세포를 활성화 휴식 CD4 + T 세포를 훽스트 333258, (B) GD3의 강글 리오 시드 현지화, (염색 (A) 핵으로. C) 핵 및 GD3의 강글 리오 시드의 병합합니다. 훽스트 333,258 물들 (D) 핵으로 활성화 된 CD4 + T 세포는 (E)의 GD3 강글리오사이드 지역화 및 (F)의 핵과 GD3 강글리오사이드의 병합. 순진한 CD4 + T 세포를 휴식에 (G) 및 (H) 쇼 TCR 및 GD3의 강글 리오 시드. (J 및 K)가 활성화 된 CD4 + T 세포의 TCR 및 GD3 강글리오사이드 염색에 대응한다. 순진한 CD4 + T 세포 (I)를 휴식의 TCR (빨간색)와 GD3의 강글 리오 시드 (녹색) 현지화의 공 촛점 이미지항 CD3 / CD28는 순진한 CD4 + T 세포에게 72 시간의 후 활성화 (L)을 활성화. GD3, TCR 및 핵 얼룩은 60X S와 하나의 스택 / 2 배 디지털 줌 1.3 오일 목적에서 공 초점 현미경으로 평가 하였다. (M)의 그래프는 PCR 4 × 104에서 폴드 변경 휴식 (휴식), 72 시간 후 - 활성화에서 활성화 (법) 순진한 CD4 + T 세포로 표현 실시간에 의해 결정 GD3 합성 효소의 유전자 발현을 보여줍니다. 데이터는 3 개의 독립적 인 기증자로부터 SD ± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : GD2의 강글 리오 시드와 TCR 얼룩과 휴식의 현미경 현지화 및 72 시간 후 활성화에서 활성화 순진한 CD4 + T 세포. (A) 핵와 CD4 + T 세포를 휴식, (B) GD2의 강글 리오 시드 현지화, (C) 핵 및 GD2의 강글 리오 시드의 병합합니다. 훽스트 333,258 물들 (D) 핵으로 활성화 된 CD4 + T 세포는, (E) GD2 강글 리오 시드에 지역화 및 (F)의 핵 및 GD2 강글 리오 시드의 병합. (G와 H) 쇼 TCR과 순진한 CD4 + T 세포를 휴식에 GD2의 강글 리오 시드. (J 및 K)가 활성화 된 CD4 + T 세포의 TCR 및 GD2 강글 리오 시드 염색에 대응한다. 순진한 CD4 + T 세포 (I) 및 항 CD3 휴식의 TCR (빨간색) 및 GD2의 강글 리오 시드 (녹색) 현지화의 공 촛점 이미지 / CD28는 순진한 CD4 + T 세포에게 72 시간의 후 활성화 (L)을 활성화. 관성 (GD2), TCR 및 핵 얼룩은 하나의 스택에서 공 초점 현미경으로 평가 하였다배 디지털 줌 60X S / 1.3 오일 목적. (M)의 그래프는 PCR 4 × 104에서 폴드 변경 휴식 (휴식), 72 시간 후 - 활성화에서 활성화 (법) 순진한 CD4 + T 세포로 표현 실시간 의해 결정 GM2 / GD2 합성 효소의 유전자 발현을 보여줍니다. 데이터는 3 개의 독립적 인 기증자로부터 SD ± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 안티 GD3 및 GD3 및 GD2 강글리오사이드 현지화를위한 안티 - GD2 항체 더블 얼룩 활성화 된 CD4 + T 세포에서 R24 안티 GD3 항체로 식별 (A) GD3의 강글 리오 시드가 세포 내 및 막 지역화를 보여줍니다. (B)의 GD2 강글 리오 시드 14G2 식별활성화 된 CD4 + T 세포에서 항 GD2 항체는 세포막 현지화를 나타낸다. 활성화 된 CD4 + T 세포로부터 (C) 시야 현미경. GD3 및 GD2 얼룩은 2 배 디지털 줌과 60X S / 1.3 오일 목적으로 하나의 스택에서 공 초점 현미경으로 평가 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 활성화 된 PBMC에서 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 현지화 (A) GD2의 강글 리오 시드가 C (시야 현미경, (B) GD2의 강글 리오 시드의 발현 및 안티 CD3 / 안티 CD28 72 시간 게시물 활성화 PBMC를 오버레이에 14G2a 항 GD2 항체로 검출되었다 ) GD2의 강글 리오 시드와 핵 병합합니다. (D) GD3의 ganglios시야와 R24 안티 GD3 항체 오버레이로 염색 IDE (E) GD3 강글 리오 시드의 발현 및 (F) GD3의 강글 리오 시드와 핵 병합합니다. GD3, GD2 및 핵 얼룩은 60X S와 하나의 스택 / 2 배 디지털 줌 1.3 오일 목적에서 공 초점 현미경으로 평가 하였다. 스케일 바 = 45 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기술 된 프로토콜은 CD4 + T 세포 또는 세포의 수가 적은부터 다른 면역 세포 (예 PMBCs,도 5)의 세포 현탁액 갱글 또는 단백질 지역화하는데 사용될 수있다. 때문에 T 세포 비 접착 특성의 작은 크기의 불량 정보 또는 낮은 품질의 형광 현미경 사진의 결과를 취득 셀이 올바르게 부착되지 않은 경우.
이 선도, 치료 중 강글리오사이드의 공간 지역화 및 역학 (예를 들면, T 세포 활성화)를 보여준다 때문에 양질 초점 현미경 분석과 결합이 프로토콜은 강글리오사이드의 검출을 위해 박층 크로마토 그래피와 같은 기술의 사용에 비해 중요한 장점 생물학적으로 관련 데이터 11,12,13의 취득. 또한,이 프로토콜은 갱글 표현의 평가가 CD4 + T 세포의 소수 (2 × 104부터 허용) 그 복제 또는 상이한 검정 (6)의 수를 최적화하는데 유용하다.
접착 후 세척하고, 항체 염색시주의 치료 세포 수 및 무결성을 유지하기 위해 중요하다. 때문에 커버 슬립으로 CD4 + T 세포의 약한 결합, 신중하게 추가하고 용액을 제거하기 위해 매우 중요하다; 그렇지 않은 세포 수 증가 형광 파편의 감소가 발생한다. 공 초점 현미경을 통해 평가하는 경우, 강글리오사이드의 면역 염색은 공간 지역화 또는 세포막이나 세포 내 구획에서 다른 분자와 공동 현지화 등의 추가 정보를 부여한다. 세포 내 현지화는 세포 내 마커 (14), (15)의 사용을 필요로한다. 또한, 고정 신선하지 CD4 + T 세포는 세포 표면에 한정 강글리오사이드 식을 결정할 때 염색을 위해 사용되어야한다. 비록 CD4 + T 가전의 고정LLS 그것은 permeabilization 및 세포 염색의 위험을 수행 적어도 오일의 샘플을 보존 돕는다.
그러나, 강글리오사이드 사이의 구조적 유사성 때문 계정에 사용되는 항체의 특이성을하는 것이 좋습니다. 시판되는 항 - 강글리오사이드 모노클로 날 항체 중 일부는 사용될 수 있으며, 그들 중 일부에 대한 특이 ELISA, TLC 등 16,17,18하여 프로빙되었다.
이전 작업은 조건 당 6 / 2 × 104 세포로부터 GD3 강글리오사이드 및 GD2의 지역화 표현에 관한 정보를 얻을 수 있음을 보여준다. 또한,이 프로토콜은 4 X 104 세포에서 유전자 프로파일 실험을 수행하는 등의 렌티 바이러스 입자 (6)에 기반으로하는 실험을 침묵의 최적화를 허용하는 기능을 설명한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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