Summary
我们描述了在显微镜使用，以确定在静止神经节苷脂和激活的人幼稚CD4 + T细胞的细胞膜表达和定位一个标准抗体染色方案。还使用<40,000个细胞，不需要额外的低输入RNA试剂描述的实时PCR实验。
Abstract
在悬浮液中和对幼稚CD4 + T细胞的活化本文描述的方法及其在盖玻片共聚焦显微镜分析依从允许参与CD4 + T细胞活化神经节苷脂的空间定位和可视化，即补体表达分析实验，如流式细胞仪，西印迹或实时PCR。神经节苷脂表达通过流式细胞仪，并通过显微镜它们的细胞定位的量化可以通过使用抗神经节苷脂抗体以高亲和力和特异性来获得。然而，在悬浮细胞的适当处理涉及培养板的处理，以促进对荧光或共聚焦显微镜获得所需的必要的粘附性。在这项工作中，我们描述了幼稚的 CD4 + T细胞活化期间确定GD3和GD2神经节苷脂表达并与TCR共定位的协议。此外，真正的-T使用<40,000个细胞IME PCR实验为GD3和GM2 / GD2合酶基因的测定中描述，这表明基因分析实验可以低数量的细胞，无需额外的低输入的RNA试剂盒来进行。
Introduction
的CD4 + T细胞协调通过其效应子功能由抗原呈递细胞1活化后的免疫应答。被激活期间调制的细胞机制的研究允许洞察免疫功能的一基本过程。然而，因为它们在血液周2代表细胞的非常小的群体幼稚CD4 + T细胞的研究可能是复杂的。
通过荧光显微镜几个报告已经研究参与CD4 + T细胞活化的不同分子，主要关联至质膜3蛋白的定位。神经节苷脂含唾液酸鞘糖脂，虽然他们已经在他们丰富，其他细胞等免疫细胞的神经细胞被广泛研究，也表达了与生物学相关职能4,5神经节苷脂。我们以前报道THA人幼稚CD4 + T细胞的活化有所述α2,8唾液酸转移酶ST8Sia 1（GD3合酶）和GM2 / GD2合酶的上调在t，诱导GD2的显著表面neoexpression和GD3神经节苷脂6的上调。在免疫细胞GD3，GD2和其他神经节苷脂的进一步研究是必要的，以补充免疫功能的蛋白质为基础的局部视图。
通常，神经节苷脂表达的研究是基于技术如薄层色谱法（TLC）7，但该技术不允许神经节苷脂的空间定位在质膜或在亚细胞区室，限制生物分析。
在这项工作中，我们描述了在人幼稚CD4 + T细胞和PBMC中抗CD3 /抗CD28活化后GD3和GD2神经节苷脂的抗体介导的识别和定位的协议。有了这个协议，我就也有可能以分析神经节苷脂的基因和分子表达在低数量在悬浮细胞，以获得高质量的图像6，考虑淋巴细胞的小尺寸（9微米）。
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Protocol
与知情同意和炫酷德Investigaciòn连接DinámicaCelular-自治大学德尔斯卡德莫雷洛斯生物伦理委员会批准获得从健康男性献血者外周血。
1.分离人幼稚CD4 + T细胞活化
- 收集2毫升从通过知情同意健康人供体衍生的外周血，并用2毫升无菌PBS-EDTA的稀（1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），2毫摩尔EDTA，pH 7.4）中。关于3毫升蔗糖溶液的顶端缓慢加入稀释的血液与1.077密度如前所述8。
注意：所引起的密度差在离心分离期间微分迁移将导致红细胞完全沉淀和密度较小的单核细胞层将形成以上。加入2ml外周血将purificati后呈现约0.5×10 6幼稚CD4 + T细胞在步骤。 - 在在21℃（使用转子用于与为30mm固定角度圆底管），并且没有断点250 XG离心30分钟至产生外周血单核细胞（PBMC）的梯度。离心后，将PBMC中可以清楚地观察到，为白色环。收集用移液器将PBMC和转移到无菌管中，洗涤。
- 洗涤三次后，在250×g离心10分钟，PBS-EDTA溶液进行幼稚CD4 + T细胞的纯化。排序方法或几种类型的纯化试剂盒可用于该目的。优选地，使用> 1×10 7个PBMC中纯化。
- 通过用磁珠阴性选择纯化幼稚CD4 + T细胞。用抗CD45RO，CD8，CD14，CD15，CD16，CD19，CD25，CD34，CD36，CD56，CD123，抗TCRγ/δ，抗HLA-DR，和CD235a（血型糖蛋白A）的抗体进行阴性选择。由至f确定的CD4 + CD45RA +细胞评估纯度的百分比低流式细胞仪。
注意：任选地，进行到PBMC中的孵育在37℃和5％的CO 2与在10ml补充的培养基的1×10 6个细胞/ ml的密度，以促进单核细胞粘附，并继续与幼稚CD4 + T细胞纯化过夜。从外周血幼稚CD4 + T细胞的有效回收很大程度上取决于净化系统。
- 通过用磁珠阴性选择纯化幼稚CD4 + T细胞。用抗CD45RO，CD8，CD14，CD15，CD16，CD19，CD25，CD34，CD36，CD56，CD123，抗TCRγ/δ，抗HLA-DR，和CD235a（血型糖蛋白A）的抗体进行阴性选择。由至f确定的CD4 + CD45RA +细胞评估纯度的百分比低流式细胞仪。
- 通过加入每PBS的孔250微升含5微克/ ml抗CD3单克隆抗体制备的24孔细胞培养板中，并在37°C孵育至少2小时。
注：96孔板可以用来当使用从幼稚CD4 + T细胞数量较少（ 例如，2×10 4 -1×10 5）。 - 除去从24孔或96孔板的抗CD3抗体的稀释和洗涤用无菌1×PBS洗涤两次板。
- 用稀释纯度> 95％的幼稚CD4 + T细胞（CD4 +CD45RA +）以补充有胎牛血清的3％的1×10 6个细胞/ ml，在先进的RPMI 1640培养基中的密度（或RPMI补充有血清的10％），2mM谷氨酰胺和抗生素（1 100U / ml青霉素，1 100μg/ ml链霉素）。
注意：如果神经节苷脂本地化外周血单个核细胞中要求，遵循同样的协议进行稀释和刺激，如下所述。 - 加入500微升细胞稀释的抗CD3包被的孔，并在24孔板非涂布孔中（对照细胞）。备选地，加入100微升细胞稀释到96孔板的孔中。
- 通过加入抗CD28抗体的1微克/毫升完成幼稚的 CD4 + T细胞在抗CD3包被的孔的刺激条件。
- 保持静止的 CD4 + T细胞在非包被的孔控制在不加抗CD28抗体。孵育0静止和活化的CD4 + T细胞，以72小时的37℃的标准条件下C和5％ 的 CO 2。
- 为了验证一个适当的活化静息流式细胞仪检测CD69早期活化标记（16小时激活后）或CD25晚期活化标志（48小时后激活）的表达，评估和激活，在37℃下培养幼稚CD4 + T细胞和5％的CO 2在不存在或抗CD3 / CD28抗体9,10的存在。
2.休息的坚持和激活幼稚的CD4 + T细胞
- 消毒通过高压和紫外线照射12毫米圆形盖玻片至少15分钟。
- 地方盖玻片在无菌的24孔细胞培养板。
注意：对于具有小于1×10 5细胞培养物是优选使用滑动室有适于小孔，以防止细胞分散在盖玻片。 - 涂层盖玻片（或滑动室）用200μl聚L-赖氨酸（MW 150-300千道尔顿）的0.1％（重量/体积）溶液，并孵育在r 5分钟OOM温度（RT），取出，晾干，在室温至少1小时。
- 仔细混合并收集来自24孔板的休息和激活幼稚的 CD4 + T细胞。计数细胞，并在必要时用新鲜补充的培养基调整至1×10 5个细胞转移到聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片。孵育所述细胞在37℃下至少6小时和5％的CO 2。
3.收集和休息的固定和激活幼稚的CD4 + T细胞
- 小心地从培养的休息和激活幼稚的 CD4 + T细胞的培养基。
- 添加RT无菌PBS500μl的慢。
注意：从井溶液仔细添加和去除防止细胞的分离从盖玻片。 - 弃去PBS，并添加另外500微升PBS彻底清除培养基。
- 加入500微升过滤4％多聚甲醛（FILT修复细胞配给移除可与显微镜分析干扰），并在RT（优选的）或在4℃过夜温育30分钟微粒。
注意：多聚甲醛是一种有毒的挥发性化合物。它被称为是一个人类致癌物。用适当的安全协议，请谨慎使用。 - 除去固定剂，并在室温用PBS洗涤至少两次。
- 继续进行下一步骤，或保持板孔用500μl的PBS在4℃下数天，直至染色。
注：在此过程中不育有助于避免微生物的生长。
4.染色，安装和可视化激光共聚焦显微镜
- 从孔中取出PBS中。加入500微升冷封闭缓冲液（1×PBS，0.5％的标准级牛血清白蛋白，1％胎牛血清pH 7.4）中。孵育在冰上20分钟。
- 小心地取出封闭液，添加的主要抗体（抗神经节苷脂GD3克隆R24，GD2克隆14G2a）PE标记的抗CD25和APC缀合的抗TCR和同种型在封闭缓冲液以2.5微克/毫升稀释的控制。
- 在冰上孵育2小时或过夜，在4℃。
注：缓慢轨道搅动是优选的。 - 小心取出抗体和缓慢加入500微升的PBS。重复两次。
- 添加二次抗体在封闭缓冲液以0.1微克/毫升稀释（为R24抗GD3，的Alexa Fluor为14G2a抗GD2 488缀合的或的Alexa Fluor 647缀合的抗IgG2a的FITC缀合的抗IgG3的）。
- 孵育在黑暗冰1小时无晃动。
- 在PBS中洗涤三次如4.4所述）。保持有足够的PBS的孔中，以避免样品脱水。
- 添加赫斯特333258染色在PBS中稀释至0.1微克/毫升。
- 孵育15分钟，在室温和删除。在PBS中洗涤三次。
- 放置在纸巾上的幻灯片，并添加20微升安装溶液（在PBS中的50％的甘油）或商业安装溶液s到避免褪色和样品淬火。
- 小心地拿起用细镊子盖玻片，并将其放置在安装的解决方案。确保在细胞附着在盖玻片的侧面与所述溶液接触。密封指甲油盖玻片并用荧光或共聚焦显微镜分析。
5.隔离的RNA
- 制备抗CD3抗体（5微克/毫升）包被的96孔板上。孵育4×10 4个幼稚CD4 + T细胞/孔在100μl补充培养基与抗CD28抗体（1μg/ ml的）来完成的刺激。在37℃和5％CO 2的0至72小时。
- 不同的激活后次后放置细胞成离心管中。
- 在250 XG添加的PBS 500微升，离心在RT 5分钟。
- 除去上清液，加入1ml Trizol试剂。
- 在室温下孵育5分钟，并保持样品在-8076℃持续至少24小时。在需要时与RNA分离进行。
注意：在-80℃下离开样品至少24小时提高RNA的产率。此外，利用手的手套是必不可少由RNA酶，以避免RNA降解。 - 除霜温育的样品在37℃水浴中2分钟。
- 加入200μl氯仿，用手30秒（以避免RNA侵略性混合涡旋）剧烈震荡。孵育5分钟，在室温。
- 在4℃下12000 xg离心离心15分钟。
- 回收水相到一个新的离心管中。
- 加入500微升异丙醇并倒转试管三次。
- 孵育在室温10分钟，离心10分钟以12,000 xg离心在4℃下。
- 丢弃由倒置上清。
- 以12,000 xg离心加入1ml冰冷的75％乙醇，离心10分钟，在4℃。
- 完全弃去上清液并通过在离开管打开的盖干燥RNA沉淀。
不E：在这一点上的粒料不是清晰可见。仍要继续。 - 重悬沉淀于20μl的分子级的水。通过测定使用的NanoDrop 260 nm和280nm处的吸收计算浓度和核酸纯度。
- 通过使用任何传统的逆转录酶试剂盒，并按照manufacturer's协议认真着手合成cDNA。
注意：从4×10 4个幼稚的 CD4 + T细胞中获得约0.5-2微克的RNA。 cDNA可从100ng的RNA的被原料合成，并无需低RNA输入试剂盒在实时PCR反应中使用。
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Representative Results
在这个手稿中描述的协议使得培养良好的质量和附着静息和活化的人幼稚CD4 + T细胞（ 图1）。活化的CD4 + T细胞显示出相比于静止状态（ 图1A）的特征的增殖曲线（ 图1B）。的CD25迟活化标志是评价在通过共聚焦显微镜（ 图1C）观察到72小时的有效激活是有用的。的CD69标记当前通过流式细胞仪或显微镜用作早期激活标志物。休息的粘附和活化的幼稚CD4 + T细胞向包被有聚-L-赖氨酸盖玻片是研究GD3和TCR的表达和定位有用表明用抗GD3和抗TCR抗体（ 图2）双标记。正如我们此前报道，激活是伴随着改造和GD3的ING GD2神经节苷脂在细胞表面6。此外，GD3和GM2 / GD2合酶基因表达的定量是由4×10 4个细胞进行（ 图2和3）。 GD2的神经节苷脂和TCR共定位的新表达充分通过共聚焦显微镜观察，证明GD2的TCR的聚类活化（ 图3）中可能发挥的作用。 图4示出了在激活的CD4同时染色GD3和GD2神经节苷脂的定位+ T细胞。此外，激活的PBMC与抗GD3和抗GD2抗体表示，该协议可以在PMBCs发现，特别是GD2其他免疫细胞群被发现在所有的激活PMBCs待表达（ 图5）被用于染色。
图1： 后幼稚CD4 + T细胞的可视化粘附和高效的抗-CD3 /抗-CD28活化 （A）的静息CD4 + T细胞在附着于聚L-赖氨酸处理过的盖玻片72小时后的活化由明场观察。显微镜。 （B）在连接在聚-L-赖氨酸处理过的盖玻片72小时活化CD4 + T细胞。 （C）的CD25标记表达抗CD3 /抗CD28活化CD4 + T细胞中的72小时活化后（红色）和Hoechst公司333258染色的核（蓝色）。比例尺= 50微米。照片被用60X S / 1.3油浸物镜与2倍数码变焦聚焦显微镜获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：GD3 神经节苷脂和TCR染色和显微镜检查在静止的定位和活化的幼稚CD4 + T细胞在72小时活化后静息CD4 + T细胞与用Hoechst 333258，（B）的GD3神经节苷脂本地化，（染色的（A）的核。 C）合并核和GD3神经节苷脂的。激活CD4 + T细胞，用Hoechst染色333258（D）核，（E）GD3神经节苷脂本地化和（F）合并核和GD3神经节苷脂的。 （G）和（H）显示TCR和GD3神经节苷脂休息幼稚CD4 + T细胞。 （J和K）对应于TCR和GD3神经节苷脂染色在活化的CD4 + T细胞。在休息的幼稚CD4 + T细胞（I）TCR（红色）和神经节苷脂GD3（绿色）定位的共聚焦图像和抗CD3 / CD28激活幼稚CD4 + T细胞72小时激活后（L）。该GD3，TCR和细胞核染色由/一个堆栈具有60X小号1.3油浸物镜与2倍数码变焦评估共聚焦显微镜。 （M）该图显示了由实时PCR表示为4×10 4个休息（垫）的倍数变化和激活（法）幼稚的 CD4 + T在72小时活化后的细胞确定GD3合酶的基因的表达。数据是平均值±从三个独立的捐助者SD。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：GD2 神经节苷脂和TCR染色和在休息显微镜定位和在72小时活化后活化的幼稚的CD4 + T细胞。 + T细胞，用Hoechst染色333258（A）核，（B）GD2神经节苷脂本地化，（C）合并核和GD2神经节苷脂。激活CD4 + T细胞，用Hoechst染色333258（D）核，（E）GD2神经节苷脂本地化和（F）合并核和GD2神经节苷脂。 （G和H）显示TCR和休息幼稚CD4 + T细胞GD2神经节苷脂。 （J和K）对应于TCR和GD2神经节苷脂染色在活化的CD4 + T细胞。在休息的幼稚CD4 + T细胞（I）和抗CD3 TCR（红色）和神经节苷脂GD2（绿色）定位的共聚焦图像/ CD28激活幼稚CD4 + T细胞72小时激活后（L）。该GD2，TCR和核染色从一个堆栈通过评估共聚焦显微镜用60X S / 1.3油浸物镜与2倍数码变焦。 （M）该图显示了由实时PCR表示为4×10 4个休息（垫）的倍数变化和激活（法）幼稚的 CD4 + T在72小时活化后的细胞确定GM2 / GD2合酶的基因的表达。数据是平均值±从三个独立的捐助者SD。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 双染色用抗GD3和抗GD2抗体GD3和GD2神经节苷脂定位在活化的CD4 + T细胞与R24抗GD3抗体鉴定（A）中的GD3神经节苷脂显示细胞内和细胞膜定位。 （B）GD2神经节苷脂等同于14G2在活化的 CD4 + T细胞中的抗GD2抗体仅示出等离子体膜定位。从活化的 CD4 + T细胞（C）明视镜。该GD3和GD2染色激光共聚焦显微镜从一个堆栈具有60X S / 1.3油浸物镜与2倍数码变焦评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 在激活的PBMC GD3和GD2神经节苷脂本地化与14G2a抗GD2抗体检测中抗CD3 /抗CD28的72小时后的激活的PBMC覆盖与明场显微术，（B）的GD2神经节苷脂表达和（A）GD2神经节苷脂（℃ ）GD2神经节苷脂和原子核合并。 （D）GD3 gangliosIDE与R24抗GD3抗体覆盖与明染色，（E）GD3神经节苷脂的表达和（F）GD3神经节苷脂和原子核合并。该GD3，GD2和细胞核染色由/一个堆栈具有60X小号1.3油浸物镜与2倍数码变焦评估共聚焦显微镜。比例尺= 45微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
所述协议可以用于本地化神经节苷脂或蛋白质中的 CD4 + T细胞或其它免疫细胞（ 例如 ，PMBCs， 图5）由少数细胞起始的细胞悬浮液。因为T细胞和非粘附性的小尺寸的，收购的信息差或低质量的荧光显微图像的结果，如果该细胞不正确地附着。
该协议具有良好质量的共聚焦显微镜分析相结合是对使用技术如薄层色谱法检测神经节苷脂的重要优势，因为它揭示了在治疗过程中神经节苷脂的空间定位和动力学（ 例如，T细胞的活化），导致采集生物相关数据11,12,13的。此外，该协议允许神经节苷脂表达的评价从一个小数目的 CD4 + T细胞（2×10 4起），它是用于优化重复或不同测定6的数目是有用的。
粘接后清洗和抗体染色过程中的精心治疗，才是维护细胞数量和完整性是至关重要的。因为CD4 + T细胞的盖玻片的弱结合的，这也是很重要的，以仔细地添加和删除的解决办法;否则在细胞数和增加的荧光碎片的减少会遇到。当通过共聚焦显微镜评估，神经节苷脂的免疫赋予额外的信息，如空间定位或协同定位在质膜或细胞内区室的其它分子。亚细胞定位需要使用亚细胞标记物14，15的。此外，新鲜的和不固定的CD4 + T细胞需要被用于确定限定于细胞表面的神经节苷脂表达时染色。虽然CD4 + T CE的固定LLS有助于保持样品为至少5天，它承载通透性和细胞内染色的危险。
然而，由于神经节苷脂之间的结构相似性，它始终是最好要考虑到使用的抗体的特异性。几个商购的抗神经节苷脂的单克隆抗体的可直接或一些它们的特异性已被通过ELISA，薄层色谱， 等等 16,17,18探测。
以前的作品表明，它有可能获得关于从2×10 4细胞GD3和GD2神经节苷脂的定位和表达信息/每条件6。此外，该协议描述了从4×10 4个细胞进行基因分析实验，使沉默实验，例如基于在慢病毒粒子6的那些优化的能力。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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