Summary
Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 +. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR <40.000 células que não requerem kits adicionais baixos de ARN de entrada.
Abstract
Os métodos aqui descritos para a activação de células T CD4 + naive em suspensão e a sua aderência em lamelas para análise por microscopia confocal de permitir que a localização espacial e a visualização de gangliósidos envolvidos na activação de células T CD4 +, que a expressão do complemento profiling experiências, tais como citometria de fluxo, Western borrar ou PCR em tempo real. A quantificação da expressão gangliósido através de citometria de fluxo e a sua localização celular através de microscopia pode ser obtido através da utilização de anticorpos anti-gangliósidos com elevada afinidade e especificidade. No entanto, um tratamento adequado de células em suspensão envolve o tratamento de placas de cultura para promover a adesão necessária exigida para a fluorescência ou a aquisição de microscopia confocal. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para determinar GD3 e GD2 expressão gangliósido e co-localização com a TCR durante a ativação de células CD4 + T naïve. Além disso, real-time experiências de PCR utilizando <40.000 células são descritos para a determinação da GD3 e genes da sintase de GM2 / GD2, demonstrando que as experiências de análise genética pode ser realizada com um baixo número de células e, sem a necessidade de kits adicionais baixos de ARN de entrada.
Introduction
As células T CD4 + orquestrar a resposta imune através das suas funções efectoras após activação por apresentação de antigénio de células 1. O estudo dos mecanismos celulares que são modulados durante a activação permite uma visão sobre um processo básico da função imune. No entanto, o estudo de células T CD4 + naive pode ser complicado porque representam uma população muito pequena de células na periferia sangue 2.
Por meio de microscopia de fluorescência vários relatórios estudaram a localização de diferentes moléculas envolvidas na activação de células T CD4 +, principalmente proteínas associadas à membrana plasmática 3. Os gangliósidos são glicosfingolípidos que contém ácido siálico e embora tenham sido extensivamente estudados em células nervosas, onde eles são abundantes, outras células, tais como células do sistema imunológico, também expressam gangliosidos com funções biologicamente relevantes 4,5. Nós relatado anteriormente thaT durante a activação de células T CD4 + naive humanas existe uma regulação positiva do α2,8 sialiltransferase ST8Sia 1 (GD3-sintase) e a sintase GM2 / GD2, que induzem a neoexpression superfície significativa de GD2 e a regulação positiva de gangliósido GD3 6. Um estudo mais aprofundado de GD3, GD2 e outros gangliósidos em células do sistema imunológico é necessária para complementar uma vista parcial à base de proteína de função imunológica.
Geralmente, o estudo da expressão de gangliósido é baseado em técnicas tais como cromatografia em camada fina (TLC) 7, mas esta técnica não permite que a localização espacial de gangliósidos na membrana plasmática ou em compartimentos subcelulares, limitando análise biológica.
Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para a identificação de anticorpos e mediada por localização de GD3 e GD2 gangliósidos em células T CD4 + naive humanas PBMC e depois com anti-CD3 / anti-CD28 de activação. Com este protocolo que ié também possível analisar o gene e a expressão de gangliósidos molecular num baixo número de células em suspensão, com a aquisição de imagens de alta qualidade 6, considerando o tamanho pequeno dos linfócitos (9 jiM).
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Protocol
O sangue periférico de doadores saudáveis do sexo masculino foi obtido com o consentimento informado e aprovação do Comitê de Bioética do Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
1. Isolamento e Activação de células humanas T CD4 + Naive
- Recolhe 2 ml de sangue periférico obtido a partir de dadores humanos saudáveis por meio do consentimento informado e dilui-se com 2 ml de PBS estéril com EDTA (1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Adicionar lentamente o sangue diluído em cima de 3 mL de solução de sacarose com 1,077 densidade como anteriormente descrito 8.
Nota: a migração durante a centrifugação diferencial provocada por diferenças na densidade fará com que os eritrócitos sedimentar completamente e uma camada de células mononucleares menos densas irão formar acima. 2 ml de sangue periférico irá processar cerca de 0,5 X 10 6 células T CD4 + naive após a purificatiem etapas. - Centrifugar 30 min a 250 xg a 21 ° C (rotor utilização para tubos de fundo redondo com ângulo fixo de 30 mm), sem ruptura para gerar o gradiente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Após centrifugação, o PBMC pode ser claramente observado como um anel branco. Recolher as PBMC com uma pipeta e transferir para tubo estéril para lavar roupa.
- Após três lavagens com solução de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min para efectuar a purificação de células T CD4 + naive. métodos de triagem ou vários tipos de kits de purificação estão disponíveis para esta finalidade. De preferência, utilizar> 1 x 10 7 PBMC para a purificação.
- Purifica-se células T CD4 + naive por selecção negativa com esferas magnéticas. Efectuar a selecção negativa com anticorpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A). Avaliar a porcentagem de pureza, determinando células CD4 + CD45RA + através de fbaixo citometria.
Nota: Opcionalmente, proceder a incubação de PBMC durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2 com uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em 10 ml de meio de cultura suplementado para promover a aderência de monócitos e continuar com a purificação de células CD4 + T naive. A recuperação eficiente de células T CD4 + naive a partir de sangue periférico depende em grande parte do sistema de purificação.
- Purifica-se células T CD4 + naive por selecção negativa com esferas magnéticas. Efectuar a selecção negativa com anticorpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A). Avaliar a porcentagem de pureza, determinando células CD4 + CD45RA + através de fbaixo citometria.
- Prepare a placas de 24 cavidades de cultura de células por adição de 250 ul por poço de PBS com anticorpo 5 ug / ml de anti-CD3 monoclonal e incubar durante pelo menos 2 horas a 37 ° C.
Nota: As placas com 96 poços pode ser usado quando um número menor de células T CD4 + naive são utilizados (por exemplo, 2 x 10 4 x 10 -1 5). - Remover o anticorpo anti CD3 diluição do bem ou 24 placas de 96 poços e lava-se as placas duas vezes com PBS estéril 1x.
- Dilui-se as células T CD4 + naive com> 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em avançado meio RPMI 1640 suplementado com 3% de soro fetal de bovino (ou RPMI suplementado com 10% de soro), glutamina 2 mM e antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina).
Nota: Se for necessário localização gangliósido em PBMCs, seguem o mesmo protocolo para a diluição e de estimulação, como descrito abaixo. - Adicionar 500 ul da diluição de células a poços revestidos com anti-CD3 e a poços não revestidos (células de controlo) na placa de 24 poços. Alternativamente, adicionar 100 ul da diluição de células para os poços da placa de 96 poços.
- Conclua as condições de estimulação de células T CD4 + naive em anti CD3 poços revestidos por adição de 1 ug / ml de anticorpo anti CD28.
- Manter as restantes células T CD4 + como de controlo nos poços não-revestidos sem adição de anticorpos anti-CD28. Incubar o repouso e activados de células CD4 + T para 0-72 horas, sob condições padrão de 37 °C e 5% de CO 2.
- Para verificar uma activação adequada avaliar por citometria de fluxo da expressão do CD69 de activação precoce marcador (16 horas pós-activação) ou CD25 marcador de activação tardia (48 h pós-activação) em repouso e activados células ingénuas CD4 + T incubado a 37 ° C e 5% de CO2, na ausência ou na presença de anticorpos anti-CD3 / CD28 9,10.
2. A adesão de repouso e activados células naive CD4 + T
- Esterilizar 12 mm lamínulas redondas por autoclavagem e exposição à luz UV durante pelo menos 15 min.
- lamelas lugar em placas de cultura celular de 24 poços estéreis.
Nota: Para as culturas com menos de 1 x 10 5 células, é preferível utilizar câmaras de deslizamento com pequenas cavidades adaptadas para impedir a dispersão de células da lamela. - lamelas de revestimento (ou câmara de slides) com 200 ul de poli-L-lisina (PM de 150-300 kDa) 0,1% (w / v) de solução e incubar durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar e seco durante pelo menos 1 h à TA.
- Misturar cuidadosamente e recolher o repouso e de células T CD4 + naive activados a partir das placas de 24 poços. Contar as células e se necessário, ajustar com meio suplementado fresco para transferir 1 x 10 5 células para as lamelas revestidas com poli-L-lisina. Incubam-se as células por um período mínimo de 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
3. Recolha e Fixação de repouso e activados células naive CD4 + T
- Remova cuidadosamente o meio de descanso culta e células T CD4 + naïve ativadas.
- Adicionar 500 ul de PBS estéril RT lentamente.
Nota: adição cuidadosa e remoção de soluções a partir de poços impede o desprendimento de células a partir da lamela. - Descartar o PBS e adicionar mais 500 mL PBS para remover completamente os meios de cultura.
- Fixar as células por adição de 500 ul filtrada paraformaldeído a 4% (FILTração remove micropartículas que podem interferir com a análise de microscopia) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (de preferência) ou durante a noite a 4 ° C.
Atenção: O paraformaldeído é um composto tóxico e volátil. Ele é conhecido por ser um carcinogéneo humano. Use com cuidado e com um protocolo de segurança adequado. - Remover o fixador e lava-se, pelo menos, duas vezes com PBS à temperatura ambiente.
- Avance para o próximo passo ou manter os poços da placa com 500 ul de PBS a 4 ° C durante vários dias até que a coloração.
Nota: A esterilidade durante este processo ajuda a evitar o crescimento de microorganismos.
4. Coloração, Montagem e visualização por microscopia confocal
- Remover o PBS dos poços. Adicionar 500 ul de tampão de bloqueio a frio (1x PBS, 0,5% de albumina de soro de bovino de grau padrão, 1% de soro fetal de bovino a pH 7,4). Incubar durante 20 min em gelo.
- Retire o tampão de bloqueio com cuidado e adicionar os anticorpos primários (anti gangliósidos GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),Conjugado com PE anti-CD25 e APC conjugada anti TCR e isotipos controlos diluídos em tampão de bloqueio a 2,5 ug / ml.
- Incubar 2 hr em gelo ou durante a noite a 4 ° C.
Nota: agitação orbital lenta é preferível. - Remover o anticorpo cuidadosamente e lentamente adicionar 500 ul de PBS. Repita duas vezes.
- Adicionar os anticorpos secundários (conjugado com FITC anti IgG3 para R24 anti GD3, Alexa Fluor 488 conjugado com Alexa Fluor 647 ou conjugado anti-IgG2a para anti GD2 14G2a) diluído em tampão de bloqueio a 0,1 ug / ml.
- Incubar durante 1 hora em gelo no escuro, sem tremer.
- Lavar três vezes em PBS como descrito em 4.4). Manter os poços com PBS suficiente para evitar a desidratação de amostras.
- Adicionar Hoechst 333258 mancha diluída em PBS a 0,1 ug / ml.
- Incubar 15 minutos à temperatura ambiente e remover. Lavar três vezes em PBS.
- Colocar as lâminas numa toalha de papel e adicionar 20 ul de solução de montagem (50% de glicerol em PBS) ou solução de montagem comercials para evitar o desbotamento e extinguindo a partir de amostras.
- Com cuidado, pegue a lamela com uma pinça fina e colocá-lo na solução de montagem. Assegurar que o lado da lamela em que as células estão ligados é, em contacto com a solução. Selar as lamelas com unha polonês e analisar usando fluorescência ou microscopia confocal.
5. Isolamento de ARN
- Prepare anticorpo CD3 anti (5 ug / ml) revestidas placas de 96 poços. Incubar 4 x 10 4 células T CD4 + naive / poço em 100 ul de meio de cultura suplementado com anticorpo CD28 anti (1 ug / ml) para completar o estímulo. Incubar a 37 ° C e 5% de CO2 durante 0-72 horas.
- Após diferentes tempos de pós-activação colocar as células para um tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 500 ul de PBS e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA.
- Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de reagente Trizol.
- Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e manter a amostra a -8076; C durante pelo menos 24 h. Prosseguir com o isolamento do RNA quando necessário.
Nota: Partindo da amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 horas melhora o rendimento de ARN. Além disso, o uso de luvas de mão é essencial para evitar a degradação do ARN por RNases. - Descongelar a amostra por incubação a 37 ° C durante 2 minutos num banho de água.
- Adicionar 200 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente à mão durante 30 segundos (para evitar a mistura agressiva de RNA em vórtice). Incubar 5 min à TA.
- Centrifugar 15 min a 12000 xg, a 4 ° C.
- Recuperar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação.
- Adicionar 500 uL de isopropanol e inverter o tubo três vezes.
- Incubar 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugação durante 10 min a 12000 xg, a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante por inversão.
- Adicionar 1 ml de etanol arrefecido em gelo a 75% e centrifugar 10 min a 12000 xg, a 4 ° C.
- Completamente descartar o sobrenadante e o sedimento de ARN secar, deixando a tampa do tubo aberto.
NãoE: Neste ponto o sedimento não é claramente visível. Continuar mesmo assim. - Ressuspender o sedimento em 20 mL de água de grau molecular. Calcula-se a concentração e pureza dos ácidos nucleicos medindo a 260 nm e 280 nm de absorvância utilizando NanoDrop.
- Proceder com cuidado para síntese de ADNc utilizando o kit da transcriptase reversa qualquer convencional e seguindo o protocolo MANUFACTURER'S.
Nota: Aproximadamente 0,5-2 ug de ARN é obtido a partir de 4 x 10 4 células T CD4 + naive. ADNc pode ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN e utilizados em reacções de PCR em tempo real sem a necessidade de jogos de entrada de ARN de baixo.
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Representative Results
O protocolo descrito neste manuscrito torna uma boa qualidade de cultura e de repouso e aderiu células naive humanas activadas T CD4 + (Figura 1). As células T CD4 + activadas mostram o perfil característico proliferativa (Figura 1B), em comparação à condição de repouso (Figura 1A). O marcador de activação CD25 tarde é útil para avaliar a activação eficiente a 72 h observado por microscopia confocal (Figura 1C). O marcador CD69 é actualmente utilizado como marcador de activação precoce por citometria de fluxo ou microscopia. A adesão de repouso e de células T CD4 + naive activados para uma lamela revestida com poli-L-lisina são úteis para estudar a expressão e localização de GD3 e TCR mostrou por uma marcação dupla com anticorpos anti anti TCR (Figura 2) e GD3. Como já relatado anteriormente, a ativação é acompanhado por remodelaçãoing de GD3 e GD2 gangli�idos nas células da superfície 6. Além disso, a quantificação das sintases de GD3 e GM2 / GD2 expressão do gene é realizada a partir de 4 x 10 4 células (Figuras 2 e 3). A expressão neo do gangliósido GD2 e TCR colocalização é adequadamente observados por microscopia confocal, demonstrando um possível papel de GD2 em TCR agrupamento durante a activação (Figura 3). A Figura 4 mostra a localização do gangliósido GD3 e GD2 coradas simultaneamente em células CD4 activadas + células T. Adicionalmente, as PBMC activadas foram coradas com anticorpos anti-anti GD2 que mostram que este protocolo pode ser utilizado em outras populações de células imunitárias encontrados em PMBC, particularmente GD2 que se verificou ser expresso em todos os PMBC activadas (Figura 5) e GD3.
Figura 1: visualização de células T CD4 + naive após aderência e eficiente anti activação CD3 / anti-CD28 (A) células em repouso T CD4 + a 72 hr pós-activação ligado em poli-L-lisina tratada lamela são observados por campo claro. microscopia. (B) Activado células T CD4 + a 72 h ligado em poli-L-lisina tratada lamela. (C) a expressão CD25 marcador (vermelho) e Hoechst 333258 núcleos corados (azul) / anti CD28 células anti CD3 activadas CD4 + T a 72 horas após a ativação. Barra de escala = 50 mm. As imagens foram obtidas por microscopia confocal com um objetivo de petróleo 60x S / 1.3 com zoom digital 2X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: gangliósido GD3 e mancha de TCR e microscopia de localização em repouso e activados células T CD4 + naive em 72 h após a activação de células em repouso T CD4 + com (A) núcleos corados com Hoechst 333258, (B) GD3 localização gangliósido, (. C) fusão de núcleos e gangliósido GD3. As células T CD4 + activadas com (D) núcleos corados com Hoechst 333.258, localização e gangliosídeo (E) GD3 (F) fusão de núcleos e gangliósido GD3. (G) e (H) mostram TCR e gangliósido GD3 descansando células T CD4 + naïve. (J e K) corresponde a TCR e gangliósido GD3 coloração em células T CD4 + activadas. Imagens confocal de TCR (vermelho) e gangliosídeo localização (verde) GD3 em descansando células CD4 + T naive (I) eanti-CD3 / CD28 Activado células T CD4 + naive 72 horas após a activação (G). A mancha GD3, TCR e núcleos foi avaliada por microscopia confocal de uma pilha com uma 60X S / 1.3 Objectivo óleo com zoom digital 2X. (H) O gráfico mostra a expressão do gene para a sintase de GD3 determinada por PCR em tempo real expressa como alteração da dobra a partir de 4 x 10 4 em repouso (de descanso) e células T CD4 + activadas (ACT) sem tratamento prévio a 72 hr pós-activação. Os dados são a média ± SD a partir de três doadores independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: GD2 gangliósido e mancha TCR e localização microscopia em repouso e células T CD4 + naïve activado a 72 h de pós-ativação. + com (A) núcleos corados com Hoechst 333.258, (B) GD2 gangliosídios localização, (C) fusão de núcleos e GD2 gangliosídeo. As células T CD4 + activadas com (D) núcleos corados com Hoechst 333.258, localização e gangliosídeo (E) GD2 (F) fusão de núcleos e GD2 gangliosídeo. (G e H) mostram TCR e GD2 gangliosídios descansando células T CD4 + naïve. (J e K) corresponde a TCR e GD2 gangliósido coloração em células T CD4 + activadas. Imagens confocal de TCR (vermelho) e GD2 gangliosídios localização (verde) em descansando células ingénuas CD4 + T (I) e anti CD3 / CD28 activado células T CD4 + naïve 72 horas de pós-ativação (L). A mancha GD2, TCR e núcleos foi avaliada por microscopia confocal a partir de uma pilha com um60X S / 1.3 Objectivo óleo com zoom digital 2X. (H) O gráfico mostra a expressão do gene para o GM2 / GD2 sintase determinada por PCR em tempo real expressa como alteração da dobra a partir de 4 x 10 4 em repouso (de descanso) e células T CD4 + activadas (ACT) sem tratamento prévio a 72 hr pós-activação. Os dados são a média ± SD a partir de três doadores independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Mancha dupla com anticorpos anti-GD2 e GD3 GD2 para localização gangliósidos GD3 e anti-gangliósido (A) GD3 identificado com o anticorpo anti GD3 R24 em células T CD4 + activadas mostra intracelulares e de membrana de localização. (B) gangliósido GD2 identificado com 14G2um anticorpo anti GD2 nas células T CD4 + activadas só mostra a localização da membrana de plasma. (C) A microscopia de campo claro a partir de células T CD4 + activadas. A mancha GD3 e GD2 foi avaliada por microscopia confocal de uma pilha com uma objectiva de óleo 60X S / 1.3 com zoom digital 2X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. GD3 e GD2 localização gangliósido em PBMCs activados (A) GD2 gangliósido foi detectada com anticorpo 14G2a anti GD2 na CD3 / CD28 72 h activado post sobreposição anti anti PBMC com microscopia de campo claro, (B) GD2 expressão gangliósido e (C ) GD2 gangliósido e núcleos se fundem. (D) ganglios GD3IDE coradas com R24 anti GD3 sobreposição anticorpo com campo claro, (E) GD3 expressão gangliósido e (F) gangliósido GD3 e núcleos se fundem. A mancha GD3, GD2 e núcleos foi avaliada por microscopia confocal de uma pilha com uma 60X S / 1.3 Objectivo óleo com zoom digital 2X. Barra de escala = 45 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito pode ser usado para localizar gangliósidos ou proteínas em suspensões de células de células T CD4 + ou de outras células imunitárias (por exemplo, PMBC, figura 5) a partir de um pequeno número de células. Devido ao tamanho pequeno de células T e as propriedades não-aderentes, a aquisição de imagens microscópicas de fluorescência resulta em informação deficiente ou baixa qualidade, se as células não são correctamente aderida.
Este protocolo combinado com uma análise por microscopia confocal de boa qualidade é uma vantagem chave através da utilização de técnicas tais como cromatografia em camada fina para a detecção de gangliósidos porque revela a localização espacial e a dinâmica de gangliósidos durante o tratamento (por exemplo, activação de células T), levando a aquisição de dados 11,12,13 biologicamente relevante. Além disso, este protocolo permite a avaliação da expressão de gangliósido a partir de um pequeno número de células T CD4 + (2 x 10 4) Que é útil para a optimização do número de repetições ou diferentes ensaios 6.
O tratamento cuidadoso durante a lavagem e coloração de anticorpos após a adesão é crucial para manter a quantidade e integridade celular. Por causa da ligação fraca de células T CD4 + para a lamela, é também muito importante para adicionar e remover cuidadosamente soluções; Caso contrário, uma redução no número de células e aumento detritos fluorescente serão encontrados. Quando avaliado por meio de microscopia confocal, a imunocoloração de gangliosídeos confere informações adicionais, tais como a localização espacial ou co-localização com outras moléculas na membrana plasmática ou compartimentos intracelulares. Localização subcelular requer o uso de marcadores subcelular 14, 15. Além disso, as células T CD4 + fresca e não fixado precisam de ser usados para a coloração para determinar a expressão gangliósido restrita à superfície celular. Embora a fixação de células CD4 + T cells ajuda a preservar a amostra durante pelo menos 5 dias, que transporta o risco de permeabilização e coloração intracelular.
No entanto, por causa da semelhança estrutural entre gangliósidos, é sempre aconselhável para levar em conta a especificidade dos anticorpos utilizados. Vários dos anticorpos monoclonais anti-gangliósido disponíveis comercialmente podem ser usados e para algumas delas a especificidade foi sondado por ELISA, TLC, etc 16,17,18.
Trabalhos anteriores demonstraram que é possível obter informação sobre a localização e a expressão de GD3 e GD2 gangliósidos a partir de 2 x 10 4 células / por condição 6. Além disso, este protocolo descreve a capacidade de realizar experimentos de genes de perfil a partir de 4 x 10 4 células, permitindo a otimização de silenciar experimentos tais como aqueles baseados em partículas lentivirais 6.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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