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Immunology and Infection

सीडी 4 की तैयारी Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54569
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Centro de Investigación en Dinámica Celular, Laboratorio de Glicobiología Humana y Diagnóstico Molecular, Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Summary

हम माइक्रोस्कोपी में उपयोग झिल्ली अभिव्यक्ति और आराम में gangliosides और सक्रिय मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए एक मानक एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन। इसके अलावा वर्णित हैं वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों 40,000 कोशिकाओं है कि अतिरिक्त कम इनपुट शाही सेना किट की आवश्यकता नहीं है का उपयोग कर <।

Abstract

निलंबन में तरीकों भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की सक्रियता के लिए यहाँ बताया और confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए coverslips में उनके पालन, कि पूरक अभिव्यक्ति प्रयोगों की रूपरेखा प्रवाह cytometry जैसे स्थानिक स्थानीयकरण और सीडी 4+ टी सेल सक्रियण में शामिल gangliosides के दृश्य की अनुमति, पश्चिमी सोख्ता या वास्तविक समय पीसीआर। फ्लो और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उनके सेलुलर स्थानीयकरण के माध्यम से ganglioside अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ विरोधी ganglioside एंटीबॉडी के उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। बहरहाल, निलंबन में कोशिकाओं की एक पर्याप्त हैंडलिंग संस्कृति प्लेटों के इलाज के लिए आवश्यक प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के लिए आवश्यक पालन को बढ़ावा देने के लिए शामिल है। इस काम में, हम भोले सीडी 4+ टी सेल सक्रियण के दौरान GD3 और GD2 ganglioside अभिव्यक्ति और TCR के साथ colocalization का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इसके अलावा, वास्तविक टी40,000 कोशिकाओं का उपयोग <IME पीसीआर प्रयोगों GD3 और GM2 / GD2 synthase जीनों के निर्धारण के लिए वर्णित हैं, प्रदर्शन है कि जीन विश्लेषण प्रयोगों कोशिकाओं की कम संख्या के साथ और अतिरिक्त कम इनपुट शाही सेना किट की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है।

Introduction

सीडी 4+ टी कोशिकाओं प्रतिजन कोशिकाओं 1 से सक्रियता के बाद उनकी प्रेरक कार्यों के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आर्केस्ट्रा। सेलुलर तंत्र है कि सक्रियण के दौरान संग्राहक हैं का अध्ययन प्रतिरक्षा समारोह की एक बुनियादी प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है। हालांकि, भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अध्ययन जटिल हो सकता है, क्योंकि वे रक्त परिधि 2 में कोशिकाओं का एक बहुत ही छोटी सी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कई रिपोर्टों अलग सीडी 4+ टी सेल सक्रियण में शामिल अणुओं, मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली से 3 जुड़े प्रोटीन का स्थानीयकरण का अध्ययन किया है। Gangliosides सियालिक एसिड युक्त glycosphingolipids हैं और हालांकि वे बड़े पैमाने पर तंत्रिका कोशिकाओं, जहां वे इस तरह के प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में प्रचुर मात्रा में है, अन्य कोशिकाओं रहे हैं में अध्ययन किया गया है भी जैविक रूप से प्रासंगिक कार्यों 4,5 के साथ gangliosides व्यक्त करते हैं। हम पहले Tha सूचना दीमानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की सक्रियता ST8Sia 1 (GD3 synthase) और GM2 / GD2 synthase sialyltransferase α2,8 की एक अपरेगुलेशन है दौरान टी, कि GD2 के महत्वपूर्ण सतह neoexpression और GD3 ganglioside 6 की upregulation प्रेरित। प्रतिरक्षा कोशिकाओं में GD3, GD2 और अन्य gangliosides के आगे के अध्ययन के लिए एक प्रोटीन आधारित प्रतिरक्षा समारोह का आंशिक दृश्य पूरक करने के लिए आवश्यक है।

आमतौर पर, ganglioside अभिव्यक्ति के अध्ययन में इस तरह पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) 7 के रूप में तकनीक पर आधारित है, लेकिन इस तकनीक प्लाज्मा झिल्ली में या subcellular डिब्बों में gangliosides के स्थानिक स्थानीयकरण अनुमति नहीं है, जैविक विश्लेषण सीमित।

इस काम में, हम विरोधी CD3 / विरोधी CD28 सक्रियता के बाद मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं और PBMCs में एंटीबॉडी की मध्यस्थता की पहचान और GD3 और GD2 gangliosides के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल यह मैं के साथयह भी संभव है उच्च गुणवत्ता के चित्र 6 के अधिग्रहण के साथ निलंबन में कोशिकाओं की कम संख्या में जीन और gangliosides की आणविक अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, लिम्फोसाइटों के छोटे आकार (9 माइक्रोन) पर विचार।

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Protocol

स्वस्थ पुरुष दाताओं से परिधीय रक्त सूचित सहमति और Centro de Investigación एन DINAMICA Celular- Universidad ऑटोनोमा डेल एस्तादो दे मोरेलोस की जैवनैतिकता समिति के अनुमोदन से प्राप्त हुई थी।

1. अलगाव और मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की सक्रियता

  1. परिधीय रक्त सूचित सहमति के माध्यम से स्वस्थ मानव दानदाताओं से प्राप्त की 2 मिलीलीटर लीजिए और बाँझ पीबीएस EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ पतला (1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), 2 मिमी EDTA, 7.4 पीएच)। 1.077 घनत्व के साथ sucrose के समाधान के 3 मिलीलीटर के शीर्ष पर धीरे-धीरे पतला खून जोड़े के रूप में पहले 8 का वर्णन किया।
    नोट: centrifugation के दौरान विभेदक प्रवास घनत्व में मतभेद की वजह से पूरी तरह से एरिथ्रोसाइट्स तलछट के लिए प्रेरित करेगा और कम घने mononuclear कोशिकाओं की एक परत के ऊपर के रूप में होगा। परिधीय रक्त के 2 मिलीलीटर purificati के बाद लगभग 0.5 x 10 6 भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को प्रस्तुत करना होगाकदम पर।
  2. कोई तोड़ने के साथ 21 डिग्री सेल्सियस (30 मिमी निश्चित कोण के साथ दौर नीचे ट्यूब के लिए उपयोग रोटर) पर 250 XG पर अपकेंद्रित्र 30 मिनट परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) की ढाल उत्पन्न करते हैं। centrifugation के बाद, PBMCs स्पष्ट रूप से एक सफेद अंगूठी के रूप में मनाया जा सकता है। एक विंदुक के साथ PBMCs लीजिए और कपड़े धोने के लिए बाँझ ट्यूब को हस्तांतरण।
  3. 10 मिनट के लिए 250 XG पर पीबीएस EDTA समाधान के साथ तीन washes के बाद भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की शुद्धि के लिए आगे बढ़ें। छंटनी तरीकों या शुद्धि किट के कई प्रकार के इस उद्देश्य के लिए उपलब्ध हैं। अधिमानतः, शुद्धि के लिए> 1 10 x 7 PBMCs का उपयोग करें।
    1. चुंबकीय मोतियों के साथ नकारात्मक सेलेक्शन भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को शुद्ध। विरोधी CD45RO, सीडी 8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, विरोधी TCRγ / δ, विरोधी एचएलए डॉ, और CD235a (glycophorin ए) एंटीबॉडी के साथ नकारात्मक चयन प्रदर्शन करना। एफ के माध्यम से सीडी 4 + CD45RA + कोशिकाओं के निर्धारण से पवित्रता का प्रतिशत का आकलनकम cytometry।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% पूरक माध्यम के 10 मिलीलीटर में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व एककेंद्रकश्वेतकोशिका पालन को बढ़ावा देने और भोले सीडी 4+ टी सेल शुद्धि के साथ जारी रखने के लिए के साथ सीओ 2 में रात भर PBMCs के ऊष्मायन के लिए आगे बढ़ें। परिधीय रक्त से भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के कुशल वसूली काफी हद तक शोधन प्रणाली पर निर्भर करता है।
  4. 5 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी CD3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पीबीएस के प्रति अच्छी तरह से 250 μl जोड़कर 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों को तैयार है और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: 96 कुओं के साथ प्लेटों का इस्तेमाल किया जा सकता है जब भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से एक छोटी संख्या में इस्तेमाल किया जाता है (उदाहरण के लिए, 2 X10 4 -1 एक्स 10 5)।
  5. 24 अच्छी तरह से या 96 अच्छी तरह से प्लेटों से विरोधी CD3 एंटीबॉडी कमजोर पड़ने निकालें और प्लेटों दो बार बाँझ 1x पीबीएस का उपयोग कर धो लें।
  6. पवित्रता की> 95% के साथ भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं (CD4 + पतलाCD45RA +) उन्नत RPMI 1640 मध्यम में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व भ्रूण गोजातीय सीरम के 3% के साथ पूरक करने के लिए (या RPMI सीरम का 10%), 2 मिमी glutamine और एंटीबायोटिक दवाओं (1 यू / एमएल पेनिसिलिन, 1 के साथ पूरक माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
    नोट: ganglioside स्थानीयकरण PBMCs में आवश्यक है, के रूप में नीचे वर्णित कमजोर पड़ने और उत्तेजना के लिए एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें।
  7. विरोधी CD3 लेपित कुओं के लिए और 24 अच्छी तरह से थाली में गैर लेपित कुओं (नियंत्रण कोशिकाओं) को सेल कमजोर पड़ने के 500 μl जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए सेल कमजोर पड़ने के 100 μl जोड़ें।
  8. विरोधी CD28 एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़कर विरोधी CD3 लेपित कुओं में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की उत्तेजना की स्थिति को पूरा करें।
  9. विरोधी CD28 एंटीबॉडी के अलावा बिना गैर लेपित कुओं में नियंत्रण के रूप में आराम कर रही सीडी 4+ टी कोशिकाओं रखें। 37 डिग्री के मानक की शर्तों के तहत 72 घंटा 0 के लिए आराम और सक्रिय सीडी 4+ टी सेल सेतेसेल्सियस और 5% सीओ 2।
  10. एक पर्याप्त सक्रियण सत्यापित करने के लिए आराम में CD69 जल्दी सक्रियण मार्कर (16 घंटा के बाद सक्रियण) या CD25 देर सक्रियण मार्कर (48 घंटा के बाद सक्रियण) की अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन और भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated सक्रिय और 5% अभाव या विरोधी CD3 / CD28 एंटीबॉडी 9,10 की उपस्थिति में सीओ 2।

2. आराम की पालन और सक्रिय भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं

  1. कम से कम 15 मिनट के लिए autoclaving और यूवी प्रकाश जोखिम से 12 मिमी दौर coverslips जीवाणुरहित।
  2. बाँझ 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में रखें coverslips।
    नोट: कम से कम 1 x 10 5 कोशिकाओं के साथ संस्कृतियों के लिए यह अनुकूलित छोटे कुओं के साथ स्लाइड कक्षों का उपयोग करने के लिए coverslip में कोशिकाओं के फैलाव को रोकने के लिए बेहतर है।
  3. कोट coverslips पाली एल लाइसिन के 200 μl के साथ (या स्लाइड कक्ष) (मेगावाट 150-300 केडीए) 0.1% (w / v) समाधान और अनुसंधान पर 5 मिनट के लिए सेतेOOM तापमान (आरटी), हटाने और आरटी पर कम से कम 1 घंटे के लिए सूखी।
  4. ध्यान से मिक्स और 24 अच्छी तरह प्लेटें से आराम और सक्रिय भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को इकट्ठा। कोशिकाओं की गणना और यदि आवश्यक हो तो पाली एल Lysine लेपित coverslips के लिए 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं के हस्तांतरण के लिए नए सिरे से पूरक मध्यम के साथ समायोजित करें। 37 ओ सी में 6 घंटा की एक न्यूनतम और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।

3. एकत्रित और आराम की फिक्सेशन और सक्रिय भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं

  1. ध्यान से सुसंस्कृत आराम और सक्रिय भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से मध्यम निकालें।
  2. धीरे-धीरे आरटी बाँझ पीबीएस के 500 μl जोड़ें।
    नोट: कुओं से सावधान अलावा और समाधान के हटाने coverslip से कोशिकाओं की टुकड़ी से बचाता है।
  3. पीबीएस त्यागें और अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया को दूर करने के लिए एक और 500 μl पीबीएस जोड़ें।
  4. 500 μl फ़िल्टर 4% paraformaldehyde के अलावा (FILT द्वारा कोशिकाओं को ठीक करेंराशन microparticles कि माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ) हस्तक्षेप और आरटी (पसंदीदा) या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते कर सकते हैं हटा।
    सावधानी: Paraformaldehyde एक विषैले और अस्थिर यौगिक है। यह एक मानव कैसरजन होने के लिए जाना जाता है। एक उचित सुरक्षा प्रोटोकॉल के साथ सावधानी से प्रयोग करें।
  5. लगानेवाला निकालें और आरटी पर पीबीएस के साथ कम से कम दो बार धोने।
  6. अगले कदम के लिए आगे बढ़ें या धुंधला तक कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के 500 μl के साथ थाली कुओं बनाए रखें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान बाँझपन सूक्ष्मजीव वृद्धि से बचने में मदद करता है।

4. धुंधला, बढ़ते और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य

  1. कुओं से पीबीएस निकालें। ठंड अवरुद्ध बफर के 500 μl जोड़ें (1x पीबीएस, 0.5% मानक ग्रेड गोजातीय सीरम albumin, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम 7.4 पीएच)। बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. अवरुद्ध बफर ध्यान से निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने (एंटी gangliosides GD3 क्लोन R24, GD2 क्लोन 14G2a),पीई संयुग्मित विरोधी CD25 और एपीसी संयुग्मित विरोधी TCR और 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल अवरुद्ध बफर में पतला नियंत्रण isotypes।
  3. बर्फ पर 2 घंटा या रात में 4 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
    नोट: धीरे कक्षीय आंदोलन बेहतर है।
  4. एंटीबॉडी ध्यान से निकालें और पीबीएस के धीरे-धीरे 500 μl जोड़ें। दो बार दोहराएँ।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल अवरुद्ध बफर में पतला (R24 विरोधी GD3, एलेक्सा स्त्राव 14G2a विरोधी GD2 के लिए 488 संयुग्मित या एलेक्सा स्त्राव 647 संयुग्मित विरोधी IgG2a के लिए FITC संयुग्मित विरोधी IgG3) जोड़ें।
  6. झटकों के बिना अंधेरे में बर्फ पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. 4.4 में वर्णित) पीबीएस में तीन बार धोएं। पर्याप्त पीबीएस के साथ कुओं रखें नमूनों की निर्जलीकरण से बचने के लिए।
  8. Hoechst 333,258 दाग 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल पीबीएस में पतला जोड़ें।
  9. आरटी पर 15 मिनट सेते हैं और हटा दें। पीबीएस में तीन बार धोएं।
  10. एक कागज तौलिया पर स्लाइड की जगह और बढ़ते समाधान (पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल) या वाणिज्यिक बढ़ते समाधान के 20 μl जोड़नेएस लुप्त होती और नमूने से शमन से बचने के लिए।
  11. ध्यान से ठीक चिमटी के साथ coverslip उठाओ और बढ़ते समाधान पर जगह है। सुनिश्चित करें कि coverslip जहां कोशिकाओं से जुड़े होते हैं के पक्ष में समाधान के साथ संपर्क में है। नेल पॉलिश के साथ coverslips को सील करने और प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण।

5. शाही सेना के अलगाव

  1. विरोधी CD3 एंटीबॉडी (5 माइक्रोग्राम / एमएल) लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें। प्रोत्साहन पूरा करने के लिए 4 x 10 4 भोले सीडी 4+ टी कुएं में कोशिकाओं / विरोधी CD28 एंटीबॉडी (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक संस्कृति के माध्यम से 100 μl सेते हैं। 0 से 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
  2. अलग पोस्ट-सक्रियण समय के बाद एक microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं की जगह।
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर पीबीएस के 500 μl और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  4. तैरनेवाला निकालें और 1ml Trizol अभिकर्मक जोड़ें।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और कम से नमूना रखने -8076, कम से कम 24 घंटे के लिए सी। जब जरूरत शाही सेना के अलगाव के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: कम से कम 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना छोड़कर शाही सेना उपज में सुधार। इसके अलावा, हाथ के दस्ताने का उपयोग RNases द्वारा आरएनए गिरावट से बचने के लिए आवश्यक है।
  6. एक पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा नमूना defrost।
  7. 200 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ें और 30 सेकंड (vortexing द्वारा शाही सेना के आक्रामक मिश्रण से बचने के लिए) के लिए हाथ से सख्ती से हिला। आरटी पर 5 मिनट सेते हैं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र 15 मिनट।
  9. एक नया microcentrifuge ट्यूब में जलीय चरण की वसूली।
  10. 500 μl isopropanol जोड़ने और ट्यूब तीन बार पलटना।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए आरटी पर 10 मिनट और सेंट्रीफ्यूज सेते हैं।
  12. उलटा द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर बर्फ के ठंडे 75% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  14. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ट्यूब खोलने की टोपी को छोड़ कर शाही सेना गोली सूखी।
    नहींई: इस बिंदु पर गोली स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं है। कोई बात नहीं आगे बढ़ो।
  15. आणविक ग्रेड पानी के 20 μl में गोली Resuspend। NanoDrop का उपयोग कर 260 एनएम और 280 एनएम absorbance को मापने के द्वारा एकाग्रता और न्यूक्लिक एसिड की शुद्धता की गणना।
  16. किसी भी पारंपरिक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का उपयोग और manufacturer's प्रोटोकॉल का पालन करके सीडीएनए के संश्लेषण के लिए सावधानी से आगे बढ़ें।
    नोट: लगभग 0.5-2 माइक्रोग्राम आरएनए 4 एक्स 10 4 भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से प्राप्त की है। सीडीएनए शाही सेना के 100 एनजी से synthetized और कम आरएनए इनपुट किट की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि में वर्णित सुसंस्कृत की एक अच्छी गुणवत्ता और पालन आराम और सक्रिय मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं (चित्रा 1) बना देता है। सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं आराम हालत (चित्रा 1 ए) की तुलना में विशेषता proliferative प्रोफ़ाइल (चित्रा 1 बी) दिखा। CD25 देर सक्रियण मार्कर 72 घंटा confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 सी) द्वारा मनाया पर कुशल सक्रियण मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है। CD69 मार्कर वर्तमान से फ्लो या माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रारंभिक सक्रियण मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है। आराम का पालन और एक coverslip पाली एल लाइसिन साथ लेपित करने के लिए सक्रिय भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं अभिव्यक्ति और GD3 और TCR के स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी विरोधी GD3 और विरोधी TCR एंटीबॉडी (चित्रा 2) के साथ एक डबल लेबलिंग से पता चला रहे हैं। जैसा कि हमने पहले बताया, सक्रियण फिर से तैयार के साथ हैकोशिकाओं में GD3 की आईएनजी और GD2 gangliosides 6 सतह। इसके अतिरिक्त, GD3 और GM2 / GD2 synthases के जीन की अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव 4 एक्स 10 4 कोशिकाओं से किया जाता है (आंकड़े 2 और 3)। GD2 ganglioside और TCR colocalization की नव-अभिव्यक्ति पर्याप्त रूप से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है, एक संभव सक्रियण (चित्रा 3) के दौरान TCR क्लस्टरिंग में GD2 की भूमिका का प्रदर्शन है। चित्रा 4 GD3 और GD2 ganglioside सक्रिय सीडी 4 में एक साथ दाग के स्थानीयकरण से पता चलता है + टी कोशिकाओं। इसके अतिरिक्त, सक्रिय PBMCs विरोधी GD3 और दिखा रहा है कि इस प्रोटोकॉल अन्य प्रतिरक्षा सेल, GD2 PMBCs में पाया विशेष रूप से आबादी सभी सक्रिय PMBCs में व्यक्त किया जा पाया गया है कि (चित्रा 5) में इस्तेमाल किया जा सकता विरोधी GD2 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे।

आकृति 1
चित्रा 1: पालन और कुशल विरोधी CD3 / विरोधी CD28 सक्रियता के बाद भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के दृश्य (ए) आराम सीडी 4+ टी 72 घंटा के बाद सक्रियण पाली एल लाइसिन इलाज किया coverslip पर जुड़ी कोशिकाओं को brightfield द्वारा मनाया जाता है। माइक्रोस्कोपी। (बी) 72 घंटा पाली एल लाइसिन इलाज किया coverslip पर संलग्न पर सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं। (सी) CD25 मार्कर अभिव्यक्ति विरोधी CD3 / विरोधी CD28 सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं के 72 घंटे बाद सक्रियण पर (लाल) और Hoechst 333,258 दाग नाभिक (नीला)। स्केल बार 50 माइक्रोन =। छवियाँ 2X डिजिटल ज़ूम के साथ एक 60x एस / 1.3 तेल उद्देश्य के साथ confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2 चित्रा 2: आराम में GD3 ganglioside और TCR दाग और माइक्रोस्कोपी स्थानीयकरण और साथ (ए) नाभिक Hoechst 333258, (बी) GD3 ganglioside स्थानीयकरण, (साथ दाग 72 घंटे के बाद सक्रियण पर भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को सक्रिय आराम सीडी 4+ टी कोशिकाओं। सी) नाभिक और GD3 ganglioside की मिलाएं। साथ (डी) नाभिक Hoechst 333,258 से सना हुआ सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं (ई) GD3 ganglioside स्थानीयकरण और (एफ) नाभिक और GD3 ganglioside की मिलाएं। (जी) और (एच) शो TCR और भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को आराम में GD3 ganglioside। (जम्मू और कश्मीर) सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं में TCR और GD3 ganglioside धुंधला से मेल खाती है। भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं (आई) के आराम में TCR (लाल) और GD3 ganglioside (हरा) स्थानीयकरण के Confocal छवियों औरविरोधी CD3 / CD28 सक्रिय भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को 72 घंटे बाद सक्रियण (एल)। GD3, TCR और नाभिक दाग एक 60x एस के साथ एक ढेर / 2x डिजिटल ज़ूम के साथ 1.3 तेल उद्देश्य से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। (एम) के ग्राफ वास्तविक समय पीसीआर 4 एक्स 10 4 से गुना परिवर्तन आराम कर (बाकी) और सक्रिय (अधिनियम) भोले सीडी 4+ टी 72 घंटा के बाद सक्रियण पर कोशिकाओं के रूप में व्यक्त द्वारा निर्धारित GD3 synthase के लिए जीन अभिव्यक्ति पता चलता है। डेटा ± तीन स्वतंत्र दाताओं से एसडी मतलब कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: GD2 ganglioside और TCR दाग और आराम में माइक्रोस्कोपी स्थानीयकरण और 72 घंटे के बाद सक्रियण पर सक्रिय भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं। (ए) नाभिक Hoechst 333258 के साथ दाग आराम कर सीडी 4+ टी कोशिकाओं, (बी) GD2 ganglioside स्थानीयकरण, (सी) नाभिक और GD2 ganglioside की मिलाएं। साथ (डी) नाभिक Hoechst 333,258 से सना हुआ सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं (ई) GD2 ganglioside स्थानीयकरण और (एफ) नाभिक और GD2 ganglioside की मिलाएं। (जी और एच) शो TCR और भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को आराम में GD2 ganglioside। (जम्मू और कश्मीर) सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं में TCR और GD2 ganglioside धुंधला से मेल खाती है। भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं (मैं) और विरोधी CD3 आराम में TCR (लाल) और GD2 ganglioside (हरा) स्थानीयकरण के Confocal छवियों / CD28 सक्रिय भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को 72 घंटे बाद सक्रियण (एल)। GD2, TCR और नाभिक दाग एक साथ एक ढेर से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था60X एस / 1.3 2X डिजिटल ज़ूम के साथ तेल उद्देश्य। (एम) के ग्राफ वास्तविक समय पीसीआर 4 एक्स 10 4 से गुना परिवर्तन आराम कर (बाकी) और सक्रिय (अधिनियम) भोले सीडी 4+ टी 72 घंटा के बाद सक्रियण पर कोशिकाओं के रूप में व्यक्त द्वारा निर्धारित GM2 / GD2 synthase के लिए जीन अभिव्यक्ति पता चलता है। डेटा ± तीन स्वतंत्र दाताओं से एसडी मतलब कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। विरोधी GD3 और GD3 और GD2 gangliosides स्थानीयकरण के लिए विरोधी GD2 एंटीबॉडी के साथ डबल दाग (ए) GD3 ganglioside सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं में R24 विरोधी GD3 एंटीबॉडी के साथ पहचान intracellular और झिल्ली स्थानीयकरण से पता चलता है। (बी) GD2 ganglioside 14G2 के साथ की पहचानसक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं में एक विरोधी GD2 एंटीबॉडी केवल प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण से पता चलता है। (सी) सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं से Brightfield माइक्रोस्कोपी। GD3 और GD2 दाग 2X डिजिटल ज़ूम के साथ एक 60x एस / 1.3 तेल उद्देश्य के साथ एक ढेर से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। GD3 और GD2 सक्रिय PBMCs में ganglioside स्थानीयकरण (ए) GD2 ganglioside 14G2a विरोधी GD2 एंटीबॉडी के साथ विरोधी CD3 / विरोधी CD28 72 घंटा के बाद सक्रिय PBMCs brightfield माइक्रोस्कोपी, (बी) GD2 ganglioside अभिव्यक्ति और साथ ओवरले में (सी पाया गया ) GD2 ganglioside और नाभिक विलय। (डी) GD3 gangliosbrightfield साथ R24 विरोधी GD3 एंटीबॉडी ओवरले के साथ दाग आईडीई, (ई) GD3 ganglioside अभिव्यक्ति और (एफ) GD3 ganglioside और नाभिक विलय। GD3, GD2 और नाभिक दाग एक 60x एस के साथ एक ढेर / 2x डिजिटल ज़ूम के साथ 1.3 तेल उद्देश्य से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। स्केल बार = 45 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल सीडी 4+ टी कोशिकाओं या अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, PMBCs, चित्रा 5) कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से शुरू की सेल निलंबन में gangliosides या प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टी कोशिकाओं और गैर पक्षपाती गुण के छोटे आकार की वजह से, यदि कोशिकाओं को सही ढंग से पालन नहीं कर रहे गरीब जानकारी या कम गुणवत्ता में प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियों परिणामों के अधिग्रहण।

एक अच्छी गुणवत्ता confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ संयुक्त यह प्रोटोकॉल क्योंकि यह उपचार के दौरान स्थानिक स्थानीयकरण और gangliosides की गतिशीलता (जैसे, टी सेल सक्रियण) का पता चलता है, के लिए अग्रणी ऐसे gangliosides का पता लगाने के लिए पतली परत क्रोमैटोग्राफी के रूप में तकनीक के इस्तेमाल को लेकर एक महत्वपूर्ण लाभ यह है जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा 11,12,13 के अधिग्रहण। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ganglioside अभिव्यक्ति के मूल्यांकन (सीडी 4+ टी कोशिकाओं की एक छोटी संख्या 2 एक्स 10 4 से शुरू की अनुमति देता है) कि प्रतिकृति या अलग assays 6 की संख्या के अनुकूलन के लिए उपयोगी है।

आसंजन के बाद washes और एंटीबॉडी धुंधला के दौरान सावधान उपचार सेल नंबर और अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि coverslip करने के लिए सीडी 4+ टी कोशिकाओं की कमजोर बाध्यकारी है, यह भी ध्यान से जोड़ने के लिए और समाधान दूर करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है; अन्यथा सेल नंबर और बढ़ फ्लोरोसेंट मलबे में कमी का सामना करना पड़ा हो जाएगा। जब confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन, gangliosides के immunostaining ऐसे स्थानिक स्थानीयकरण या प्लाज्मा झिल्ली या intracellular डिब्बों में अन्य अणुओं के साथ सह स्थानीयकरण के रूप में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। Subcellular स्थानीयकरण subcellular मार्कर 14, 15 के उपयोग की आवश्यकता है। इसके अलावा, ताजा और तय नहीं सीडी 4+ टी कोशिकाओं जब ganglioside अभिव्यक्ति कोशिका की सतह के लिए प्रतिबंधित कर का निर्धारण धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है। हालांकि सीडी 4+ टी सीई का निर्धारणlls कम से कम 5 दिनों के लिए नमूना की रक्षा में मदद करता है, यह permeabilization और intracellular धुंधला की जोखिम रहता है।

हालांकि, gangliosides के बीच संरचनात्मक समानता की वजह से, यह हमेशा उचित खाते में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की विशिष्टता ले रहा है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी ganglioside मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के कई इस्तेमाल किया जा सकता है और उनमें से कुछ के लिए विशिष्टता एलिसा, टीएलसी, आदि 16,17,18 द्वारा जांच की गई है।

पिछले कार्यों दिखाना है कि यह 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं से स्थानीयकरण और GD3 और GD2 gangliosides की अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए / स्थिति 6 प्रति संभव है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल, 4 एक्स 10 4 कोशिकाओं से जीन की रूपरेखा प्रयोगों प्रदर्शन ऐसे lentiviral कणों 6 में आधार के रूप में उन प्रयोगों मुंह बंद करने की अनुमति देता है अनुकूलन की क्षमता का वर्णन है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 12633-012 Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody eBioscience 16-0037-81 OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody ebioscience 16-0288-81 CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody Abcam ab11779 R24 clone
mouse anti human GD2 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53831 14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3
antibody		 Abcam ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse Thermo Fisher Scieni¡tific A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse Thermo Fisher Scieni¡tific A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405
 Ficoll Paque-Plus GE 17-1440-02 
Trizol Reagent Invitrogen 15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human MACS Miltenyi Biotec 130-094-131
BD FACSAria II BD Biosciences Sorting 
Nunc Lab-tek chamber slide system Sigma-Aldrich C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)  Olympus Upright BX61WI and IX81 
Forward sequence primer GD3 synthase 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ Ref. 7

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References

  1. Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
  2. Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
  3. Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
  4. Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
  5. Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
  6. Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
  7. Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
  8. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  9. O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
  10. Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
  11. Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
  12. Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
  13. Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
  14. Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
  15. Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
  16. Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
  17. Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
  18. Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).

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इम्यूनोलॉजी अंक 117 मानव सीडी 4+ टी सेल सक्रियण एंटीबॉडी gangliosides TCR स्थानीयकरण confocal माइक्रोस्कोपी पालन
सीडी 4 की तैयारी<sup&gt; +</sup&gt; माइक्रोस्कोपी द्वारा GD3 और GD2 ganglioside झिल्ली अभिव्यक्ति का विश्लेषण के लिए टी कोशिकाओं
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Villanueva-Cabello, T. M., Martinez-Duncker, I. Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54569, doi:10.3791/54569 (2016).

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