Summary
Vi beskriver en standardantikroppsfärgningsprotokollet för användning i mikroskopi för att bestämma membran uttryck och lokalisering av gangliosider i vilande och aktiverade humana naiva CD4 + T-celler. Också beskrivet är realtids-PCR experiment med <40.000 celler som inte kräver ytterligare låga ingångs RNA kit.
Abstract
De metoder som beskrivs häri för aktivering av naiva CD4 + T-celler i suspension och deras vidhäftning på täck för konfokalmikroskopi analys tillåter den rumsliga lokalisering och visualisering av gangliosider är inblandade i CD4 + T-cellsaktivering, som kompletterar uttryck profilering experiment såsom flödescytometri, västra blotting eller realtids-PCR. Kvantifieringen av gangliosid uttryck genom flödescytometri och deras cellulär lokalisering genom mikroskopi, kan erhållas genom användning av anti-gangliosid-antikroppar med hög affinitet och specificitet. Trots en adekvat hantering av celler i suspension innefattar behandling av odlingsplattor för att främja den nödvändiga vidhäftningen krävs för fluorescens eller konfokalmikroskopi förvärv. I detta arbete, beskriver vi ett protokoll för att bestämma GD3 och GD2-gangliosid uttryck och samlokalisering med TCR under naiva cellsaktivering CD4 + T. Även real-tIME PCR-experiment med <40.000 celler beskrivs för bestämning av GD3 och GM2 / GD2 syntas-gener, vilket visar att genanalys experiment kan utföras med ett lågt antal celler och utan behov av ytterligare låga ingångs RNA kit.
Introduction
CD4 + T-celler orchestrate immunsvaret genom deras effektorfunktioner efter aktivering av antigenpresenterande celler 1. Studien av de cellulära mekanismer som moduleras under aktiveringen kan inblick i en grundläggande process för immunförsvaret. Däremot kan studiet av naiva CD4 + T-celler vara komplicerat eftersom de representerar en mycket liten population av celler i blodet periferi två.
Genom fluorescensmikroskopi flera rapporter har studerat lokaliseringen av olika molekyler som är involverade i CD4 + T-cellsaktivering, främst proteiner associerade till plasmamembranet 3. Gangliosiderna är sialinsyra innehållande glykosfingolipider och även om de har studerats ingående i nervceller där de är riklig, andra celler som immunceller också uttrycka gangliosider med biologiskt relevanta funktioner 4,5. Vi rapporterade tidigare that under aktivering av humana naiva CD4 + T-celler föreligger en uppreglering av α2,8 sialyltransferas ST8Sia 1 (GD3-syntas) och GM2 / GD2-syntas, som inducerar den signifikanta ytan neoexpression av GD2 och uppregleringen av GD3 gangliosid 6. Ytterligare studier av GD3, GD2 och andra gangliosider i immunceller är nödvändiga för att komplettera en proteinbaserad ofullständig bild av immunfunktion.
Vanligen, är studien av gangliosid uttryck baserat på tekniker såsom tunnskiktskromatografi (TLC) 7, men denna teknik tillåter inte den rumsliga lokalisering av gangliosider vid plasmamembranet eller i subcellulära fack, vilket begränsar den biologiska analys.
I detta arbete, beskriver vi ett protokoll för antikroppsmedierade identifiering och lokalisering av GD3 och GD2 gangliosider i humana naiva CD4 + T-celler och PBMC efter anti-CD3 / anti-CD28-aktivering. Med detta protokoll det jagär också möjligt att analysera genen och molekylär uttryck av gangliosider i ett litet antal celler i suspension, med förvärv av högkvalitativa bilder kvalitet 6, med tanke på den lilla storleken av lymfocyter (9 pm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifert blod från friska manliga donatorer erhölls med informerat samtycke och godkännande av bioetiska kommitté Centro de Investigación en Dinamica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
1. Isolering och aktivering av humana naiva CD4 + T-celler
- Samla in 2 ml perifert blod härledda från friska humana givare genom informerat samtycke och späd med 2 ml steril PBS-EDTA (1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Lägga det utspädda blodet långsamt på toppen av 3 ml sackaroslösning med 1,077 densitet såsom tidigare beskrivits 8.
Obs: Differential migration under centrifugering på grund av skillnader i densitet kommer att orsaka erytrocyter att sedimentera fullständigt och ett skikt av mindre täta mononukleära celler bildas ovan. 2 ml av perifert blod kommer att göra ungefär 0,5 x 10 6 naiva CD4 + T-celler efter purificatipå stegen. - Centrifugera 30 min vid 250 xg vid 21 ° C (använd rötor för rundbottnade rör med fast vinkel av 30 mm) utan avbrott för att generera gradienten av perifera mononukleära blodceller (PBMC). Efter centrifugering kan den PBMCs vara tydligt observeras som en vit ring. Samla PBMC med en pipett och överföra till sterilt rör för tvätt.
- Efter tre tvättar med PBS-EDTA-lösning vid 250 xg under 10 min vidare till rening av naiva CD4 + T-celler. Sorteringsmetoder eller flera typer av reningssatser finns tillgängliga för detta ändamål. Företrädesvis använder> 1 x 10 7 PBMC för rening.
- Rena naiva CD4 + T-celler genom negativ selektion med magnetiska pärlor. Utför negativt urval med anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, och CD235a (glykoforin A) antikroppar. Bedöma hur stor procentandel av renhet genom att bestämma CD4 + CD45RA + celler genom flåg cytometri.
Notera: Valfritt, fortsätt till inkubation av PBMC över natten vid 37 ° C och 5% CO2 med en densitet av 1 x 10 6 celler / ml i 10 ml kompletterat medium för att främja monocytvidhäftning och fortsätta med naiva CD4 + T-cell rening. Den effektiv återvinning av naiva CD4 + T-celler från perifert blod som krävs beror till stor del på den reningssystem.
- Rena naiva CD4 + T-celler genom negativ selektion med magnetiska pärlor. Utför negativt urval med anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, och CD235a (glykoforin A) antikroppar. Bedöma hur stor procentandel av renhet genom att bestämma CD4 + CD45RA + celler genom flåg cytometri.
- Förbered 24-brunnars cellodlingsplattor genom tillsats av 250 | j, l per brunn av PBS med 5 | j, g / ml anti CD3 monoklonal antikropp och inkubera under åtminstone 2 h vid 37 ° C.
Notera: Plattor med 96 brunnar kan användas när ett mindre antal från naiva CD4 + T-celler används (t.ex., 2 x10 4 -1 x 10 5). - Avlägsna anti CD3-antikropp utspädning från 24 bra eller 96 brunnar och tvätta plattorna två gånger med steril 1x PBS.
- Späd de naiva CD4 + T-celler med> 95% renhet (CD4 +CD45RA +) till en densitet av 1 x 10 6 celler / ml i avancerad RPMI 1640-medium kompletterat med 3% fetalt bovint serum (eller RPMI kompletterat med 10% av serum), 2 mM glutamin och antibiotika (1 U / ml penicillin, 1 | ig / ml streptomycin).
Obs: Om gangliosid lokalisering erfordras i PBMC, följer samma protokoll för utspädning och stimulering såsom beskrivs nedan. - Tillsätt 500 pl av cell utspädning till anti CD3-belagda brunnar och till icke-belagda brunnar (kontrollceller) i 24 brunnsplatta. Alternativt, tillsätt 100 | il av cellspädning till brunnarna i 96-brunnsplatta.
- Slutföra stimuleringsförhållanden naiva CD4 + T-celler i anti CD3-belagda brunnar genom att tillsätta 1 | j, g / ml av anti CD28-antikropp.
- Håll vilande CD4 + T-celler som kontroll i de icke-belagda brunnar utan tillsats av anti CD28 antikroppar. Inkubera vilande och aktiverade CD4 + T-cell för 0 till 72 timmar under standardförhållanden 37 °C och 5% CO2.
- För att kontrollera en adekvat aktivering utvärdera genom flödescytometri uttrycket av CD69 tidiga aktiveringsmarkören (16 h efter aktivering) eller CD25 sent aktiveringsmarkör (48 h efter aktivering) i vilande och aktiverade naiva CD4 + -T-celler inkuberade vid 37 ° C och 5% CO2 i frånvaro eller närvaro av anti CD3 / CD28-antikroppar 9,10.
2. Vidhäftning av vilande och aktiverade Naiv CD4 + T-celler
- Sterilisera 12 mm runda täck genom autoklavering och UV-ljusexponering under minst 15 minuter.
- Place täckglas i sterila 24-brunnars cellodlingsplattor.
Obs! Kulturer med mindre än 1 x 10 5 celler är det att föredra att använda glid kammare med anpassade små brunnar för att förhindra spridning av celler i täck. - Coat täckglas (eller glidkammar) med 200 pl av poly-L-lysin (MW 150-300 KDa) 0,1% (vikt / volym) lösning och inkubera under 5 min vid room temperatur (RT), ta bort och torka i minst 1 h vid RT.
- Blanda noggrant och samla det vilande och aktiverade naiva CD4 + T-celler från de 24-brunnsplattor. Räkna celler och vid behov justera med färskt kompletterat medium för att överföra 1 x 10 5 celler till poly-L-lysin belagda täck. Inkubera cellerna under ett minimum av 6 h vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Insamling och Fixering av vilande och aktiverade Naiv CD4 + T-celler
- Försiktigt bort mediet från odlade vilande och aktiverade naiva CD4 + T-celler.
- Tillsätt 500 l av RT steril PBS långsamt.
Notera: Försiktig tillsats och avlägsnande av lösningar från brunnar förhindrar lösgörande av celler från täckglas. - Kasta PBS och lägga till ytterligare 500 l PBS att grundligt avlägsna odlingsmedia.
- Fixera cellerna genom tillsats av 500 pl filtrerat 4% paraformaldehyd (filtranson avlägsnar mikropartiklar som kan störa mikroskopi analys) och inkubera under 30 min vid RT (föredraget) eller över natten vid 4 ° C.
Varning: Paraformaldehyd är en giftig och flyktig förening. Det är känt för att vara en mänsklig carcinogen. Använd försiktigt med ett lämpligt säkerhetsprotokollet. - Ta bort fixerings och tvätta minst två gånger med PBS vid RT.
- Gå vidare till nästa steg eller bibehålla de plattbrunnarna med 500 fil av PBS vid 4 ° C under flera dagar tills färgning.
Obs: sterilitet under denna process hjälper till att undvika tillväxt av mikroorganismer.
4. Färgning, Montering och visualisering av konfokalmikroskopi
- Ta bort PBS från brunnarna. Tillsätt 500 | il kall blockeringsbuffert (1 x PBS, 0,5% standardkvalitet bovint serumalbumin, 1% fetalt bovint serum, pH 7,4). Inkubera under 20 min på is.
- Avlägsna den blockerande bufferten försiktigt och tillsätt primära antikroppar (anti gangliosider GD3 klon R24, GD2 klon 14G2a)PE-konjugerat anti CD25 och APC-konjugerat anti TCR och isotyperna kontroller utspädda i blockerande buffert till 2,5 mikrogram / ml.
- Inkubera 2 h på is eller över natten vid 4 ° C.
Obs: Långsam orbital agitation är att föredra. - Ta bort antikroppen noggrant och tillsätt långsamt 500 pl PBS. Upprepa två gånger.
- Tillsätt sekundära antikroppar (FITC konjugerat anti IgG3 för R24 anti GD3, Alexa Fluor 488-konjugerad eller Alexa Fluor 647-konjugerad anti IgG2a för 14G2a anti GD2) utspätt i blockerande buffert till 0,1 mikrogram / ml.
- Inkubera under en timme på is i mörker utan skakning.
- Tvätta tre gånger i PBS såsom beskrivits i 4,4). Hålla brunnarna med tillräckligt PBS för att undvika uttorkning av prover.
- Lägga Hoechst 333258 fläck utspädd i PBS till 0,1 | j, g / ml.
- Inkubera 15 min vid RT och ta bort. Tvätta tre gånger i PBS.
- Placera objektglasen på en pappershandduk och tillsätt 20 | il av monteringslösning (50% glycerol i PBS) eller kommersiell monteringslösnings för att undvika blekning och störtkylning från prover.
- plocka försiktigt upp täck med fina pincett och placera den på monteringslösning. Se till att den sida av täckglas där celler är bundna är i kontakt med lösningen. Täta täck med nagellack och analysera med hjälp av fluorescens eller konfokalmikroskopi.
5. Isolering av RNA
- Förbered anti CD3-antikropp (5 mikrogram / ml) belagda 96-brunnsplattor. Inkubera 4 x 10 4 naiva CD4 + T-celler / brunn i 100 ^ kompletterat odlingsmedium med anti CD28-antikropp (1 | ig / ml) för att slutföra stimulus. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 0-72 timmar.
- Efter olika post-aktiveringstider placera cellerna i ett mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 500 pl av PBS och centrifugera vid 250 xg under 5 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml Trizol reagens.
- Inkubera under 5 min vid RT och hålla provet vid -8076; C under åtminstone 24 timmar. Fortsätt med RNA isolering när det behövs.
Obs: Lämna provet vid -80 ° C under minst 24 timmar förbättrar RNA avkastning. Dessutom är det viktigt att undvika RNA nedbrytning av RNaser användning av handen handskar. - Avfrosta provet genom inkubation vid 37 ° C under 2 min i ett vattenbad.
- Tillsätt 200 pl kloroform och skaka kraftigt för hand under 30 sek (för att undvika aggressiv blandning av RNA genom att vortexa). Inkubera 5 min vid RT.
- Centrifugera 15 min vid 12000 xg vid 4 ° C.
- Återvinna den vattenbaserade fasen till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 500 l isopropanol och invertera röret tre gånger.
- Inkubera 10 min vid RT och centrifugera i 10 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten genom inversion.
- Tillsätt 1 ml iskall 75% etanol och centrifugera 10 min vid 12000 xg vid 4 ° C.
- Helt kassera supernatanten och torka RNA-pelleten genom att lämna locket på röret öppen.
Intee: På denna punkt är pelleten inte väl synlig. Fortsätt ändå. - Återsuspendera pelleten i 20 pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten. Beräkna koncentrationen och renheten av nukleinsyror genom mätning av 260 nm och 280 nm absorbans med användning av Nanodrop.
- Gå försiktigt till syntes av cDNA med hjälp av någon konventionell omvänt transkriptas kit och efter tillverkares protokoll.
Notera: Cirka 0,5-2 | j, g RNA erhålles från 4 x 10 4 naiva CD4 + T-celler. cDNA kan syntetiseras från 100 ng av RNA och användes i realtids-PCR-reaktioner utan behov av låg RNA ingångs kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivet i detta manuskript gör en god kvalitet på odlade och vidhäftas vilande och aktiverade humana naiva CD4 + -T-celler (Figur 1). De aktiverade CD4 + T-celler uppvisar den karakteristiska proliferativ profilen (Figur 1B) i jämförelse med vilotillståndet (Figur 1A). CD25 sena aktiveringsmarkör är lämpligt att utvärdera effektiv aktivering på 72 timmar observerades konfokalmikroskopi (figur 1C). CD69 markören för närvarande används som tidig aktivering markör genom flödescytometri eller mikroskopi. Vidhäftning av vilande och aktiverade naiva CD4 + -T-celler till ett täckglas belagda med poly-L-lysin är användbara för att studera expression och lokalisering av GD3 och TCR visade av en dubbel märkning med anti GD3 och anti TCR-antikroppar (Figur 2). Som vi tidigare rapporterat, är aktivering åtföljs av ombyggnadsnings av GD3 och GD2 gangliosider i cellerna ytan 6. Dessutom är genuttryck kvantifiering av GD3 och GM2 / GD2 syntaser utföras från 4 x 10 4-celler (figur 2 och 3). Den neo-expression av GD2-gangliosid och TCR colocalization är tillräckligt observeras av konfokalmikroskopi, visar en möjlig roll GD2 i TCR kluster under aktivering (Figur 3). Figur 4 visar lokaliseringen av GD3 och GD2 gangliosid färgas samtidigt i aktiverade CD4 + T-celler. Dessutom aktiverades PBMC färgades med anti GD3 och anti GD2 antikroppar visar att detta protokoll kan användas i andra immuncellpopulationer som finns i PMBCs, särskilt GD2 som befanns uttryckas i alla aktiverade PMBCs (Figur 5).
Figur 1: Visualisering av naiva CD4 + -T-celler efter vidhäftning och effektiv anti CD3 / anti-CD28-aktivering (A) Vilande CD4 + T-celler vid 72 h efter aktivering fäst på poly-L-lysin behandlas täckglas observeras genom bright. mikroskopi. (B) Aktiverad CD4 + T-celler vid 72 h fäst på poly-L-lysin behandlas täckglas. (C) CD25 markör uttryck (röd) och Hoechst 333258 färgade kärnor (blå) av anti CD3 / anti CD28 aktiverade CD4 + -T-celler vid 72 h efter aktivering. Skalstreck = 50 | im. Bilder erhölls genom konfokalmikroskopi med en 60X S / 1,3 oljeobjektiv med 2X digital zoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: GD3 gangliosid och TCR fläcken och mikroskopi lokalisering i vilande och aktiverade naiva CD4 + T-celler vid 72 timmar efter aktivering Resting CD4 + T-celler med (A) kärnor färgades med Hoechst 333258, (B) GD3 gangliosid lokalisering, (. C) Sammanfoga av kärnor och GD3 gangliosid. Aktiverade CD4 + T-celler med (D) kärnor färgades med Hoechst 333258, (E) GD3 gangliosid lokaliseringen och (F) Merge av kärnor och GD3-gangliosid. (G) och (H) visar TCR och GD3 gangliosid i vilande naiva CD4 + T-celler. (J och K) motsvarar TCR och GD3 gangliosid färgning i aktiverade CD4 + T-celler. Konfokala bilder av TCR (röd) och GD3 gangliosid (grön) lokalisering i vilande naiva CD4 + T-celler (I) ochanti CD3 / CD28 Aktiverad naiva CD4 + T-celler 72 h efter aktivering (L). GD3, TCR och kärnor fläck bedömdes genom konfokalmikroskopi från en stapel med en 60X S / 1,3 oljeobjektiv med 2X digital zoom. (M) Grafen visar genuttrycket för GD3-syntas bestämdes genom realtids-PCR uttryckt som Fold förändring från 4 x 10 4 vilar (vila) och aktiverade (ACT) naiva CD4 + T-celler vid 72 h efter aktivering. Data är medelvärde ± SD från tre oberoende givare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: GD2-gangliosid och TCR fläcken och mikroskopi lokalisering i vilande och aktiverade naiva CD4 + T-celler vid 72 h post-aktivering. + T-celler med (A) kärnor färgades med Hoechst 333.258, (B) GD2 gangliosid lokalisering, (C) sammanslagning av kärnor och GD2-gangliosid. Aktiverade CD4 + T-celler med (D) kärnor färgades med Hoechst 333258, (E) GD2-gangliosid lokaliseringen och (F) Merge av kärnor och GD2-gangliosid. (G och H) show TCR och GD2-gangliosid i vilande naiva CD4 + T-celler. (J och K) motsvarar TCR och GD2-gangliosid-färgning i aktiverade CD4 + T-celler. Konfokala bilder av TCR (röd) och GD2-gangliosid (grön) lokalisering i vilande naiva CD4 + T-celler (I) och anti CD3 / CD28 Aktiverad naiva CD4 + T-celler 72 h efter aktivering (L). Den GD2, TCR och kärnor fläck bedömdes genom konfokalmikroskopi från en stapel med en60X S / 1,3 oljeobjektiv med 2X digital zoom. (M) Grafen visar genuttrycket för GM2 / GD2 syntas bestämdes genom realtids-PCR uttryckt som Fold förändring från 4 x 10 4 vilar (vila) och aktiverade (ACT) naiva CD4 + T-celler vid 72 h efter aktivering. Data är medelvärde ± SD från tre oberoende givare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Dubbel fläcken med anti-GD3 och anti-GD2 antikroppar för GD3 och GD2 gangliosider lokalisering (A) GD3 gangliosid som identifieras med R24 anti GD3-antikropp i aktiverade CD4 + T-celler visar intracellulära och membranlokalisering. (B) GD2 gangliosid identifieras med 14G2en anti GD2-antikropp i aktiverade CD4 + T-celler visar bara plasmamembranlokalisering. (C) Brightfield microscopy från aktiverade CD4 + T-celler. GD3 och GD2 fläck bedömdes genom konfokalmikroskopi från en stapel med en 60X S / 1,3 oljeobjektiv med 2X digital zoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. GD3 och GD2-gangliosid lokalisering i aktiverade PBMC (A) GD2-gangliosid detekterades med 14G2a anti GD2-antikropp i anti CD3 / anti CD28 72 timmar efter aktiverade PBMC överlagring med bright mikroskopi, (B) GD2-gangliosid-expression och (C ) GD2-gangliosid och kärnor samman. (D) GD3 gangliosIDE färgas med R24 anti GD3 antikropp overlay med ljusfält, (E) GD3 gangliosid uttryck och (F) GD3 gangliosid och kärnor samman. GD3, GD2 och kärnor fläck bedömdes genom konfokalmikroskopi från en stapel med en 60X S / 1,3 oljeobjektiv med 2X digital zoom. Skala bar = 45 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet kan användas för att lokalisera gangliosider eller proteiner i cellsuspensioner av CD4 + T-celler eller andra immunceller (t.ex. PMBCs, Figur 5) med start från ett litet antal celler. På grund av den lilla storleken på T-celler och icke-vidhäftande egenskaper, förvärv av fluorescens mikroskopiska bilder resulterar i dålig information eller låg kvalitet om cellerna inte korrekt följs.
Detta protokoll i kombination med en god kvalitet konfokalmikroskopi analys är en viktig fördel jämfört med användningen av tekniker såsom tunnskiktskromatografi för detektering av gangliosider, därför att den avslöjar den spatiala lokaliseringen och dynamiken av gangliosider under behandlingen (t.ex., T-cellaktivering), vilket leder till förvärv av biologiskt relevanta uppgifter 11,12,13. Även detta protokoll möjliggör utvärdering av gangliosid uttryck utgående från ett litet antal CD4 + T-celler (2 x 10 4) Som är användbar för att optimera antalet replikat eller olika analyser 6.
Den noggranna behandling under tvättar och antikroppar färgning efter vidhäftning är avgörande för att upprätthålla mobilnummer och integritet. På grund av den svaga bindningen av CD4 + T-celler till täckglaset, är det också mycket viktigt att noggrant lägga till och ta bort lösningar; annars en minskning av antalet celler och ökad fluorescerande skräp kommer att påträffas. När bedömas genom konfokalmikroskopi, immunfärgning av gangliosider ger ytterligare information såsom spatial lokalisering eller samlokalisering med andra molekyler i plasmamembranet eller intracellulära fack. Subcellulära lokalisering kräver användning av subcellulära markörer 14, 15. Dessutom färska och inte fast CD4 + T-celler måste användas för färgning vid bestämning gangliosid expression begränsad till cellytan. Även fixering av CD4 + T-cells hjälper till att bevara provet under minst 5 dagar, det innebär risk för permeabilisering och intracellulär färgning.
Men på grund av den strukturella likheten mellan gangliosider, är det alltid klokt att ta hänsyn till den särskilda karaktären hos antikroppar som används. Flera av de kommersiellt tillgängliga anti-gangliosid monoklonala antikroppar kan användas och för några av dem specificiteten har sonderades med ELISA, TLC, etc. 16,17,18.
Tidigare arbeten visar att det är möjligt att få information om lokalisering och uttryck av GD3 och GD2 gangliosider från 2 x 10 4 celler / per villkor 6. Dessutom beskriver detta protokoll förmågan att utföra gen profilering experiment från 4 x 10 4 celler, vilket möjliggör optimering av tysta experiment såsom de som är baserade i Lentiviral partiklar 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
