Protocol
1. verwerkbaar PANI Synthesis
- Oplossen aniline (1 ml, 11 mmol) volledig in 60 ml chloroform in een 250 ml rondbodemkolf. Roeren bij 600 rpm gedurende 5 minuten en koel af tot 0-5 ° C met ijs. Dit duurt meestal 15-20 min (Figuur 2A).
- Voeg natriumdodecylbenzeensulfonaat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) aan de aniline oplossing in een rondbodemkolf onder roeren bij 600 rpm.
- Ontbinden ammoniumpersulfaat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) in 20 ml water en voeg dit alles druppelsgewijs gedurende 30 min om te voorkomen dat oververhitting van de reactie.
- Het uitvoeren van de reactie bij 0-5 ° C gedurende 24 uur, en laat het op kamertemperatuur komen voor nog eens 24 uur.
- Observeer het reactiemengsel aanvankelijk melkwit worden na 15 min, vervolgens donkerbruin na 2 uur, en uiteindelijk tot donkergroen na 24 uur (Figuur 2B-F).
- Filter de PANI-NaDBS oplossing met een Buchner trechter. Meng met 80 ml chloroform en 120 ml water in alseparation trechter (figuur 2G).
- Incubeer de oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur en laat het donkergroene PANI de scheitrechter, waardoor ongereageerd NaDBS en APS in het waterige supernatant.
2. PANI-probe Mengen en UV-straling
- PANI verdunde oplossing 10x met chloroform-water (1: 3 v / v) en meng 200 pl verdund PANI met 6,4 pmol probe-DNA-oligonucleotiden door zachte schommelen gedurende 15 min in een microfugebuis.
- Bestraal het PANI-DNA-oplossing met 1200 uJ / cm2 UV in een crosslinker gedurende 2 min. Het is essentieel dat UV-blootstelling is beperkt tot de aangegeven hoeveelheid. Langdurige blootstelling aan UV compromissen de fluorescentieverandering van PANI waarschijnlijk door covalente verknoping van PANI en DNA.
- Pellet complexen door centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 6 min, en wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pellet opnieuw, en opnieuw te schorten in PBS.
3. Hybridization van PANI-probe
- Voeg 8 pi van 100 pM complementaire DNA-oligonucleotiden of doelnucleïnezuren aan 200 gl PANI-probe-complexen.
- Uitvoeren hybridisatie door tuimelen oplossing mengsel gedurende 15 minuten bij 40 ° C.
- Pellet de PANI complexen door centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 6 min. Was met PBS en resuspendeer in water.
4. Emissie Steady State Fluorescence Measurement
- Voeg PANI van verschillende behandelingen in een 96 well microplaat en meet emissie fluorescentie in het 270-850 nm door excitatie bij 250 nm. Een emissie piek voor PANI moet worden opgemerkt ongeveer 500 nm.
5. fluorescentiemicroscopie Meting gehybridiseerde Duplex
- Drop laag PANI op een borosilicaat glazen dekglaasje en droog bij 40 ° C gedurende 48 uur.
- Sonde (8 pi van 100 pM) toe te voegen op een gedroogde PANI film en bestralen met UV-licht (1200 uJ / cm2
- Was de PANI-probe film met PBS en droog bij 40 ° C gedurende 48 uur.
- Voeren hybridisatie gedurende 15 minuten door toevoeging van doelnucleïnezuren. Dit kan een biologisch monster of controle beoogd oligonucleotide (8 ui 100 uM) zijn. Volg met een PBS wassen.
- Het verkrijgen van de fluorescerende beelden met 40x vergroting, met een 500 nm lange pass filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2A vangt de reactie opstart bij aanvang van de polymerisatie, dat wil zeggen, voor APS toevoeging. Micelvorming is de eerste stap in het reactieproces PANI-synthese optreedt bij micellaire interface. Figuur 2B toont een melkachtige oplossing na 5 min. 30 min na APS toegevoegd het reactiemengsel wordt een licht bruine kleur. Figuur 2C toont de kleurverandering geassocieerd met de vorming van oligomeren. Figuur 2D toont een donkerbruine kleur na 4 uur, hetgeen een hoge concentratie kortketenige PANI overeenstemming met een zeer trage reactie. Eindelijk na 48 uur een donkergroene oplossing van hoogmoleculaire PANI molecuulgewicht kan worden dat is gedispergeerd in chloroform-water (Figuur 2E). Figuur 2F toont een goed gedispergeerde, homogene oplossing PANI in de scheitrechter zonder fasescheiding.
(figuur 2) of op het oppervlak van druppel-beklede films (figuur 3). De basale fluorescentie van PANI films relatief laag (Figuur 3A). Probe-DNA wordt toegevoegd over de film en men liet drogen bij kamertemperatuur. Wanneer de verwachte DNA-PANI complexe vormen, een intense toename in fluorescentie kan worden waargenomen (Figuur 3B). Electron instroom van het negatief geladen DNA veroorzaakt hogere elektronendichtheid in PANI moleculen, waardoor de fluorescentie verhogen. Na de hybridisatie geïnduceerde dissociatie van het probe-target duplex, PANI fluorescentie terug naar basale intensiteit (Figuur 3C). Dissociatie wordt veroorzaakt door veranderingen in de DNA-hoofdketen na hybridisatie dit compromis PANI-probe interactie. Sensing nucleïnezuren met deze technologie kan ook direct worden uitgevoerd in emulsie (Figuur 3D). Een voordeel van het gebruik van de emulsie gebaseerde systeem is compatibel met plaat lezer instrumenten. Dit maakt een zeer nauwkeurige meting van PANI fluorescentie, en voorkomt problemen als gevolg van onregelmatigheden in de film coating. Een PANI-gebaseerde sensor in emulsie formaat is zeer specifiek. De invoering van een mismatch (mm) in het doel oligo nalaat PANI basale fluorescentie (Figuur 3D) te herstellen.
Figuur 1. Bevestiging van probes veroorzaakt door UV-straling verhoogt PANI fluorescentie. Hybridisatie van doelnucleïnezuren resultaten in onthechting van PANI, en de terugkeer van het polymeer aan basale fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Figuur 2. Synthese van de te verwerken PANI. (A) Opening polymerisatiereactie. (B) Na 5 minuten bij APS langzaam wordt toegevoegd. (C) 30 minuten na toevoeging APS. (D) na 1 uur. (E) na 4 uur. (F) Groen product na 48 uur reactietijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Gebruik van PANI fluorescentie nucleïnezuur hybridisatie detecteren. (A) PANI film gecreëerd via drop-coating op boorsilicaatglas, gevolgd door drogen gedurende 48 uur bij 40 ° C. (B) PANI fluorescentie na sonde immobilisatie. (C)Na hybridisatie van het doelwit DNA met PANI-geïmmobiliseerde probes. (D) fluorescentie bij 500 nm van PANI emulsie voor en na hybridisatie met ofwel aanvullende of enkele mismatch (mm) doelwit oligonucleotiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een PANI-gebaseerde sensor van nucleïnezuren vereist solubilisatie van het polymeer in water om te interageren met DNA en RNA. De dispersie van PANI in water wordt uitgevoerd onder toepassing van surfactanten micellen vormen zoals eerder gemeld 8. Naast de hier gebruikte NaDBS andere anionogene oppervlakteactieve stoffen als dodecyl ester van 4-sulfoftaalzuur, kunnen ionische surfactanten zoals nonylfenolethoxylaat of kationische surfactanten zoals cetyltrimethylammoniumbromide ook worden gebruikt voor de synthese van de te verwerken PANI 9,10. De beschreven synthese begint met een vaste verhouding van de anionogene oppervlakteactieve NaDBS toegevoegd aan de monomeer aniline bij een 2: 1 molaire verhouding. De oppervlakteactieve NaDBS heeft een hoge hydrofiel-lipofiel balans (HLB), waardoor polymerisatie van aniline monomeer in chloroform-water geëmulgeerd door de oprichting van het evenwicht tussen de micellaire polymere oliedruppeltjes en water. Het oxidatiemiddel APS wordt vervolgens toegevoegd in een 1: 1,5 molaire verhouding van micellen gr genererenwegens PANI, waarbij de binnenkern fungeert als kiemvormer. Dit leidt tot het hoofd naar de staart bevestiging van monomeren, terwijl ook het PANI houden in dynamisch evenwicht met de omringende oplosmiddel 11,12. De reactie verloopt op een gecontroleerde wijze tot hoogmoleculaire polymeren worden gevormd 13. Dit protocol deeltjes die variëren van 50 nm tot 1500 nm 3 genereren. Van cruciaal belang voor de oprichting van een reactie waarbij PANI groeit langzaam maar blijft oplosbaar is de langzame toevoeging van de oxidant APS, lage temperatuur, en de afwezigheid van sterke protische zuren. Sommige optimalisatie van reactant verhoudingen kan nodig zijn om goed gedispergeerde PANI genereren. PANI gesynthetiseerd volgens deze methode is stabiel gedurende meer dan een jaar als een emulsie. Overmatige verdunning moet vermeden worden omdat de HLB evenwicht van de dispersie kan worden verstoord, waardoor PANI neerslaan. Hoge snelheid mengen kan helpen om de PANI in oplossing te houden. Perfect oplosbaarheid is niet wenselijk, omdat het pellet Formati zou uitsluitenop, hetgeen een belangrijk criterium voor hybridisatie procedures in een emulsie gebaseerde sensor.
Na het genereren gedispergeerd PANI worden DNA probe-oligo aan de polymeermatrix elektrostatische interactie. Interactie van PANI imine groepen en de fosfaten van de ruggengraat van DNA spontaan optreden. Aspecifieke PANI-nucleïnezuur interacties bemoeilijken Analytsensorinrichting in complexe biologische monsters 14. Om associatie tussen PANI en DNA probe die kan worden onderscheiden van spontane interactie te bereiken, wordt het complex bestraald met UV. De oprichting van polaire resten veroorzaakt door UV-geactiveerd lading lokalisatie verhoogt bevochtigbaarheid van het polymeer oppervlak 15. Optimale belichting ongeveer 2 minuten, en kan worden bevestigd indien PANI fluorescentie bij 500 nm ruwweg 5X verhoogd (figuur 3). Overbelichting van het complex aan UV kan leiden tot verknoping tussen PANI en DNA, die in tegenstelling tot electrostatische interacties, does een hoogte van PANI fluorescentie veroorzaken.
Het proces van het genereren sensoren is eenvoudig en snel. De polymerisatiereactie is voltooid na 48 uur gevolgd door 24 uur te scheiden van ongereageerde oxidatiemiddel en NaDBS. Synthese zal moeten worden uitgevoerd zelden als de hoeveelheid voorraad PANI geproduceerd door het protocol in dit artikel uitgevoerd erg groot is ten opzichte van de gebruikte materialen in een sensor bedrag. PANI emulsie bij hoge concentraties stabiel; echter, kan elke verdunning die optreedt tijdens de bevestiging probe leiden tot het neerslaan van PANI, afbreuk te doen aan prestaties van de sensor. De directe gebruik van PANI-probe-complexen om doelen te detecteren zal deze kwestie te vermijden. Samen kunnen creëren van complexen en hybridisatie worden gedaan in minder dan een uur. PANI-probe films zijn stabieler en kunnen worden gebruikt na langdurige opslag. Een beperking van deze sensor techniek is dat het niet erg ontvankelijk voor multiplexen. Elke detectie evenement moet plaatsvinden in een afzonderlijke buis worden uitgevoerd. films kunneneen beter model voor multiplexing als verschillende probes kunnen worden gespot op verschillende gebieden van een film. Een monster kan worden aangebracht over de spot array en de fluorescentie op elke vlek gebruikt om expressie van een ander gen te evalueren.
De detectie bovenbedoeld verschaft verscheidene voordelen ten opzichte van andere systemen. Rapporten detecteren nucleïnezuren via een dissociatie mechanisme met PANI afhankelijk fluoroforen gekoppeld aan DNA oligo 5 sonde. Andere strategieën covalente binding van probes, die niet aan één basenpaar verschillen doelnucleïnezuren 16-17 onderscheiden. Het weglaten van etikettering of andere secundaire modi van detectie in deze technologie creëert kansen om andere eigenschappen van elektro-actieve PANI gebruiken. De sensor respons kon dus worden uitgebreid naar de meting van elektrochemische eigenschappen gewijzigd door het opnamehuis losmaken dynamiek van de sensor. Labs dat deze techniek goed te keuren zal de s vindenensor systeem effectief in aanvulling op snel en eenvoudig te kosten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
