Protocol
1. verarbeitbaren PANI Synthese
- Auflösen Anilin (1 ml, 11 mmol) vollständig in 60 ml Chloroform in einem 250 ml Rundkolben. Rühre bei 600 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten und Abkühlen auf 0-5 ° C mit Eis. Dies dauert in der Regel 15 bis 20 min (2A).
- Hinzufügen Natriumdodecylbenzolsulfonat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) zu der Anilin-Lösung in einem Rundkolben während bei 600 rpm gerührt wurde.
- Man löst Ammoniumpersulfat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) in 20 ml Wasser und fügen Sie alle tropfenweise über 30 Minuten eine Überhitzung der Reaktion zu vermeiden.
- Führen Sie die Reaktion bei 0-5 ° C für 24 Stunden, und lassen Sie es Raumtemperatur für weitere 24 Stunden zu erreichen.
- Beachten Sie das Reaktionsgemisch zunächst drehen milchig weiß nach 15 min, dann dunkelbraun nach 2 h und schließlich zu dunkelgrün nach 24 h (2B-F).
- Filtern Sie die PANI-NaDBS Lösung mit einem Büchner-Trichter. Mischen Sie mit 80 ml Chloroform und 120 ml Wasser in alseparation Trichter (2G).
- Inkubiere die Lösung 24 h bei Raumtemperatur und sammle die dunkelgrüne PANI aus dem Scheidetrichter, so dass nicht-umgesetztes NaDBS und APS in dem wässrige Überstand.
2. PANI-Sonde Mischen und UV-Bestrahlung
- Verdünnen Sie PANI Lösung 10x mit Chloroform-Wasser (1: 3 v / v) und mischen Sie 200 ul verdünnt PANI mit 6,4 & mgr; mol Sonden-DNA-Oligonukleotide durch sanftes für 15 min rocking in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bestrahlen , um die PANI-DNA - Lösung mit 1200 & mgr; J / cm 2 UV in einem Vernetzer für 2 min. Es ist kritisch, dass die UV-Belichtung mit der angegebenen Menge beschränkt ist. Verlängerte Exposition gegenüber UV kompromittiert die Fluoreszenzänderung in PANI, wahrscheinlich durch kovalente Vernetzung von PANI und DNA.
- Pellet-Komplexe durch Zentrifugation bei 17.000 xg für 6 min und Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Pellet erneut und resuspendieren in PBS.
3. Hybridization von PANI-Sonde
- Aus 8 ul 100 uM komplementären DNA-Oligonucleotide oder Zielnukleinsäuren zu 200 ul PANI-Sonde-Komplexe.
- Führen Hybridisierung durch Lösungsgemisch 15 min bei 40 rocking ° C.
- Pellet die PANI-Komplexe durch Zentrifugation bei 17.000 xg für 6 min. Waschen mit PBS und Resuspendieren in Wasser.
4. Emissions Steady-State-Fluoreszenzmessung
- In PANI aus verschiedenen Behandlungen in einer 96-Well-Mikroplatte und messen Emissionsfluoreszenz im 270-850 nm-Bereich durch Anregung bei 250 nm. Ein Emissionsspitze für PANI sollte etwa 500 nm zu beobachten.
5. Fluoreszenzmikroskopie Messung der hybridisierten Duplex
- Drop-Mantel PANI auf einem Borosilikat-Deckglas und trocken bei 40 ° C für 48 Stunden.
- In Sonde (8 ul 100 uM) auf einem getrockneten PANI Film und bestrahlen es mit UV - Licht (1200 & mgr; J / cm 2
- Waschen Sie die PANI-Sonde Film mit PBS und trocken bei 40 ° C für 48 Stunden.
- Führen Sie die Hybridisierung für 15 min von Ziel-Nukleinsäuren hinzufügen. Dies könnte eine biologische Probe oder eine Kontroll Zieloligonucleotid (8 ul 100 uM) sein. Folgen Sie mit einem PBS waschen.
- Besorgen Sie sich die Fluoreszenzbilder bei 40-facher Vergrößerung, mit einem 500 nm Langpassfilter.
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Representative Results
2A erfasst zu Beginn des Polymerisationsverfahrens des Reaktionsaufbau, also vor APS hinaus. Mizellenbildung ist der erste Schritt in dem Reaktionsverfahren-PANI - Synthese an der mizellaren Schnittstelle auftritt. 2B zeigt eine milchige Lösung nach 5 min. 30 min nach dem APS zugegeben wird die Reaktion dann auch in eine leicht braune Farbe. 2C zeigt die Farbänderung mit der Bildung von Oligomeren verbunden. 2D eine dunkelbraune Farbe nach 4 h zeigt, eine hohe Konzentration an kurzkettigen PANI angibt, im Einklang mit eine sehr langsame Reaktion. Endlich , nach 48 Stunden eine dunkelgrüne Lösung mit hoher PANI Molekulargewicht beobachtet werden kann, der in Chloroform-Wasser (Abbildung 2E). 2F zeigt eine gut dispergiert sind , homogene PANI Lösung im Scheidetrichter ohne Phasentrennung dispergiert wird.
(Abbildung 2) oder auf der Oberfläche der Drop-beschichteten Folien werden können (Abbildung 3). Die basale Fluoreszenz von PANI Filme relativ gering ist (3A). Sonden-DNA wird über dem Film hinzugefügt, und man ließ bei Raumtemperatur trocknen. Wenn die erwarteten PANI DNA-Komplex bildet, kann eine intensive Zunahme der Fluoreszenz beobachtet (3B) werden. Electron Zustrom von der negativ geladenen DNA verursacht höhere Elektronendichte in PANI-Molekülen, die Fluoreszenzzunahme verursacht. Nach der Hybridisierung induzierte Dissoziation der Sonde-Ziel - Duplex, kehrt PANI Fluoreszenz zu basalen Intensität (3C). Die Dissoziation wird durch Veränderungen in der DNA-Rückgrat bei der Hybridisierung, dass ein Kompromiss PANI-Sonde Wechselwirkung verursacht. Erfassungs Nukleinsäuren mit dieser Technologie können auch direkt in Emulsion (3D) durchgeführt werden. Ein Vorteil der Emulsion der Verwendung -basierten System ist die Kompatibilität mit Plattenleser Instrumenten. Dies ermöglicht eine hochgenaue Messung von PANI Fluoreszenz und vermeidet durch Unregelmäßigkeiten in Filmbeschichtung verursachten Schwierigkeiten. A PANI-basierten Sensor in Emulsions Format ist sehr spezifisch. Die Einführung einer einzelnen Fehlpaarung (mm) in der Ziel - Oligo ausfällt basal PANI Fluoreszenz (Figur 3D) wiederherzustellen.
Abbildung 1. Befestigung der Sonden durch UV - Exposition vermittelt erhöht PANI Fluoreszenz. Die Hybridisierung von Target - Nukleinsäuren führt zu Ablösung von PANI, und Reversion des Polymers auf die basale Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Ansicht dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Synthese von verarbeitbaren PANI. (A) Beginn der Polymerisationsreaktion. (B) Nach 5 min bei APS wird langsam zugegeben. (C) 30 Minuten nach der APS - Zugabe. (D) Nach 1 Stunde. (E) Nach dem 4 Std. (F) Grünes Produkt nach 48 Stunden der Reaktion. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Verwendung PANI Fluoreszenz Nucleinsäurehybridisierung nachzuweisen. (A) PANI - Film erzeugt durch Tropfenbeschichtung auf Borosilicatglas und anschließend bei 40 ° C für 48 Stunden getrocknet. (B) PANI Fluoreszenz nach Sondenimmobilisierung. (C)Nach der Hybridisierung der Ziel-DNA mit PANI-immobilisierten Sonden. (D) Fluoreszenz bei 500 nm von PANI Emulsion vor und nach der Hybridisierung mit entweder komplementär oder einzelne Fehlpaarung (mm) Zieloligonukleotide. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
A PANI-basierten Sensor von Nukleinsäuren erfordert die Solubilisierung des Polymers in Wasser, um mit DNA und RNA zu interagieren. Die Dispersion von PANI in Wasser Tenside erreicht Verwendung bilden Mizellen wie zuvor 8 berichtet. Neben den hier NaDBS andere anionische Tenside wie dodecylester von 4-Sulfophthalsäure, nicht - ionische Tenside wie Nonylphenolethoxylat oder kationische oberflächenaktive Mittel wie Cetyltrimethylammoniumbromid könnte auch für die Synthese von verarbeitbaren PANI 9,10 verwendet. Die Synthese hier beschrieben beginnt mit einem festen Verhältnis des anionischen Tensids zu dem Monomer NaDBS Anilin bei einem 2: 1-Molverhältnis. Das Tensid NaDBS hat einen hohen Hydrophilie-Lipophilie-Gleichgewicht (HLB) ermöglicht Polymerisation von Anilin-Monomer in Chloroform-Wasser emulgiert durch Gleichgewicht zwischen den mizellaren polymeren Öltröpfchen und Wasser herzustellen. Das Oxidationsmittel APS wird dann bei einer 1: 1,5-Molverhältnis von Mizellen gr zu erzeugen,aufgrund PANI, wobei der innere Kern als Keimbildner wirkt. Dies führt zu Schwanz Befestigung von Monomeren zu leiten, während auch PANI in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem umgebenden Lösungsmittel 11,12 zu halten. Die Reaktion läuft in einer gesteuerten Weise , bis hochmolekulare Polymere sind 13 gebildet. Dieses Protokoll wird Partikel erzeugen , die von 50 nm bis 1500 nm 3 betragen. Critical eine Reaktion zu etablieren, wo PANI wächst langsam noch löslich bleibt ist die langsame Zugabe des Oxidationsmittels APS, niedrige Temperatur, und das Fehlen von starken Protonensäuren. Einige Optimierung von Reaktions Proportionen kann notwendig sein, gut verteilt PANI zu erzeugen. PANI durch dieses Verfahren synthetisiert ist stabil für mehr als ein Jahr als Emulsion. Übermäßige Verdünnung sollte der HLB-Gleichgewicht der Dispersion vermieden werden kann gestört werden, was PANI auszufällen. High-Speed-Mischung kann helfen, die PANI in Lösung zu halten. Perfekte Löslichkeit ist nicht wünschenswert, da es Pellet formati ausschließen würdeauf, was ein wichtiges Kriterium für Hybridisierungsverfahren in einer Emulsionsbasis Sensor ist.
Nach dem Erzeugen PANI dispergiert, DNA-Sonde Oligos an die Polymermatrix durch elektrostatische Wechselwirkung gebunden. Wechselwirkung von PANI Imingruppen und die Phosphate des Rückgrats der DNA spontan auftreten. Unspezifische PANI-Nukleinsäure-Wechselwirkungen Analytsensorik in komplexen biologischen Proben 14 erschweren. Zu erreichen Assoziation zwischen PANI und Sonden-DNA, die aus spontanen Interaktionen unterschieden werden kann, wird der Komplex mit UV bestrahlt. Die Schaffung von polaren Gruppen durch erhöht UV-ausgelöste Ladungslokalisierung induzierte Benetzbarkeit der Polymeroberfläche 15. Optimale Belichtung beträgt ca. 2 min und kann bestätigt werden , wenn PANI Fluoreszenz bei 500 nm erhöht ist etwa 5X (Abbildung 3). Überexposition des Komplexes UV kann auf eine Vernetzung zwischen PANI und DNA führen, die im Gegensatz zu elektrostatischen Wechselwirkungen, does nicht eine Höhe von PANI Fluoreszenz führen.
Die Prozesssensoren der Erzeugung ist einfach und schnell. Die Polymerisationsreaktion wird nach 48 Stunden beendet, indem 24 Stunden, gefolgt von nicht-umgesetztes Oxidationsmittel und NaDBS zu trennen. Synthese müssen als die Menge an Vorrat PANI durchgeführt durch das Protokoll in diesem Artikel hergestellt selten werden ist sehr groß im Verhältnis zur Menge in einem Sensor verwendet wird. PANI Emulsion bei hohen Konzentrationen stabil ist; jedoch jede Verdünnung, die während der Sondenbefestigung auftritt, kann zu Ausfällen von PANI führen, Sensorleistung zu beeinträchtigen. Die unmittelbare Verwendung von PANI-Sonde Komplexe Ziele zu erkennen, wird dieses Problem zu vermeiden. Gemeinsam können Schaffung von Komplexen und Hybridisierung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. PANI-Sonde Filme sind stabiler und können nach einer Langzeitlagerung verwendet werden. Eine Einschränkung dieser Sensortechnologie ist, dass es nicht sehr zugänglich Multiplexen. Jedes Detektionsereignis muss in einem separaten Röhrchen durchgeführt werden. Filme könneneine bessere Format zum Multiplexen als verschiedene Sonden auf unterschiedlichen Regionen eines Films beobachtet werden konnte. Eine Probe konnte über den Spot-Array angewendet werden, und die Fluoreszenz an jedem Ort und Stelle verwendet Ausdruck eines anderen Gens zu bewerten.
Der Erfassungsmechanismus hier beschrieben wird, liefert mehrere Vorteile gegenüber anderen Systemen. Berichte von Nukleinsäuren durch eine Dissoziation Erfassungsmechanismus PANI Beteiligung stützen sich auf Fluorophore 5 Sonde DNA - Oligos angebracht. Andere Strategien nutzen , kovalente Bindung von Sonden, die 16-17 einzelne Basenpaar - Unterschiede in der Ziel - Nukleinsäuren zu unterscheiden scheitern. Das Weglassen der Markierung oder andere Nebenmoden Detektions in dieser Technologie schafft Möglichkeiten andere Eigenschaften von elektroaktiven PANI zu verwenden. Die Sensorantwort könnte somit durch die Befestigungs-Ablösung Dynamik des Sensors verändert die Messung der elektrochemischen Eigenschaften erweitert werden. Labs, die diese Technik annehmen wird, die s findenEnsor System werden zusätzlich zu schnell und unkompliziert kostengünstig.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
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