Protocol
סינתזה 1. processable פאני
- ממיסים אנילין (1 מ"ל, 11 מילימול) לחלוטין ב -60 מ"ל של כלורופורם בתוך 250 מ"ל בבקבוק מסביב לתחתית. מערבבים בסל"ד 600 במשך 5 דקות ומצננים עד 0-5 מעלות צלזיוס עם קרח. זה בדרך כלל לוקח 15-20 דקות (איור 2 א).
- להוסיף sulphonate בנזן dodecyl נתרן (NaDBS) (7.44 גר ', 21 מילימול) לפתרון אנילין בבקבוק עגול תחתית תוך ערבוב ב 600 סל"ד.
- ממסי אמוניום persulphate (APS) (3.072 גרם, 13.5 mmol) ב 20 מ"ל מים ולהוסיף את כל זה טיפה חכמה יותר מ -30 דקות כדי למנוע התחממות יתר התגובה.
- לבצע את התגובה על C 0-5 מעלות למשך 24 שעות, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
- שים את תערובת התגובה בתחילה להלבין חלבי לאחר 15 דקות, ולאחר מכן חום כהה לאחר 2 שעות, ולבסוף לירוק כהה לאחר 24 שעות (איור 2 ב-F).
- סנן הפתרון פאני-NaDBS עם משפך בוכנר. מערבבים עם כלורופורם 80 מ"ל ו -120 מ"ל מים כמומשפך eparation (איור 2G).
- דגירת הפתרון למשך 24 שעות בטמפרטורת חדר לאסוף את פאני הירוק כהה מן ארובת ההפרדה, עוזב NaDBS ו APS unreacted ב supernatant המימי.
ערבוב פאני-חללית 2. ו- UV הקרנה
- לדלל פתרון פאני 10x עם כלורופורם-מים (1: 3 v / v) ומערבבים 200 μl של פאני מדולל 6.4 μmol של oligonucleotides DNA בדיקה על ידי נדנדה עדין במשך 15 דקות בתוך שפופרת microfuge.
- מקרינים הפתרון פאני-DNA עם 1,200 μJ / 2 ס"מ של UV בתוך crosslinker 2 דקות. זה קריטי, כי החשיפה ל- UV מוגבלת לסכום המצוין. חשיפה רבה UV פוגעת שינוי קרינת פאני, כנראה עקב פאני cross-linking של קוולנטיים ו- DNA.
- מתחמי גלולה ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 6 דקות, ולשטוף עם בופר פוספט (PBS). גלול שוב, מחדש להשעות ב PBS.
3. Hybridization של חללית פאני
- הוסף 8 μl של 100 מיקרומטר oligonucleotides DNA משלימים או למקד חומצות גרעין 200 μl של מתחמי פאני-בדיקה.
- בצע הכלאה ידי נדנדת תערובת פתרון במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
- גלולה מתחמי פאני על ידי צנטריפוגה ב 17,000 XG במשך 6 דקות. לשטוף עם PBS מחדש להשעות במים.
4. פליטה יציבה מדידת קרינת המדינה
- להוסיף פאני מטיפולים שונים לתוך microplate 96 באר ולמדוד קרינת פליטה בטווח 270-850 ננומטר ידי עירור ב 250 ננומטר. שיא פליטה עבור פאני יש לשים לב סביב 500 ננומטר.
5. מדידה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הכלאה דופלקס
- זרוק מעיל פאני על coverslip בורוסיליקט זכוכית ויבש ב 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- להוסיף בדיקה (8 μl של 100 מיקרומטר) על סרט פאני יבשים מכשיר אותו עם האור האולטרה סגול (1,200 μJ / 2 ס"מ
- שטפו את הסרט פאני-בדיקה עם PBS ויבש ב 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- בצע הכלאה במשך 15 דקות על ידי הוספת חומצות גרעין יעד. זה יכול להיות דגימה ביולוגית או oligonucleotide ליעד האיזון (8 μl של 100 מיקרומטר). עקוב עם לשטוף PBS.
- להשיג את התמונות פלורסנט בהגדלה 40X, עם מסנן מסירה ארוכה 500 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 א לוכדת את התקנת התגובה בתחילת תהליך פילמור, כלומר, לפני כן APS. היווצרות micelle הוא השלב הראשוני התגובה תהליך-פאני סינתזה המתרחשת בבית הממשק micellar. איור 2B מראה פתרון חלבי לאחר 5 דקות. 30 דקות לאחר APS מתווסף התגובה פונה בצבע חום מעט. איור 2C מציג את השינוי הצבע המזוהה עם היווצרות של oligomers. איור 2 ד מראה צבע חום כהה לאחר 4 שעות, המעיד על ריכוז גבוה של שרשרת קצרה פאני, עולה בקנה אחד עם תגובה איטית מאוד. לבסוף לאחר 48 שעות פתרון ירוק כהה של פאני משקל מולקולרי גבוה ניתן להבחין כי הוא מפוזר כלורופורם-מים (איור 2E). איור 2F מראה פתרון פאני היטב התפזרו, הומוגניות המשפך המפריד ללא הפרדת פאזות.
: יכול להתבצע לשמור-together.within-page = "1"> חומצות גרעין חישה ב אמולסיה (איור 2) או על פני השטח של סרטים מצופה ירידה (איור 3). קרינת הבסיס של סרטי פאני היא יחסית נמוכה (איור 3 א). בדיקת DNA מתווסף על הסרט, להתייבש בטמפרטורת חדר. כאשר הצורות המורכבות DNA-פאני הצפויים, גידול אינטנסיבי הקרינה ניתן לצפות (איור 3 ב). זרם אלקטרוני מ- DNA הטעון השלילי גורם צפיפות אלקטרונים גבוהה מולקולות פאני, בגרימה להגדיל הקרינה. לאחר ניתוק מושרה כלאה של הדופלקס החללי-היעד, קרינת פאני חוזרת עוצמת בסיס (איור 3 ג). דיסוציאציה נגרמת משינויים עמוד השדרה DNA על הכלאה כי האינטראקציה פאני-החללית פשרה. חומצות גרעין חישה עם הטכנולוגיה הזו יכולה גם להתבצע ישירות אמולסיה (איור 3D). יתרון של שימוש בתחליב מערכת מבוססת היא תאימות עם מכשירים קוראים צלחת. זה מאפשר מדידה מדויקת מאוד של קרינת פאני, ונמנע קשיים שנגרמו סדרי ציפוי סרט. חיישן מבוסס פאני בפורמט תחליב מאוד ספציפי. המבוא של חוסר התאמה יחיד (מ"מ) ב אוליגו היעד לא מצליח לשחזר הקרינה פאני הבזליים (איור 3D).
באיור 1. קובץ מצורף של בדיקות בתיווך חשיפה UV מגביר הקרינה פאני. הכלאה של תוצאות חומצות גרעין יעד במנותק פאני, ואת החזרה של הפולימר פלואורסצנטי הבזליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Iles / ftp_upload / 54,590 / 54590fig2.jpg "/>
איור 2. סינתזה של processable פאני. (א) תחילת התגובה פילמור. (ב) אחרי 5 דקות כאשר APS מתווסף לאט. (ג) 30 דקות לאחר תוספת APS. (ד) לאחר 1 שעה. (ה) לאחר 4 שעות. (F) מוצר ירוק לאחר 48 שעות של תגובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השתמשו באיור 3. של קרינת פאני לזהות הכלאת חומצות גרעין. (א) סרט פאני נוצר באמצעות ציפוי טיפה על זכוכית בורוסיליקט, ואחריו ייבוש במשך 48 שעות ב 40 מעלות צלזיוס. (ב) קרינת פאני לאחר קיבוע חללי. (ג)בעקבות הכלאה של ה- DNA היעד עם בדיקות-משותקת פאני. (ד) הקרינה ב 500 ננומטר של אמולסיה פאני לפני ואחרי הכלאה עם oligonucleotides היעד משלימים או יחיד או אי-התאמה (מ"מ). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיישן מבוסס פאני של חומצות גרעין דורש solubilization של הפולימר במים כדי אינטראקציה עם DNA ו- RNA. פיזור פאני במים מושג באמצעות פעילי שטח, ויצר מיצלות כפי שדווח בעבר 8. בנוסף NaDBS משמש כאן פעילי שטח anionic אחרים כמו אסתר dodecyl של חומצה 4-sulfophthalic, פעילי שטח nonionic כמו ethoxylate פנול nonyl, או פעילי שטח קטיוני כמו ברומיד אמוניום cetyltrimethyl יכול לשמש גם לסינתזה של processable פאני 9,10. הסינתזה המתוארת כאן מתחילה עם יחס קבוע של NaDBS הפעיל שטח anionic מתווסף אנילין מונומר בכל 2: יחס טוחנת 1. NaDBS פעילי שטח יש איזון הידרופיליות-lipophile גבוהה (HLB) המאפשר פילמור של מונומר אנילין לתחליב כלורופורם-מים על ידי הקמת שיווי משקל בין טיפות שמן פולימריים micellar ומים. APS החמצון מתווסף לאחר מכן ביחס של 1: 1.5 יחס טוחן כדי ליצור מיצלות של גרבגלל פאני, שבו הגרעין הפנימי פועל כסוכן nucleating. זה מוביל ראש מצורף הזנב של מונומרים, תוך שמירה על פאני בשיווי משקל דינמי עם 11,12 שמסביב ממס. תמורת התגובה באופן מבוקר עד פולימרי משקל מולקולריים גבוהים נוצרת 13. פרוטוקול זה יפיק חלקיקים שנעים בין 50 ננו-מטר ל -1,500 ננומטר 3. קריטי הקמת תגובה שבו פאני צומח לאט עדיין נשאר מסיס הוא התוספת האיטית של APS החמצון, בטמפרטורה נמוכה, והיעדר חומצות protonic חזקים. אופטימיזציה חלק פרופורציות מגיבות עשוי להיות נחוץ כדי ליצור פאני היטב התפזר. פאני מסונתז על ידי שיטה זו הוא יציב במשך יותר משנה אחת כמו תחליב. דילול יתר יש להימנע כיתרת HLB של פיזור עשויה להיות מופרת, גרימת פאני כדי לזרז. ערבוב מהיר יכול לעזור לשמור על פאני בתמיסה. מסיסות מושלמת אינה רצויה, כפי שהוא ימנע formati גלולעל, המהווה אמת מידה חשובה נהלי הכלאת חיישן תחליב מבוסס.
לאחר יצירת פיזור פאני, oligos בדיקת DNA מחובר מטריקס הפולימר באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית. אינטראקציה של קבוצות imine פאני ואת הפוספטים של עמוד השדרה של DNA להתרחש באופן ספונטני. שאינו ספציפי-גרעין פאני אינטראקציות חומצה לסבך חישה אנליטי בדגימות ביולוגיות מורכבות 14. כדי להשיג קשר בין פאני ו- DNA בדיקה כי ניתן להבחין בין אינטראקציות ספונטניות, המתחם הוא מוקרן עם UV. יצירת moieties הקוטב המושרה על ידי לוקליזציה תשלום אצבע קלה על ההדק UV מגביר יכולת רטיבות משטח פולימר 15. חשיפה אופטימלית היא כ 2 דקות, וניתן אשרה אם קרינת פאני ב 500 ננומטר היא מוגבהת בערך 5X (איור 3). חשיפת יתר של המתחם כדי UV יכול להוביל crosslinking בין פאני ו- DNA, שבניגוד אינטראקציות אלקטרוסטטיות, איילהשעות לא לגרום לגובה של קרינת פאני.
התהליך של יצירת חיישנים הוא קל ומהיר. התגובה פילמור תושלם לאחר 48 שעות ואחריו 24 שעות להיפרד חמצון unreacted ו NaDBS. סינתזה תצטרך להתבצע לעתים רחוקות כמו כמות פאני המניות המיוצר על ידי הפרוטוקול במאמר זה הוא יחסית גדול מאוד לסכום המשמש חיישן. תחליב פאני בריכוזים גבוהים הוא יציב; עם זאת, דילול המתרחש במהלך מצורף חללית יכול להוביל משקעים של פאני, להתפשר על ביצועי חיישן. השימוש המיידי של מתחמי פאני-בדיקה לגילוי מטרות יהיה להימנע מבעיה זו. יחד, יצירת מתחמי הכלאה ניתן לעשות בתוך פחות משעה. סרטי פאני-חללית יציבים יותר וניתן להשתמש בו לאחר אחסון לטווח ארוך. מגבלה של טכנולוגיית החיישן הזה הוא שזה לא נוח מאוד ריבוב. כל אירוע זיהוי חייבת להתבצע בצינור נפרד. רשאי סרטיםלספק פורמט טוב יותר עבור ריבוב כמו יכולות להיות הבחינו בדיקות שונות על אזורים שונים של סרט. מדגם יכול להיות מיושם על מערך המקום, ואת הקרינה בכל מקום המשמשת להערכת ביטוי של גן שונה.
מנגנון זיהוי המתואר כאן מספק מספר יתרונות על פני מערכות אחרות. דוחות של גילוי חומצות גרעין באמצעות מנגנון ניתוק המעורב פאני להסתמך על fluorophores מצורף לחקור oligos DNA 5. אסטרטגיות אחרות להשתמש מצורפות קוולנטיים של בדיקות, אשר אינן מצליחות להבחין בהבדלי בסיס-זוג אחד בחומצות גרעין יעד 16-17. השמטת תיוג או מצבים משניים אחרים של איתור בטכנולוגיה הזו מייצרת הזדמנויות מדהימות להשתמש נכסים נוספים של פאני אלקטרו-פעיל. התגובה חיישן ובכך ניתן יהיה להרחיב את המדידה של נכסים אלקטרוכימי להשתנות על ידי הדינמיקה-ניתוק החיבור של החיישן. מעבד כי לאמץ את הטכניקה הזאת ימצא את היםמערכת אנסור להיות חסכונית בנוסף מהיר וישיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
