Protocol
1. Processabile PANI Sintesi
- Sciogliere anilina (1 ml, 11 mmol) completamente in 60 ml di cloroformio in 250 ml pallone a fondo rotondo. Mescolare a 600 rpm per 5 minuti e raffreddare a 0-5 ° C con ghiaccio. Questo richiede di solito 15-20 minuti (Figura 2A).
- Aggiungere sodio dodecil benzene solfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmoli) alla soluzione di anilina in un pallone a fondo rotondo sotto agitazione a 600 rpm.
- Sciogliere ammonio persolfato (APS) (3.072 g, 13,5 mmol) in 20 ml di acqua e aggiungere tutto questo goccia a goccia nel corso di 30 minuti per evitare il surriscaldamento della reazione.
- Effettuare la reazione a 0-5 ° C per 24 ore, e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per un altro 24 ore.
- Osservare la miscela di reazione inizialmente girare bianco latte dopo 15 min, marrone scuro poi, dopo 2 ore, e, infine, al verde scuro dopo 24 ore (Figura 2B-F).
- Filtrare la soluzione PANI-NaDBS con un imbuto di Buchner. Mescolare con 80 ml di cloroformio e 120 ml di acqua comeeparation imbuto (Figura 2G).
- Incubare la soluzione per 24 ore a temperatura ambiente e raccogliere il PANI verde scuro dalla imbuto separatore, lasciando NaDBS reagiti e APS nel surnatante acquoso.
2. miscelazione PANI-sonda e irradiazione UV
- Diluire soluzione PANI 10x con cloroformio-acqua (1: 3 v / v) e miscelare 200 ml di PANI diluito con 6,4 micromol di sonde oligonucleotidi di DNA mediante dolce dondolio per 15 minuti in una provetta per microcentrifuga.
- Irradiare la soluzione PANI-DNA con 1.200 μJ / cm 2 di UV in un reticolante per 2 min. È fondamentale che l'esposizione UV è limitata all'importo indicato. L'esposizione prolungata ai raggi UV compromette la variazione di fluorescenza in PANI, probabilmente a causa di cross-linking covalente di Pani e il DNA.
- complessi di pellet per centrifugazione a 17.000 xg per 6 minuti, e lavare con tampone fosfato (PBS). Pellet di nuovo, e risospendere in PBS.
3. Hybridization di PANI-probe
- Aggiungere 8 ml di 100 micron oligonucleotidi di DNA complementare o indirizzare gli acidi nucleici per 200 ml di complessi PANI-sonda.
- Eseguire ibridazione dondolo miscela soluzione per 15 min a 40 ° C.
- Pellet i complessi PANI per centrifugazione a 17.000 xg per 6 min. Lavare con PBS e risospendere in acqua.
4. Emissione costante di misura Stato fluorescenza
- Aggiungere PANI da diversi trattamenti in una micropiastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza emissione nel campo 270-850 nm per eccitazione a 250 nm. Un picco di emissione per PANI deve osservare circa 500 nm.
5. microscopia a fluorescenza Misura della ibridato Duplex
- Goccia cappotto PANI su un vetrino di vetro borosilicato e asciutto a 40 ° C per 48 ore.
- Aggiungere sonda (8 ml di 100 mM) su un film PANI essiccato e irradiare con luce UV (1.200 μJ / cm 2
- Lavare il film PANI-sonda con PBS e asciugare a 40 ° C per 48 ore.
- Eseguire ibridazione per 15 minuti con l'aggiunta di acidi nucleici bersaglio. Questo potrebbe essere un campione biologico o un oligonucleotide destinazione di controllo (8 ml di 100 mM). Seguire con un lavaggio PBS.
- Ottenere le immagini fluorescenti a 40X di ingrandimento, con un filtro passaggio lungo 500 nm.
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Representative Results
Figura 2A cattura la configurazione reazione all'inizio del processo di polimerizzazione, cioè prima APS aggiunta. Formazione di micelle è il primo passo nella reazione di sintesi avviene processo PANI all'interfaccia micellare. La Figura 2B mostra una soluzione lattescente dopo 5 min. 30 min dopo APS è aggiunta la reazione si rivolge ad un colore leggermente marrone. Figura 2C mostra il cambiamento di colore associata alla formazione di oligomeri. Figura 2D mostra un colore marrone scuro dopo 4 ore, indicando un'alta concentrazione di corta catena PANI, coerente con una reazione molto lenta. Infine, dopo 48 ore si osserva una soluzione verde scuro di alta PANI peso molecolare che viene dispersa in cloroformio-acqua (figura 2E). La figura 2F mostra una ben dispersa, soluzione omogenea PANI nell'imbuto separatore senza separazione di fase.
(Figura 2) o sulla superficie del film di goccia rivestite (Figura 3) together.within pagine keep-. La fluorescenza basale del film PANI è relativamente basso (Figura 3A). Sonda DNA viene aggiunto sopra il film, e lasciato asciugare a temperatura ambiente. Quando gli attesi forme complesse DNA-PANI, un aumento della fluorescenza intensa si possono osservare (Figura 3B). Electron afflusso dal DNA caricato negativamente provoca densità elettronica superiore in molecole PANI, causando l'aumento della fluorescenza. Dopo l'ibridazione indotta dissociazione del duplex della sonda-bersaglio, PANI fluorescenza torna a intensità basale (Figura 3C). La dissociazione è causata da variazioni del backbone DNA su ibridazione che l'interazione compromesso PANI-sonda. Acidi nucleici di rilevamento con questa tecnologia possono essere eseguite anche direttamente in emulsione (Figura 3D). Un vantaggio dell'utilizzo dell'emulsione sistema basato è la compatibilità con gli strumenti lettore di piastre. Questo permette una misurazione estremamente precisa della PANI fluorescenza, ed evita difficoltà causate da irregolarità nella pellicola di rivestimento. Un sensore PANI basata in formato emulsione è altamente specifico. L'introduzione di un disadattamento (mm) nella oligo destinazione non riesce a ripristinare basale PANI fluorescenza (Figura 3D).
Figura 1. Collegamento di sonde mediate dall'esposizione ai raggi UV aumenta PANI fluorescenza. Ibridazione di destinazione nucleici acidi risultati in distacco dalla PANI, e reversione del polimero a fluorescenza basale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Sintesi del PANI lavorabile. (A) Start di reazione di polimerizzazione. (B) Dopo 5 minuti quando viene aggiunto lentamente APS. (C) 30 min dopo APS aggiunta. (D) Dopo 1 ora. (E) Dopo 4 ore. (F) Prodotto verde dopo 48 ore di reazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Uso di PANI fluorescenza per rilevare ibridazione degli acidi nucleici. Pellicola (A) PANI creata attraverso drop-coating su vetro borosilicato, seguito da essiccazione per 48 ore a 40 ° C. (B) fluorescenza PANI dopo la sonda immobilizzazione. (C)Dopo l'ibridazione di DNA bersaglio con sonde PANI-immobilizzati. (D) fluorescenza a 500 nm di Pani emulsione di prima e dopo l'ibridazione sia con disadattamento complementare o singolo (mm) oligonucleotidi bersaglio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un sensore PANI basata su acidi nucleici richiede la solubilizzazione del polimero in acqua per interagire con il DNA e RNA. La dispersione di PANI in acqua è realizzato utilizzando tensioattivi, formando micelle come precedentemente riportato 8. Oltre alle NaDBS qui utilizzati altri tensioattivi anionici come dodecil estere dell'acido 4-sulfophthalic, tensioattivi non ionici come nonilfenolo etossilato, o tensioattivi cationici come bromuro di ammonio cetyltrimethyl potrebbero anche essere utilizzati per la sintesi di lavorabile PANI 9,10. La sintesi descritta qui inizia con una quota fissa dei tensioattivi anionici NaDBS aggiunti alla anilina monomero in un rapporto 2: 1 molare. I tensioattivi NaDBS ha un saldo alta idrofilo-lipofilo (HLB) che consente la polimerizzazione di monomeri anilina emulsionato in cloroformio-acqua attraverso la definizione di un equilibrio tra le goccioline di olio polimerici micellari e acqua. L'APS ossidante viene poi aggiunto in un rapporto molare 1: 1.5 per generare micelle di grcausa PANI, dove il nucleo interno agisce come un agente nucleante. Questo porta a testa per l'attaccamento coda di monomeri, pur mantenendo PANI in equilibrio dinamico con l'ambiente circostante solvente 11,12. La reazione procede in modo controllato, fino polimeri ad alto peso molecolare sono formate 13. Questo protocollo genera particelle che vanno da 50 nm a 1500 nm 3. Fondamentale per stabilire una reazione in cui PANI cresce lentamente solubile rimane ancora è la lenta aggiunta della APS ossidante, a bassa temperatura, e l'assenza di forti acidi protonici. Alcuni ottimizzazione delle proporzioni dei reagenti può essere necessario produrre ben disperso-PANI. PANI sintetizzato con questo metodo è stabile per più di un anno come emulsione. eccessiva diluizione deve essere evitata in quanto l'equilibrio HLB della dispersione può essere interrotto, causando PANI per precipitare. Alta velocità di miscelazione può aiutare a mantenere la PANI in soluzione. Perfetto solubilità non è auspicabile, in quanto impedirebbe Formati pelleton, che è un criterio importante per le procedure di ibridazione in un sensore a base di emulsione.
Dopo aver generato disperso PANI, oligo sonda DNA sono attaccati alla matrice polimerica attraverso l'interazione elettrostatica. L'interazione di gruppi imminici PANI e fosfati della spina dorsale del DNA si verificano spontaneamente. Non specifiche interazioni acido nucleico PANI-complicano analiti di rilevamento in campioni biologici complessi 14. Per raggiungere associazione tra Pani e il DNA della sonda che può essere distinta dalle interazioni spontanee, il complesso è irradiato con raggi UV. La creazione di frazioni polari indotte dalla localizzazione carica UV-innescato aumenta bagnabilità della superficie del polimero 15. Esposizione ottimale è di circa 2 min, e può essere confermata se PANI fluorescenza a 500 nm è elevata circa 5X (Figura 3). Sovraesposizione del complesso ai raggi UV può portare a reticolazione tra PANI e il DNA, che a differenza di interazioni elettrostatiche, does non causare un'elevazione di PANI fluorescenza.
Il processo di generazione di sensori è facile e veloce. La reazione di polimerizzazione è completata dopo 48 ore seguito da 24 ore a separarsi da ossidante reagito e NaDBS. dovrà essere effettuata raramente come quantità di magazzino PANI prodotta dal protocollo in questo articolo sintesi è molto grande rispetto alla quantità utilizzata in un sensore. PANI emulsione ad alte concentrazioni è stabile; tuttavia, alcuna diluizione che si verifica durante l'attacco sonda può portare alla precipitazione di PANI, compromettere le prestazioni del sensore. L'uso immediato di complessi PANI-sonda per rilevare obiettivi eviterà questo problema. Insieme, creazione di complessi e ibridazione può essere realizzata in meno di un'ora. film PANI-probe sono più stabili e possono essere utilizzati dopo la conservazione a lungo termine. Una limitazione di questa tecnologia dei sensori è che non è altamente suscettibile di multiplexing. Ogni evento di rilevazione deve essere effettuata in un tubo separato. film possonofornire un formato migliore per la multiplazione come sonde diverse potrebbero essere individuati su diverse regioni di un film. Un esempio potrebbe essere applicato sopra la matrice punto, e la fluorescenza ad ogni punto utilizzato per valutare l'espressione di un gene diverso.
Il meccanismo di rilevamento qui descritto fornisce diversi vantaggi rispetto ad altri sistemi. I rapporti di rilevazione degli acidi nucleici attraverso un meccanismo di dissociazione che coinvolge PANI si affidano a fluorofori collegati a sondare oligo DNA 5. Altre strategie utilizzano attacco covalente di sonde, che non riescono a distinguere le differenze di base coppie singoli destinatari acidi nucleici 16-17. L'omissione di altri modi secondari di rilevamento in questa tecnologia di etichettatura o crea opportunità di utilizzare altre proprietà di PANI elettro-attivi. La risposta del sensore pertanto potrebbe essere esteso alla misura delle proprietà elettrochimiche alterati dalla dinamica attacco-stacco del sensore. Labs che adottano questa tecnica troveranno le sSistema di Ensor a essere conveniente in aggiunta al veloce e semplice.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
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