Protocol
1. 처리 가능한 PANI 합성
- 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 클로로 폼 60㎖를 완전히 (1 ㎖, 11 밀리몰) 아닐린을 녹인다. 600 5 분 동안 회전과 얼음 0-5 ° C까지 시원한에서 저어. 이것은 일반적으로 15 ~ 20 분 (그림 2A)를합니다.
- 600 rpm으로 교반하면서 둥근 바닥 플라스크 내의 아닐린 용액에 소듐 도데 실 벤젠 설포 네이트 (NaDBS) (7.44 g, 21 밀리몰)을 추가한다.
- 20 ml의 물에 황산 암모늄 (APS) (3.072 g, 13.5 밀리몰)을 용해하고 모든 드롭 현명한 30 분 이상 반응의 과열을 방지하기 위해 추가 할 수 있습니다.
- 24 시간 동안 0 내지 5 ℃에서 반응을 수행하고, 또 다른 24 시간 동안 실온에 도달 할 수있다.
- 반응 혼합물은 초기에 15 분 후에 유백색 차례 관찰, 2 시간 후에, 최종적으로 24 시간 (도 2B-F) 후 진한 녹색 다음 암갈색.
- 흐너 깔때기로 PANI-NaDBS 용액 필터. 같은 80 ml의 클로로포름 120 ml의 물과 혼합eparation 깔때기 (그림 2G).
- 수성 상청액과 반응 NaDBS APS두고, 실온에서 24 시간 동안 용액을 인큐베이션하고, 분리 깔때기에서 어두운 녹색 PANI 수집.
2. PANI 프로브 혼합 UV 조사
- 클로로포름 - 물 PANI 용액을 10 배 희석 (1 : 3 v / v)로 및 미세 원심 분리 튜브에서 15 분 동안 부드럽게 흔들하여 프로브 DNA 올리고 뉴클레오티드 6.4 μmol 희석 PANI 200 μL를 혼합한다.
- 2 분 동안 가교제의 UV 1,200 μJ / ㎠로 PANI-DNA 용액을 조사한다. 자외선 노출이 표시된 양을 제한하는 것이 중요합니다. UV에 노출 확장은 PANI 및 DNA의 공유 가교에 의한 가능성 PANI의 형광 변화를 타협.
- 6 분 동안 17,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 단지 및 인산염 완충 식염수 (PBS)으로 씻는다. 다시 펠렛 및 PBS에 다시 일시 중지합니다.
3. HPANI 프로브의 ybridization
- PANI 프로브 단지의 200 μL에 핵산을 100 μM 보완 DNA 올리고 뉴클레오타이드의 8 μl를 추가 또는 대상.
- 40에서 15 분 동안 혼합 용액을 흔들어 하이브리드를 수행 기음.
- 6 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리하여 PANI 단지 펠렛. PBS로 세척하고 물에 다시 일시 중지합니다.
4. 배출 정상 상태 형광 측정
- 250 nm에서 여기로 96 웰 마이크로 플레이트에 다른 치료에서 PANI를 추가하고 270-850 nm의 범위에서 방출 형광을 측정한다. PANI위한 발광 피크가 500 nm의 주위를 관찰해야한다.
하이브리드 이중 5. 형광 현미경 측정
- 48 시간 40 ° C에서 붕규산 유리 커버 슬립 건조에 코트 PANI를 삭제합니다.
- 건조 PANI 필름에 프로브 (100 μM의 8 μl를) 추가하고 자외선 (1,200 μJ / ㎠로 조사
- 48 시간 동안 40 ° C에서 PANI-프로브 PBS 필름을 건조 씻으십시오.
- 표적 핵산을 첨가하여 15 분 동안 혼성화를 수행한다. 이는 생물학적 샘플 또는 제어 표적 올리고 뉴클레오타이드 (100 μM 8 μL) 일 수있다. PBS의 세척에 따릅니다.
- 500 nm의 긴 패스 필터, 40X 배율에서 형광 이미지를 얻습니다.
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Representative Results
도 2a는 APS 부가 전 중합 공정, 즉 개시시 반응 셋업을 캡처한다. 미셀 형성은 미셀 계면 프로세스 PANI 합성이 발생하는 반응의 초기 단계이다.도 2b는 5 분 후에 유백색 용액을 나타낸다. APS 반응 첨가 후 30 분 약간 갈색으로 변.도 2c는 올리고머의 형성과 연관된 색상 변화를 보여준다.도 2D가 함께 일관성 단쇄 PANI의 높은 농도를 나타내는, 4 시간 후에 진한 갈색을 나타낸다 매우 느린 반응. 마지막으로, 클로로포름 - 물 (도 2E)에 분산 된 고 분자량 PANI의 암녹색 용액을 관찰 할 수 48 시간 후.도 2F는 상분리와 분리 깔때기에서 잘 분산되어, 균일 한 PANI 용액을 나타낸다.
(도 2) 또는 드롭 - 코팅 필름의 표면 상에 (도 3). PANI 막의 기저 형광 (도 3A) 상대적으로 낮다. DNA 프로브는 막에 걸쳐 첨가하고, 실온에서 건조시킨다. 예상되는 DNA-PANI 복잡한 형태는, 형광의 강도 증가 (그림 3B)를 관측 할 수있는 경우. 음으로 하전 된 DNA로부터의 전자 유입 형광 증가를 초래 PANI 분자에 높은 전자 밀도를 야기한다. 프로브 대상 이중의 하이브리드 화에 의한 분리 한 후, PANI의 형광 기초 강도 (그림 3C)로 돌아갑니다. 해리는 하이브리드시 DNA 백본 그 타협 PANI 프로브의 상호 작용의 변화에 의해 발생합니다. 이 기술을 감지 핵산은 에멀션 (도 3D)에서 직접 수행 될 수있다. 에멀젼을 사용하는 장점 기반 시스템은 플레이트 리더 장비와의 호환성이다. 이 PANI 형광 매우 정확한 측정을 가능하게하고, 필름 코팅의 요철로 인한 어려움을 피할 수 있습니다. 유화 형식의 PANI 기반 센서는 매우 다릅니다. 대상 올리고에서 하나의 불일치 (㎜)의 도입은 기초 PANI 형광 (그림 3D)을 복원하는 데 실패합니다.
UV 노출에 의해 매개 프로브 그림 1. 첨부 PANI에서 분리에 표적 핵산 결과 PANI 형광. 하이브리드을 증가시키고, 기초 형광에 폴리머의 복귀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하시기 바랍니다.
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처리 가능한 PANI 그림 2. 합성. (A) 중합 반응의 시작. APS 천천히 첨가 5 분 후, (B). (C) 30 분 후 APS 첨가. 1 시간 후, (D). 4 시간 후 (E). (F) 반응 48 시간 후 녹색 제품입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PANI 형광도 3. 핵산 혼성화를 검출한다. 40 ℃, 48 시간 동안 건조시켜 붕규산 유리 드롭 코팅을 통해 생성 (A) PANI 막. 프로브 고정화 후 (B) PANI 형광. (C)PANI-고정 된 프로브와 표적 DNA의 혼성화에 따라. 전 하나 보완 또는 단일 불일치 (mm) 표적 올리고 뉴클레오타이드와 하이브리드 후 PANI 에멀젼의 500 nm에서 (D) 형광. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
핵산의 PANI 기반 센서는 DNA 및 RNA와 상호 작용하기 위해서 물에 대한 중합체의 용해를 필요로한다. 물 PANI의 분산 이전 8보고 미셀을 형성하는 계면 활성제를 사용하여 달성된다. 4- sulfophthalic 산 도데 실 에스테르와 같은 다른 음이온 성 계면 활성제 여기서 사용 NaDBS 이외에도, 노닐 페놀에 톡실 레이트, 또는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드와 같은 양이온 성 계면 활성제 등의 비이 온성 계면 활성제는 또한 가공성 PANI 9,10의 합성에 사용될 수있다. 1 몰비 : 여기에 기술 된 합성 2에 아닐린 단량체를 첨가 음이온 계면 활성제 NaDBS의 고정 된 비율로 시작된다. 계면 활성제 NaDBS 높은 친수성 - 친 유성 균형 (HLB)이 고분자 미셀 유적 및 물로 균형을 확립하여, 클로로포름 - 물에 유화 아닐린 단량체의 중합 수있다. GR의 미셀을 생성하기 위해 1.5 몰비 산화제 APS는 1로 첨가내부 코어는 핵제로서 작용 PANI를 인하여. 이것은 또한 주변의 용매 (11, 12)와 동적 평형 PANI를 유지하면서, 모노머의 꼬리 첨부 파일에 머리를 이끈다. 고 분자량 중합체까지 제어 된 방식으로 반응을 진행한다 (13)이 형성된다. 이 프로토콜은 50 nm 내지 1,500 nm의 3 범위 입자를 생성합니다. PANI 아직 느리게 성장 가용성 유지 반응을 수립 긴급는 산화제 APS 저온, 강한 양성 자성 산의 부재를 서서히 첨가한다. 반응물 비율의 일부 최적화가 잘 분산 된 PANI를 생성 할 필요가있다. 이 방법에 의해 합성 PANI는 에멀젼과 같은보다 1 년 이상 안정적입니다. 분산의 HLB 균형이 중단 될 수 있으므로 과도한 희석은 PANI가 침전의 원인 피해야한다. 고속 혼합 용액에 PANI를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 펠릿 formati을 배제하는 것처럼 완벽한 용해도는 바람직하지 않다에멀젼 기반 센서 하이브리드 절차의 중요한 기준이다에.
PANI 분산 생성 한 후, DNA 프로브 올리고 정전기 상호 작용을 통해 중합체 매트릭스에 부착된다. PANI 이민 기의 상호 작용 및 DNA의 주쇄의 인산염 자발적 발생한다. 비특이적 PANI - 핵산 상호 작용이 복잡한 생물학적 시료 14에서 분석 검출을 복잡. 자발적인 상호 구별 될 수 PANI와 탐침 DNA 사이의 연결을 달성하기 위해, 복합체는 UV 조사한다. UV-트리거 충전 현지화에 의해 유도 극성 부분의 생성은 고분자 표면 (15)의 습윤성을 증가시킨다. 최적 노출은 약 2 분이며, 500 nm에서 형광 PANI는 약 5 배 (도 3)를 상승하면 확인할 수있다. 과다 노출 UV의 복잡한의 PANI 및 DNA, 정전 기적 상호 작용과는 달리, 암컷 사이에 가교 될 수 있습니다PANI 형광의 상승의 원인이 아니다.
센서를 생성하는 과정은 간단하고 신속하다. 중합 반응은 미 반응 산화제 NaDBS 별도로 24 시간,이어서 48 시간 이후에도 완료된다. 센서에 사용되는 양에 매우 큰 상대는 합성이 문서의 프로토콜에 의해 생산 된 재고의 PANI의 양으로 자주 수행해야하는 것이다. 고농도 PANI 에멀젼 안정하다; 그러나, 프로브 첨부 동안 발생하는 모든 희석 센서 성능 저하, PANI의 침전으로 이어질 수 있습니다. 목표물을 감지 할 수 PANI 프로브 단지의 즉시 사용이 문제를 방지 할 수 있습니다. 함께 단지와 하이브리드의 생성 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. PANI 프로브 필름은 더 안정하고 장기 저장하여 사용할 수있다. 이 센서 기술의 한계는 매우 다중화 순종하지 않다는 것이다. 각 검출 사건은 분리 관에서 수행되어야한다. 영화는 할 수있다다른 프로브 영화의 다른 지역에서 발견 될 수있는대로 다중화를위한 더 나은 형식을 제공합니다. 시료 스폿 어레이에 도포 될 수 있고 각각의 스폿의 형광 다른 유전자의 발현을 평가하는데 사용된다.
여기에 설명 된 검출기구는 다른 시스템에 비해 여러 장점을 제공한다. PANI를 포함하는 분리 메커니즘을 통해 핵산을 검출 리포트 DNA 올리고 5에서 프로브에 부착 된 형광 물질에 의존한다. 다른 전략은 표적 핵산 16-17 단일 염기 쌍의 차이를 구별하지 프로브의 공유 결합을 사용합니다. 라벨 또는이 기술의 검출 다른 차 모드의 누락은 전기 활성 PANI의 다른 속성을 사용 할 수있는 기회를 만듭니다. 센서 응답은 이에 따라 센서의 부착 - 탈착 역학 변경된 전기 특성의 측정에 확장 될 수있다. 이 기술을 채택 연구소는의를 찾을 수ENSOR 시스템은 빠르고 간단뿐만 아니라 비용 대비 효과가있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
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