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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

एक वैक्यूम स्थिर इमेजिंग खिड़की के साथ फेफड़ों में लंबे समय तक उच्च संकल्प intravital माइक्रोस्कोपी

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54603
Automatic Translation
1, 5, 1,2, 1,2,5, 3,4, 3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

Abstract

इस तरह के फेफड़े, जिगर और हड्डी के रूप में माध्यमिक साइट्स के लिए मेटास्टेसिस लगभग 90% 1 की मृत्यु दर के साथ एक दर्दनाक घटना है। इन साइटों में से, फेफड़ों शरीर, नाजुक प्रकृति और उचित शरीर क्रिया विज्ञान को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका के भीतर अपनी संलग्न स्थिति की वजह से सबसे कठिन intravital ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग का आकलन करने के लिए है। जबकि नैदानिक ​​तौर तरीकों (पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और गणना टोमोग्राफी (सीटी)) इस ऊतक के noninvasive छवियों को प्रदान करने में सक्षम हैं, वे जल्द से जल्द संकल्प बोने की घटनाओं कल्पना करने के लिए आवश्यक है, एक एकल पिक्सेल के साथ की कमी लगभग एक हजार कोशिकाओं से मिलकर। मेटास्टेटिक फेफड़ों बोने मांगना के मौजूदा मॉडल है कि घटनाओं को सिर्फ एक ट्यूमर सेल के आने के बाद अस्तित्व और बाद के विकास के लिए निर्धारक हैं। इसका मतलब यह है कि एकल कोशिका संकल्प 2 के साथ वास्तविक समय intravital इमेजिंग उपकरण के क्रम में बोने सेल के phenotypes को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैंलोकसभा और इन मॉडलों का परीक्षण करें। जबकि उच्च संकल्प फेफड़ों के ऑप्टिकल इमेजिंग विभिन्न पूर्व vivo तैयारियों का उपयोग किया गया है, इन प्रयोगों को आम तौर पर एक समय बिंदु assays हैं और नाटकीय रूप से बदल माहौल की वजह से कलाकृतियों और संभव गलत निष्कर्ष करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (तापमान, प्रचुरता, साइटोकिन्स, आदि ) छाती गुहा और संचार प्रणाली 3 से हटाने से उत्पन्न। हाल ही में काम दिखाया गया है बरकरार फेफड़ों की उस समय व्यतीत हो जाने के intravital इमेजिंग ऑप्टिकल संभव है का उपयोग कर एक निर्वात स्थिर इमेजिंग खिड़की 2,4,5 हालांकि, ठेठ इमेजिंग बार लगभग 6 घंटा तक ही सीमित कर दिया गया है। यहाँ हम फेफड़ों के 12 घंटा की अवधि में इस तरह के एक खिड़की के उपयोग के लिए लंबी अवधि के intravital इमेजिंग समय चूक के प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। समय चूक छवि इस विधि का उपयोग कर प्राप्त दृश्यों फेफड़ों में दृश्य और सेल सेल बातचीत के quantitation, झिल्ली गतिशीलता और संवहनी छिड़काव सक्षम करें। हम आगे घएक छवि प्रसंस्करण तकनीक फेफड़ों microvasculature की एक अभूतपूर्व स्पष्ट विचार देता है कि खींचाना।

Introduction

उच्च संकल्प intravital इमेजिंग ऑप्टिकल कई जैविक प्रक्रियाओं, की अनुमति एकल कोशिका और उप सेलुलर मानकों को मापा और मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए समझने के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया है। कैंसर अनुसंधान में, ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के intravital इमेजिंग कई microenvironmental बातचीत 6-11 कि अक्षुण्ण जानवर में ही मौजूद हैं की खोज करने के लिए प्रेरित किया है।

विवो में एकल कक्ष संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग स्तन कैंसर में intravasation और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार के साथ जुड़े microenvironments खोजों के बारे में भी रोग का निदान और स्तन कैंसर के रोगियों 12-16 में उपचार के जवाब के लिए उपन्यास मार्करों के लिए प्रेरित किया है। सबसे अच्छा इमेजिंग तकनीक बरकरार आंतरिक महत्वपूर्ण अंगों के भीतर गहरे देखने के लिए उपलब्ध नैदानिक ​​तौर तरीकों (एमआरआई, पीईटी, सीटी) जो पूरे अंग के उत्कृष्ट विचारों की पेशकश और विकृतियों का पता चलता है पहले भी वे नैदानिक ​​लक्षण पैदा कर सकते हैं। वे असमर्थ हैं, जowever, एकल कोशिका संकल्प की कमी के कारण मेटास्टेसिस के शुरुआती दौर और सेलुलर तंत्र ट्यूमर प्रगति ड्राइविंग प्रकट करते हैं। समय से फेफड़ों के मेटास्टेसिस इन तौर-तरीकों में दिखाई दे रहे हैं, वे अच्छी तरह से स्थापित और proliferating हैं। अनुमान यह देखते हुए कि फैलाया ट्यूमर कोशिकाओं है कि फेफड़ों के लिए आ सकते हैं या तो 17 जीवित नहीं है या शुरू में निष्क्रिय रहने के 18, और अवलोकन है कि वे बहुत पहले से पहले अपेक्षा 19, इमेजिंग आगमन और अस्तित्व का जल्द से जल्द कदम पहुंचने का 90% करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है दूर साइटों पर मेटास्टेटिक बोने और ट्यूमर के विकास की पुनरावृत्ति करने की प्रक्रिया को समझने।

फेफड़ों में इन टिप्पणियों प्रदर्शन हालांकि बेहद मुश्किल साबित हो गया है; इमेजिंग अध्ययन के विशाल बहुमत के पूर्व vivo या explant तैयारियों 20-23, जो केवल एक समय बिंदुओं पर फेफड़ों में एक दृश्य देने का उपयोग किया है। इन तैयारियों उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैंrmation, वे बातचीत, कारण और प्रभाव के रिश्ते, और गतिशीलता है कि microenvironment के विभिन्न घटकों के बीच होने की पूरी समझ नहीं देते। एक उचित संचार प्रणाली (और homeostasis के सहवर्ती असंतुलन) और शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली के बाकी हिस्सों से वियोग की कमी के कारण यह इच्छुक निष्कर्ष है कि इन तैयारियों विवो में बरकरार ऊतकों में उत्पन्न मान्य करने के लिए बनाता है।

कई समूहों Wearn और जर्मन पहली फुफ्फुस परत 24 को बेनकाब करने के लिए शल्य चिकित्सा और टेरी पहले एक implantable इमेजिंग खिड़की 25 उपयोग करने के लिए किया जा रहा है के साथ बरकरार फेफड़ों 2,4,5,24-33 के intravital इमेजिंग प्रदर्शन किया है।

फेफड़ों में उच्च संकल्प इमेजिंग बहुत फेफड़ों के निरंतर गति से रुकावट है और कई तकनीकों इस सीमा को पार करने के लिए विकसित किया गया है। वैगनर और Filley 27 कुत्ते फेफड़ों की स्वाभाविक गति का अध्ययनऔर एक अपेक्षाकृत स्थिर क्षेत्र पर उनकी प्रत्यारोपित खिड़की का पता लगाने के लिए है जबकि वैगनर उसकी खिड़की शल्य चिकित्सा की तैयारी में वैक्यूम उपयोग किया ऊतक 28 स्थिर करने के लिए उनकी शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल बनाया गया है। श्वसनी clamping, अनुक्रमिक एपनिया और gated इमेजिंग, oversampled अधिग्रहण, फेफड़ों पालि और वैक्यूम 34 के gluing: उस समय के बाद से, तकनीक की एक किस्म की छवि के लिए सहित फेफड़ों उपयोग किया गया है। इनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान है और कोई भी तकनीक एक और 34 के रूप में बेहतर उभरा है। उदाहरण के लिए, श्वसनी clamping और अनुक्रमिक एपनिया फेफड़ों में गैसों के सामान्य विनिमय में परिवर्तन और श्वासरोध का कारण बन सकता है। Gated इमेजिंग और oversampled अधिग्रहण इन नुकसान से ग्रस्त नहीं है, लेकिन उच्च गति या विशेष इमेजिंग उपकरणों व्यापक रूप से सुलभ नहीं की आवश्यकता होती है। अंत में फेफड़ों के दोनों gluing और वैक्यूम तकनीक से ऊपर उल्लेख किया कमियों के दोनों बचने के लिए, लेकिन कतरनी बल प्रेरित चोट प्रदर्शन कर सकते हैं अगर ध्यान Tak नहीं हैएन। हाल के वर्षों में, निर्वात खिड़की छोटी किया गया है और confocal और multiphoton माइक्रोस्कोपी 4,5,33 और उत्कृष्ट उच्च संकल्प इमेजिंग का उपयोग चूहों में उपयोग के लिए अनुकूलित प्राप्त किया गया है 2। तालिका 1 इस समृद्ध इतिहास का सार है और उन कागजात जो उपन्यास का वर्णन पर प्रकाश डाला गया intravital इमेजिंग फेफड़ों खिड़कियों के उपयोग के क्षेत्र में प्रगति।

इस प्रोटोकॉल उच्चतम subcellular संकल्प के साथ जीना संभव बरकरार फेफड़ों में छवि मेटास्टेसिस के लिए विस्तृत समय व्यतीत हो जाने के multiphoton intravital माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन। छवियाँ एक multiphoton एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस और कई photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) डिटेक्टरों से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए 12 घंटे के लिए हासिल किया है। ट्रांसजेनिक माउस मॉडल फ्लोरोसेंट उच्च आणविक भार dextran और फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रांसफ़ेक्ट ट्यूमर कोशिकाओं (लेबल करने के लिए वाहिका और ट्यूमर कोशिकाओं respectivel के साथ fluorescently लेबल मूल निवासी मैक्रोफेज करने के लिए उपयोग किया जाता हैy)। fluorescently लेबल कोशिकाओं के इस चुनाव ट्यूमर सेल endothelial सेल-बृहतभक्षककोशिका बातचीत और गतिशीलता के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है, वहीं इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट या गैर फ्लोरोसेंट माउस के किसी भी तनाव के लिए काम करेंगे। अधिग्रहण के बाद, अवशिष्ट बहाव मोशन (अगर कोई है) लेबल हटाया गया घूम रक्त कोशिकाओं की वजह से चमकती समाप्त करने के लिए एक प्लगइन फिजी 35,36 और कस्टम मैक्रोज़ समय औसत संवहनी चैनल का उपयोग समाप्त हो रहा है।

इस प्रोटोकॉल इमेजिंग मेटास्टेसिस पर केंद्रित है, तकनीक कई अन्य जैविक फेफड़ों में उच्च संकल्प एकल कोशिका इमेजिंग के साथ नमूदार प्रक्रियाओं को लागू कर रहे हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं के दिशा निर्देशों और चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज द्वारा पूर्व अनुमोदन सहित कशेरुकी जीवों, के उपयोग के लिए नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया है।

1. जनरेटिंग fluorescently लेबल माउस मॉडल और ट्यूमर कोशिकाओं

  1. पीबीएस के 100 मिलीलीटर के साथ बीएसए की 0.1 ग्राम मिश्रण से 0.1% (w / v) गोजातीय सीरम albumin / फॉस्फेट बफर खारा (बीएसए / पीबीएस) बफर के 100 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. स्थिर अभिकर्मक द्वारा fluorescently लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार करें।
    नोट: यहाँ हम E0771-एलजी कोशिकाओं, E0771 माउस स्तन ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं को 37 कि C57BL / 6 माउस के फेफड़ों में विकसित metastatic ट्यूमर से अलग थे की एक अत्यधिक मेटास्टेटिक व्युत्पन्न नसों के पैतृक E0771 कोशिकाओं 38 इंजेक्शन के साथ उपयोग करें।
    1. अभिकर्मक पहले 24 घंटा, प्लेट 1 एक्स 10 antibio के 2 मिलीलीटर पर एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान पर 5 EO771-एलजी कोशिकाओंटिक मुक्त 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. अभिकर्मक के समय, कम सीरम मीडिया के 190 μl जोड़ने से पहले 30 मिनट के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 10 μl के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेक्टर के 2 माइक्रोग्राम सेते हैं।
    3. धो EO771-एलजी एक बार Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (डी पीबीएस) के साथ कोशिकाओं और अभिकर्मक मिश्रण धीरे जोड़ें।
    4. 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
    5. 2 2 दिनों के लिए (100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 10% FBS, 1mm पाइरूवेट,) पूरा DMEM के मिलीलीटर में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और संस्कृति को धो लें।
    6. बाँझ पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो 0.25% trypsin EDTA के 500 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. सेल निलंबन लीजिए और पूरा DMEM के कम से कम 1 मात्रा के साथ मिश्रण और कम 280 x जी नीचे स्पिन।
    8. पूरा DMEM के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और में सेल संस्कृति का विस्तारएक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान।
    9. एक सप्ताह के लिए पूरा DMEM और संस्कृति के 8 मिलीलीटर G418 चयनात्मक एंटीबायोटिक के 700 माइक्रोग्राम / एमएल जोड़ने, मध्यम बदलने हर तीन दिन से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के चयन की शुरुआत करें।
  3. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं है कि प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) 39,40 से G418 में चयन के तहत किया गया है से फ्लोरोसेंट आबादी को समृद्ध।
    1. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और 1.5 0.25% की मिलीलीटर trypsin जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं और पूरा DMEM के कम से कम एक मात्रा के साथ मिश्रण।
    3. सेल निलंबन लीजिए और 280 XG पर नीचे स्पिन और बाँझ 0.1% की 1 एमएल (w / v) बीएसए / पीबीएस बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    4. एक 40 माइक्रोन जाल के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर और छँटाई के लिए 0.1% BSA / पीबीएस बफर के साथ 1 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें।
    5. 10% प्रतिभाशाली आबादी FACS सॉर्टर 41 का उपयोग कर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के आधार पर FACS-तरह।
    6. एक सप्ताह यू के लिए संस्कृति हल कोशिकाओंnder चयन (पूरा DMEM में 700 माइक्रोग्राम / एमएल G418)।
    7. cytometry कदम 1.3.6 के लिए 1.3.1 दोहरा एक बार फिर से प्रवाह से fluorescently लेबल कोशिकाओं फिर से चुनें।
    8. के रूप में (कदम 1.3.1-1.3.4) में वर्णित चयन, Trypsinize, फिल्टर और एक दूसरे दौर के बाद 0.1% बीएसए / पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एकल कक्ष 96 अच्छी तरह प्लेटें FACS सॉर्टर का उपयोग करने में छँटाई के लिए 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता को समायोजित करें।
    9. संग्रह के लिए पूर्ण DMEM के 100 μl के साथ 3-5 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें। छंटाई के बाद अस्तित्व में सुधार करने के लिए, बर्तन जहां EO771-एलजी कोशिकाओं 42 बड़े हो रहे थे से फ़िल्टर संस्कृति के माध्यम से 100 μl जोड़ें।
    10. 96 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं छँटाई करने के बाद 2 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं वापसी (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
    11. 5x बढ़ाई एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा से व्यवहार्य एकल क्लोन के साथ कुओं को पहचानें।
    12. Trypsinize और व्यवहार्य क्लोन का विस्तार और बैकअप के लिए कोशिकाओं फ्रीज।
      1. जीआर के साथ कुओं धोबाँझ पीबीएस के 100 μl के साथ क्लोन कारण। 0.25% w / v trypsin के 50 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट सेते हैं। पूरा DMEM के 50 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 280 XG पर नीचे स्पिन करने के लिए बाँझ वी के नीचे या गोल नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के लिए स्थानांतरण।
      2. 700 माइक्रोग्राम / एमएल G418 पूरा DMEM के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं और 12 अच्छी तरह प्लेटों में प्रत्येक क्लोन थाली। G418 और संस्कृति मिला हुआ है जब तक साथ पूरा DMEM के 400 μl जोड़ें।
      3. पीबीएस के 500 μl के साथ कुओं धो 0.25% trypsin के 100 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट सेते हैं। पूरा DMEM के 100 μl जोड़ें और कम 280 x जी 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन। मिला हुआ है जब तक 6 अच्छी तरह प्लेटें में G418 और प्लेट कोशिकाओं के साथ पूरा DMEM के 100 उल में कोशिकाओं Resuspend।
      4. एक बार मिला हुआ, Trypsinize कोशिकाओं, नीचे स्पिन और FBS में 10% DMSO में resuspend सेल के शेयरों फ्रीज करने के लिए।
      5. उनकी मेटास्टेटिक क्षमता के मूल्यांकन के लिए 100 मिमी टिशू कल्चर बर्तन में उन्हें चढ़ाना द्वारा संस्कृति में सेल निलंबन के 1/10 रखें।
  4. चुने गए क्लोन के metastatic क्षमता का परीक्षण करें।
    1. Trypsinize और 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए खारा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और पूंछ नस के माध्यम से नसों C57BL / 6 चूहों में 200 μl इंजेक्षन।
    2. 2 सप्ताह के बाद, जैसा कि पहले 23 में वर्णित फेफड़े के ऊतकों को इकट्ठा करने और सतह गिनती या stereological विधि 43 से ट्यूमर बोझ यों। intravital इमेजिंग के लिए उच्च क्षमता के साथ मेटास्टेटिक क्लोन का चयन करें।
  5. MacBlue (एक माइलॉयड विशिष्ट प्रमोटर ड्राइविंग सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) अभिव्यक्ति (Csf1r -GAL4VP16 / यूएएस ECFP 16)) संवाददाता चूहों 44 उठाएँ।
    नोट: आमतौर पर, 8 और 12 सप्ताह के बीच चूहों का इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन के रूप में जल्दी के रूप में 7 और 20 के रूप में देर के रूप में सप्ताह के रूप में अच्छी तरह से काम करने के लिए परीक्षण किया गया है चूहों।

2. Multiphoton माइक्रोस्कोप सेट अप और इमेजिंग तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल के किसी भी मीटर पर किया जा सकता हैultiphoton माइक्रोस्कोप, डेटा इस प्रोटोकॉल में दिखाया प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली विस्तार 45 में पहले से वर्णित किया गया है।

  1. दो photon लेजर और डिटेक्टरों में कम से कम एक घंटे के वांछित इमेजिंग समय से आगे सहित सभी माइक्रोस्कोप और लेजर घटकों पर मुड़ें।
  2. बस सर्जरी से पहले, सिर्फ माइक्रोस्कोप से पहले किरण पथ में ऑप्टिकल बिजली मीटर के सिर रखकर माइक्रोस्कोप के लिए प्रकाश इनपुट की शक्ति को मापने और 880 एनएम पर अधिकतम प्रकाश की तीव्रता तक लेजर अंत गुहा दर्पण knobs समायोजित पर पढ़ा जाता है ऑप्टिकल बिजली मीटर।

3. वैक्यूम सिस्टम सेट अप

  1. इमेजिंग खिड़की (पूरक चित्रा 1) cyanoacrylate साथ में coverslip गोंद। गोंद के लिए पूरी तरह से सूखे के लिए कम से कम 4 घंटा की अनुमति दें।
    नोट: यह कदम भी समय से आगे किया जा सकता है।
  2. छोटे से खोलने से पहले लाइन पर 100 μl विंदुक टिप कट और पतली वी के लिए काटा हुआ अंत कनेक्टacuum नली।
  3. चित्रा 1 और पूरक चित्रा 2 के अनुसार वैक्यूम सिस्टम से कनेक्ट।
  4. पर निर्वात और खुले अंत अवरुद्ध साथ, <3 आईएनएचजी के लिए वैक्यूम नियामक समायोजित करें।
    नोट: वैक्यूम स्तर के अंतिम समायोजन विवो में वाहिका के अवलोकन के द्वारा प्रदर्शन किया जाएगा।
  5. इमेजिंग प्लेट इमेजिंग थाली से दूर बुरे होकर ऑब्जेक्टिव लेंस से विसर्जन मध्यम रोकने के लिए नीचे करने के लिए पेट्रोलियम तेल की एक पतली फिल्म लागू करें।
  6. खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग प्लेट रखें।
    नोट: कस्टम इमेजिंग प्लेट (पूरक चित्रा 3) 1/8 के एक पत्रक है "मोटी एल्यूमीनियम machined दोनों चरण डालने अंतरिक्ष में फिट और इमेजिंग खिड़की के आयोजन के लिए केंद्र में एक छेद के माध्यम से हुआ।
  7. नीचे coverslip के साथ इमेजिंग थाली में वैक्यूम खिड़की डालें।
  8. सभी सतहों जीवाणुरहित और उपकरणों इमेजिंग चरण प्लेट सहित, और इमेजिंग जीत70% इथेनॉल के साथ डॉव।
  9. वैक्यूम खिड़की करने के लिए विंदुक टिप की कटौती अंत कनेक्ट और इमेजिंग प्लेट के नीचे नली टेप।
  10. इमेजिंग खिड़की करने के उद्देश्य करीब लाने और उद्देश्य और coverslip के बीच पानी का एक बड़ा बूंद जगह है।
  11. सुनिश्चित करें वैक्यूम खिड़की के केंद्रीय उद्घाटन अवरुद्ध और पुष्टि है कि उद्देश्य और coverslip के बीच पानी की बूंद aspirated नहीं मिलता द्वारा coverslip से कोई लीक कर रहे हैं।
    नोट: एक पुरानी शैली कंप्यूटर माउस गेंद खिड़की पर रखा केंद्रीय उद्घाटन रोकने के लिए उपयोगी है।

4. सर्जरी

  1. बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें।
    1. आसान पहुंच के भीतर सभी उपकरणों रखें। सभी सतहों और शल्य चिकित्सा के क्षेत्र, और 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा उपकरण सहित उपकरणों जीवाणुरहित।
  2. एक डबल गाँठ के साथ झाड़ी से ऊपर कैथेटर को 2-0 सीवन के एक 3 इंच की लंबाई टाई, ¼ इंच।
  3. पूंछ नस कैथेटर fol तैयारHarney एट अल। 46 द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल lowing।
  4. एक अवरक्त (आईआर) गर्मी दीपक का उपयोग करना, अपने पिंजरे में पशु गर्म के लिए ~ 5 मिनट पूंछ नस में रक्त के प्रवाह को बढ़ाने के लिए और कैथेटर प्रविष्टि में सहायता करने के लिए। यह पशु शल्य प्रक्रिया या तो एक गर्मी दीपक या एक वार्मिंग पैड का उपयोग कर भर शारीरिक तापमान को गर्म रखने के लिए सिफारिश की है।
  5. 5% isoflurane के साथ पशु anesthetize और सत्यापित करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं है।
  6. जानवर की आंखों को नेत्र मरहम लागू करें।
  7. पशु के बाईं ओर से बाल हटाने के लिए 10-30 सेकंड के लिए लोमनाशक लोशन लागू करें; पीठ के एक चौथाई के लिए छाती के midline से और करने के लिए बगल से सिर्फ ribcage के तहत।
  8. किसी भी अतिरिक्त लोशन स्वच्छ और 70% शराब के साथ संपर्क में त्वचा बाँझ।
  9. एक बाँझ पूंछ नस कैथेटर के लिए पीबीएस के साथ भरा सिरिंज देते हैं और Harney एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद डालने और जगह में टेप। 46। सुनिश्चित करें कि टेप को सुरक्षित सुई खुद का पालन किया और पूंछ और टेप के बीच की खाई में मुक्त नहीं है सुनिश्चित करें।
  10. निम्न या तो दास एट अल। 47 से या DuPage एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल माउस intubate। 48
  11. वेंटीलेटर पर मुड़ें और यह सेट प्रति मिनट 135 साँस और isoflurane ऑक्सीजन के मिश्रण के 200 μl आपूर्ति करने के लिए।
  12. वेंटीलेटर की सांस की नली कैथेटर कनेक्ट करें।
  13. शल्य चिकित्सा क्षेत्र के लिए माउस ले जाएँ। कैथेटर को बेदखल करने के लिए नहीं अत्यधिक ध्यान रखना।
  14. सामने दांत के नीचे माउस के थूथन के आसपास 2-0 सिवनी बाँधो।
  15. थूथन करने के लिए कैथेटर टेप।
  16. कैथेटर के लिए छोड़ दिया forelimb टेप यह शल्य चिकित्सा क्षेत्र से बाहर रखने के लिए।
  17. 2.5% की एक रखरखाव स्तर पर isoflurane संज्ञाहरण लोअर और सत्यापित एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं है।
  18. तेज कैंची का प्रयोग, बाएं सीने दीवार के ऊपर त्वचा की 1 सेमी 2 को हटा दें।
  19. लिफ्ट टीवह वसा पैड स्तन और दाग़ना कलम के साथ किसी भी उजागर रक्त वाहिकाओं दाग़ना।
  20. तेज कैंची से काटने से वसा पैड बांटना।
  21. तेज कैंची से काटने से रिब पिंजरे के नीचे हटाये पेशी परत। देखभाल forelimb के आधार पर कक्षा नस चल कटौती नहीं ले लो।
  22. हड़पने के लिए और 6 वें रिब उठाने के लिए संदंश का प्रयोग करें। एक उथले कोण पर आयोजित तेज कैंची का उपयोग (~ 5 °) त्वचा में खोलने के किनारे के पास पसली काटा। चरम देखभाल के संपर्क में फेफड़े के ऊतकों को नहीं छू लो।
  23. छाती दीवार में खोलने चौड़ा लगातार चार पसलियों को हटाने के द्वारा पूरे फेफड़ों पालि बेनकाब करने के लिए।
    नोट: उरोस्थि से कम से कम 5 मिमी दूर उद्घाटन रखें दिल से बचने के लिए।
  24. ध्यान से पूंछ और सांस की नली कैथेटर लोभी द्वारा माउस उठा और माइक्रोस्कोप इमेजिंग चरण के लिए माउस ले जाएँ।
  25. वैक्यूम बंद के साथ, पीबीएस के साथ वैक्यूम खिड़की के चैंबर भरें।
  26. माउस पलटना और उजागर की स्थितिवैक्यूम इमेजिंग खिड़की पर फेफड़ों।
  27. धीरे-धीरे गेंद वाल्व का उपयोग पारा के लगभग 3-5 इंच के लिए वैक्यूम पर बारी।
  28. एक निरोधक टिशू पेपर माउस और मंच थाली करने के लिए टेप के सीने पर दो बार आधे में मुड़ा का बना दोहन के रूप में पूरक चित्रा 2 में दिखाया रखें।
  29. पशु की जांघ के ऊपरी हिस्से को पल्स oximeter की जांघ सेंसर घड़ी और सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं।
  30. मंच पर पर्यावरण कक्ष प्लेस और एक शारीरिक तापमान पर माउस बनाए रखने के लिए गर्मी पर बारी।
  31. संज्ञाहरण बनाए रखने और रक्त प्रवाह को बनाए रखने के लिए 1-1.5% isoflurane के स्तर को कम।

5. intravital इमेजिंग

  1. coverslip करने के लिए पास 25 x 0.95 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य लेंस ले आओ और उन दोनों के बीच पानी की एक बड़ी गिरावट जोड़ें।
  2. epifluorescence मोड का उपयोग करना, FITC चैनल देखने और ध्यान में फेफड़े के ऊतकों को ले आओ।
  3. यदि नहीं सर्जरी से पहले किया, मैंपूंछ नस कैथेटर के माध्यम से nject ट्यूमर कोशिकाओं।
    1. पूंछ नस कैथेटर से पीबीएस सिरिंज डिस्कनेक्ट।
    2. ट्यूमर सेल निलंबन (पीबीएस अधिकतम 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल) के 100 μl के साथ एक बाँझ सिरिंज लोड।
      नोट: यह कदम अग्रिम में किया जा सकता है अलग अलग समय बिंदुओं पर फेफड़ों के कैंसर सेल आगमन अध्ययन करने के लिए।
    3. पूंछ नस कैथेटर पर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सिरिंज कनेक्ट।
    4. धीरे धीरे पूंछ नस में ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन।
    5. पूंछ नस कैथेटर से ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सिरिंज डिस्कनेक्ट।
    6. पूंछ नस कैथेटर को पीबीएस सिरिंज कनेक्ट करें।
      नोट: dextran इंजेक्शन लगाने के रूप में यह इंजेक्शन के बाद आंख के माध्यम से dextran संकेत से ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए मुश्किल हो जाता है इससे पहले कि ट्यूमर कोशिकाओं के सभी स्थानों की पहचान की।
  4. छवि को ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाएँ
    1. व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं इमेजिंग के लिए, सभी ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने और वें के साथ अपने स्थानों रिकॉर्डसॉफ्टवेयर की ई बहु पैनल।
      1. माइक्रोस्कोप आंख में ट्यूमर कोशिकाओं को देख कर छवि को देखने के सभी क्षेत्रों का पता लगा।
      2. सॉफ्टवेयर में, मल्टी प्वाइंट बटन पर क्लिक करके बहु पैनल के लिए स्विच और स्थिति को जोड़ने बटन पर क्लिक करके सेल के स्थान की दुकान।
    2. पच्चीकारी इमेजिंग के लिए, पच्चीकारी की उत्पत्ति का पता लगाने और इमेजिंग निर्देशांक सेट
      1. संरचना के ऊपरी बाएँ कोने में एक स्थिति का पता लगाने पर कब्जा कर लिया जा सकता है।
      2. शून्य चरण नियंत्रक पर "शून्य" बटन धक्का द्वारा मंच के एक्स, वाई और जेड निर्देशांक।
      3. "लोड" बटन पर क्लिक करें और सूची का चयन करके पच्चीकारी निर्देशांक की उचित सूची अप लोड।
        नोट: देखने के एक 500 माइक्रोन क्षेत्र के एक 20% ओवरलैप के साथ एक 2 x 2 पच्चीकारी के लिए एक उदाहरण सूची होगी: Pos.1 = (0,0), स्थिति। 2 = (400,0), स्थिति। 3 = (0.400), स्थिति। 4 = (400.400)।
  5. सिरिंज डब्ल्यू हटायेपूंछ नस कैथेटर में पीबीएस ith और dextran युक्त सिरिंज के साथ बदलें।
  6. धीरे धीरे लाइन फ्लश करने के लिए बाँझ पीबीएस के 50 μl इंजेक्शन लगाने के द्वारा पीछा / एमएल 155 केडीए rhodamine-dextran पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से माउस में पीबीएस में भंग 20 मिलीग्राम के 100 μl अप करने के लिए इंजेक्षन। लाइन में किसी भी बुलबुले परिचय नहीं है। जब आवश्यक हो, dextran कैंसर सेल इंजेक्शन के बाद कम से कम एक घंटे के इंजेक्षन तो यह है कि कुल मात्रा माउस को दिलाई 4 मिलीग्राम / किलो / घंटा से अधिक नहीं है।
  7. इमेजिंग पैरामीटर सेट करें।
    1. multiphoton मोड के लिए स्विच माइक्रोस्कोप।
    2. समय का संकेत बटन पर क्लिक करके और जूम कारक क्षेत्र अद्यतन करने 2X का एक पहलू को जूम सेट करें।
    3. लेजर शक्ति को समायोजित करने ~ 10% (~ नमूना पर 10-15 मेगावाट) डिटेक्टरों और लेजर बटन पर क्लिक करें और उसके बाद 10 सुनामी पावर स्लाइडर का समायोजन करके।
  8. छवि प्रत्येक स्थान ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने और प्रवाह और vascu की अखंडता कल्पना करने के लिएlature।
    नोट: वेसल्स पूरी तरह से बह एरिथ्रोसाइट्स के साथ perfused प्रकट करना चाहिए और फ्लोरोसेंट dextran extravascular रिक्त स्थान के लिए रिसाव के बिना वाहिकाओं के भीतर समाहित किया जाना चाहिए। लगभग 10 - 20 ट्यूमर कोशिकाओं वैक्यूम खिड़की के स्पष्ट एपर्चर के भीतर होने की उम्मीद कर रहे हैं।
  9. प्रत्येक स्थान के शुरुआती गहराई को समायोजित imaged किया जा।
    1. प्रत्येक स्थान के लिए, छवि के लिए ट्यूमर सेल के शीर्ष टुकड़ा चरण नियंत्रक पर ध्यान केंद्रित घुंडी घूर्णन द्वारा Z स्थिति को समायोजित।
    2. देखने के क्षेत्र के केंद्र में सेल की स्थिति।
    3. बहु बटन पर क्लिक करें, यह प्रकाश डाला और जोड़ने, हटाने बटन के बाद क्लिक बहु सूची में सेल की संग्रहीत स्थिति को बदलने के लिए करने के लिए देखने के क्षेत्र की स्थिति पर क्लिक करें।
    4. दिखने में प्रत्येक स्थिति में ट्यूमर सेल के रिश्तेदार चमक निरीक्षण करते हैं।
  10. बहु पैनल एक में सहेजें बटन पर क्लिक करके कोशिकाओं में से प्रत्येक के नए स्थानों को बचानेएक फ़ाइल नाम निर्दिष्ट घ।
  11. व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए, लगभग बराबर चमक के तीन कक्षों लेने के लिए और सूची में उनके स्थान पर क्लिक करें और फिर हटाएँ बटन पर क्लिक करके बहु सूची से अन्य सभी स्थानों को हटाना।
  12. डिटेक्टरों और लेजर बटन पर क्लिक करें और हरे और लाल चैनलों 45 इसलिए की पीएमटी लाभ है कि संकेतों संतृप्ति नीचे हैं के लिए स्लाइडर्स समायोजित करें।
  13. नीले चैनल 45 इसलिए कि मैक्रोफेज सियान दिखाई के लिए स्लाइडर को समायोजित करें।
    नोट: किसी भी दूसरे हार्मोनिक संकेत ही नीले चैनल में दिखाई देगा और चैनल घटाव प्रक्रिया का पालन करके सियान मैक्रोफेज से अलग किया जा सकता है कि पहले 45 में वर्णित है।
  14. 0 माइक्रोन के लिए z ढेर प्रारंभ गहराई और क्रमशः स्थान पर जेड चरण चलती है और प्रारंभ पर क्लिक करके और समाप्ति बटन द्वारा 24 माइक्रोन के लिए अंत गहराई सेट करें।
    नोट: इस गहराई के भीतर कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छा संकेत के साथ कल्पना की जाएगीशोर और संकल्प।
  15. 3 माइक्रोन के लिए जेड कदम आकार सेट करें।
  16. निम्नलिखित मानकों इमेजिंग पैरामीटर पहले से वर्णित 45,49 सेट करें।
    1. व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए, समय का संकेत बटन क्लिक करें और फिर जूम कारक क्षेत्र (1.5X जूम कारक के बराबर), फ्रेम का औसत क्षेत्र में 3 दर्ज करें और समय चूक बटन पर क्लिक करें और 10 में प्रवेश में 4 वी दर्ज समय चूक क्षेत्र में।
      नोट: ये सेटिंग्स 1 फ्रेम हर 3 सेकंड का अधिग्रहण करेगी।
    2. पच्चीकारी इमेजिंग के लिए, समय का संकेत बटन पर क्लिक करें और (4X जूम कारक के बराबर) 1.5 वी के एक जूम कारक दर्ज फ्रेम औसत की संख्या में 3 में प्रवेश और समय चूक बटन पर क्लिक करें और समय में 10 दर्ज चूक के समय में देरी क्षेत्र।
      नोट: ये सेटिंग्स 1 फ्रेम हर 3 सेकंड का अधिग्रहण करेगी।
  17. बहु, जेड ढेर और उनके बटन पर क्लिक करके टी चूक इमेजिंग मोड सक्षम करें।
  18. छवियों को प्राप्त करने के लिए रिकॉर्ड बटन दबाएँ।
    नहींई: फेफड़े के ऊतकों बहुत ही नाजुक और तस्वीर क्षति की संभावना है। अन्य क्षेत्रों की तो बाद समय चूक इमेजिंग रक्त प्रवाह imaged क्षेत्र में बंद हो जाता है, लेजर सबसे अधिक संभावना बहुत अधिक है और बाद इमेजिंग शक्ति कम से कम किया जाना चाहिए।
  19. हर 30-45 मिनट, धीरे-धीरे पशु के जलयोजन बनाए रखने के लिए पीबीएस या खारा के 50 μl इंजेक्षन।

6. इच्छामृत्यु

  1. 5% isoflurane बढ़ाएँ।
  2. 30 सेकंड तक 5% isoflurane के तहत पशु रखें यह साँस लेने और मंच से पशु को दूर करने के लिए रहता है के बाद।
  3. पूरा इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करना।

7. छवि विश्लेषण

  1. एकल कक्ष इमेजिंग प्रयोगों के लिए:
    1. फिजी में छवियों को लोड और उन्हें एक Hyperstack के रूप में प्रारूप।
    2. Hyperstack में प्रत्येक Z-टुकड़ा के लिए, समय चूक फिल्म खेलते हैं और अवशिष्ट XY आंदोलन के लिए लग रही है। अगर अवशिष्ट XY आंदोलन पाया जाता है, को ढेर करने के लिए प्लगइन StackReg 36 बुलाया लागूआंदोलन को समाप्त।
  2. पच्चीकारी इमेजिंग प्रयोगों के लिए:
  3. फिजी में छवियों को लोड और ऐसे निर्देशिका, फ़ाइल आधार नाम, पच्चीकारी में एक्स और वाई क्षेत्रों की संख्या और संख्या के रूप में मूसा की सिलाई मैक्रो (पूरक कोड फ़ाइल मूसा की सिलाई) और प्रवेश जानकारी छवियों के बारे में खोलने के द्वारा उन्हें एक साथ सिलाई स्लाइस और समय अंक की।
    नोट: कैसे जावा निर्देशिका की व्याख्या के कारण, फ़ोल्डर नाम सबफ़ोल्डर विभाजक के रूप में दो बैकस्लैश होना चाहिए। निर्मित में प्लगइन जोड़ो सिलाई में सीमाओं के कारण, बेस फाइल के नाम किसी भी डैश शामिल नहीं करना चाहिए।
  4. वाहिका की सीमाओं की एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्राप्त करने के लिए, एक साथ एक ही छवि में रक्त चैनल के लिए समय सभी बिंदुओं के औसत और फिर दूसरे चैनलों की फिल्म की प्रत्येक फ्रेम के लिए पृष्ठभूमि के रूप में इस छवि को दोहराने।
    नोट: यह बस रक्त औसत का प्रदर्शन करना मैक्रो चलाकर किया जाता है (पूरक कोड फ़ाइल रक्त औसत का प्रदर्शन)।

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Representative Results

परिणाम है कि इस विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता है के प्रकार का प्रदर्शन करने के लिए, हम E0771-एलजी ट्यूमर कोशिकाओं को सर्जरी से पहले समय अंक में अलग MacBlue चूहों 44 की पूंछ नस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन तिपतिया घास के साथ लेबल इंजेक्शन। सर्जरी के बाद, 155 केडी rhodamine लेबल dextran चतुर्थ चिह्नित करने के लिए वाहिका और समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन किया गया था इंजेक्ट किया गया था।

चूहों 24 घंटे बाद इंजेक्शन जब इमेजिंग, एकल कक्षों मैक्रोफेज और monocytes के साथ बातचीत के वाहिका के अंदर दिखाई दे रहे हैं। इस का एक उदाहरण चित्रा 2A (पूरक मूवी 1) में दिखाया गया है। यहाँ एक एकान्त ट्यूमर सेल (हरा) 12 माइक्रोन गहरी फेफड़ों वाहिका में दर्ज कराई की एक ऑप्टिकल खंड 5 घंटा और 20 मिनट से अधिक imaged के रूप में यह क्षणिक निवासी मैक्रोफेज (सियान) के साथ सूचना का आदान प्रदान किया जाता है। Vasculature उच्च आणविक भार dextran द्वारा लेबल है। की स्थिरताइमेजिंग ऐसी है कि क्षेत्र के अनुक्रमिक Z ढेर इमेजिंग हासिल किया जा सकता है और एक 3 आयामी पुनर्निर्माण (चित्रा 2 बी, पूरक मूवी 2) बनाया जा सकता है।

पच्चीकारी इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के उपयोग को देखने के एक ही क्षेत्र से भी बड़ा संरचनाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 एक भी मेटास्टेटिक घाव के अधिग्रहण को दर्शाता है, 12 दिनों के इंजेक्शन के बाद। फेफड़ों की सतह के नीचे और 25 माइक्रोन (चित्रा 3 ए, सही पैनल), इस 5 एक्स 5 मूसा की एक 890 माइक्रोन 15 पर 205 मिनट से अधिक देखने के क्षेत्र (पूरक मूवी 3 चित्रा 3 ए, पैनल छोड़ दिया है) से पता चलता। दृश्य के बड़े क्षेत्र के बावजूद, मूसा की रचना अंतर्निहित फ्रेम के उच्च संकल्प के रूप में गुणसूत्र जुदाई (चित्रा 3 बी, पूरक इसका सबूत इस तरह के एक एकल कोशिका का बँटवारा के रूप में subcellular घटनाओं का कब्जा सक्षम बनाता हैमूवी 4)।

एक उच्च आणविक भार के Intravascular इंजेक्शन fluorescently संवहनी लुमेन की लेबलिंग में dextran परिणाम लेबल, हालांकि घूम एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स dextran रोक देना लेबल नहीं किया गया। फेफड़ों के छोटे केशिकाओं में रोड़ा dextran संकेत के एक चमकती में पूरा जिसके परिणामस्वरूप और वाहिका सीमाओं की परिभाषा का एक नुकसान (; पूरक मूवी 5 चित्रा 4, बाएं) है। उच्च स्थानिक इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की स्थिरता, रक्त चैनल के समय औसतन अनुमति देता धुंधला इस प्रकार अस्थायी अवरोध बहाल करने, बिना। अन्य संकेत चैनलों तो पोत सीमाओं (; पूरक मूवी 6 चित्रा 4, दाएं) की एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए वाहिका पर मढ़ा जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। निर्वात प्रणाली के लेआउट घर निर्वात का उपयोग किया और एक निर्वात नियामक के साथ परिभाषित स्तर के लिए निर्धारित है। एक पर कब्जा कुप्पी शारीरिक तरल पदार्थ से नियामक और निर्वात प्रणाली के संक्रमण से बचाता है। एक पतली लचीला ट्यूब एक विंदुक टिप में कटौती करने के लिए वैक्यूम बता देते हैं इमेजिंग खिड़की के निर्वात पोर्ट में फिट करने के लिए। इमेजिंग खिड़की इमेजिंग प्लेट माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस के लिए सम्मान के साथ अपने स्थितीय स्थिरता बनाए रखने में एक recessed नाली में फिट है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: फेफड़े में सिंगल सेल इमेजिंग (ए) अभी भी फेफड़ों की केशिका बिस्तर में एक ही ट्यूमर सेल का एक समय चूक फिल्म से पूंछ नस के बाद 24 घंटे।इंजेक्शन। (लाल = रक्त वाहिकाओं, ग्रीन = ट्यूमर कोशिकाओं, सियान = मैक्रोफेज) (बी) के स्थिर इमेजिंग समय के साथ इमेजिंग डेटा के तीन आयाम पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। रक्त वाहिकाओं किया गया है समय स्पष्टता के लिए औसत। (लाल = रक्त वाहिकाओं, ग्रीन = ट्यूमर कोशिकाओं, ब्लू = मैक्रोफेज)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: फेफड़े की स्थिरता उच्च संकल्प, देखें इमेजिंग के बड़े क्षेत्र फेफड़े में अनुक्रमिक अधिग्रहण और सिलाई द्वारा एकाधिक कम बढ़ाई फील्ड्स के साथ में अनुमति देता है (ए) की दृष्टि से एक 890 माइक्रोन क्षेत्र दिखा 5 एक्स 5 मूसा की। फेफड़ों में एक मेटास्टेटिक घाव 12 दिनों के फेफड़ों की सतह के नीचे 15 माइक्रोन में लिया ट्यूमर कोशिकाओं की पूंछ नस इंजेक्शन के बाद(बाएं पैनल)। राइट पैनल फेफड़ों की सतह के नीचे 25 माइक्रोन से ही मेटास्टेटिक घाव से पता चलता है। (बी) के अलग-अलग उच्च संकल्प क्षेत्रों में इस तरह के गुणसूत्र संरेखण (पीले तीर) और जुदाई (लाल तीर) कोशिका विभाजन के दौरान के रूप में subcellular प्रक्रियाओं प्रकट करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Fluorescently की Intravascular इंजेक्शन लेबल उच्च आणविक भार dextran मार्क्स vasculature की लुमेन छोड़कर जब बिना लेबल वाले एरिथ्रोसाइट्स और अन्य घूम कोशिकाओं एक अधूरी लेबलिंग जो एक चमकती प्रभाव obscuring में जिसके परिणामस्वरूप समय में चालों में प्रतिदीप्ति संकेत (ए) आड़ परिणाम रोक देना। पोत सीमाओं। (बी) के उच्चवैक्यूम खिड़की के स्थानिक स्थिरता रक्त चैनल समय के औसत, अस्थायी अवरोध में भरने और स्पष्ट रूप से पोत सीमाओं को परिभाषित करने की अनुमति देता है। अन्य चैनलों तो औसत के बिना मढ़ा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

साल पहले लेखक / अंतिम लेखक जानवर सर्जरी इमेजिंग के प्रकार टिप्पणियाँ
1926 Wearn और जर्मन बिल्ली की छाती दीवार फुफ्फुस परत के नीचे से काट दिया। दूसरा उद्घाटन रोशनी के लिए फुस्फुस के लिए नीचे डायाफ्राम के माध्यम से किया। उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी। फुफ्फुस दीवार के माध्यम से पहली "खिड़की"।
1939 टेरी बिल्ली की पसलियों में अलग हो रहे हैं, 1। खिड़की प्रत्यारोपित, हवा वैक्यूम के साथ छाती से हटा दिया। दूरबीन और त्वचा माइक्रोस्कोप ध्रुवीकृत रोशनी का उपयोग कर। पहले ऑप्टिकल खिड़की प्रत्यारोपित। खेतों में वैक्यूम खिड़की करने के लिए आकर्षित करने के लिए ऊतक।
1963 डी अल्वा और रेनर खरगोश और कुत्तों एक या दो पसलियों उच्छेदन और 1 में। खिड़की डाला और छाती दीवार के लिए sutured। त्वचा की खिड़की और चंगा करने के लिए अनुमति दी जानवर पर बंद कर दिया गया था। इमेजिंग से पहले, त्वचा खिड़की बेनकाब करने के लिए विच्छेदित किया गया था। एक कम पत्रिका (11X) उद्देश्य के माध्यम से खेतों में उच्च गति stroboscopic छायांकन। सबसे पहले अस्तित्व खिड़की।
1965 वैगनर और Filley कुत्ते की सही forelimb हटा दिया, एक पसली में कटौती और खिड़की डाला जाता है और sutured। 22X उद्देश्य के साथ प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी। पहले वैक्यूम बिना अपेक्षाकृत गति मुक्त खिड़की।
वैगनर कुत्ते की एक पसली में resected है, 3। खिड़की प्रत्यारोपित। खिड़की पर पिरोया निकला हुआ शिकंजा छाती दीवार से सील के रूप में। उच्च बढ़ाई 100X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी। सबसे पहले खिड़की निर्वात का उपयोग करने के लिए ऊतक आंदोलन को स्थिर करने के लिए।
1992 Groh और Goetz खरगोश एक पसली में उच्छेदन, 1.2। खिड़की प्रत्यारोपित। खिड़की पर पिरोया निकला हुआ शिकंजा छाती दीवार से सील के रूप में। वैक्यूम लागू होता है। 25X उद्देश्य के साथ epifluorescent माइक्रोस्कोपी। epifluorescence के साथ एक निर्वात खिड़की का पहला प्रयोग।
1994 Fingar और Wieman चूहे 2 पसलियों में उच्छेदन, 1। खिड़की प्रत्यारोपित और छाती दीवार और त्वचा के लिए sutured। 40x उद्देश्य के साथ epifluorescent माइक्रोस्कोपी। चूहों में सबसे पहले अस्तित्व खिड़की।
2000 FunakOshi और मित्सुई चूहे पूरी छाती दीवार हटा दिया। वैक्यूम सक्शन अंगूठी सही फेफड़ों से जुड़ी। एक 20x उद्देश्य के साथ confocal माइक्रोस्कोपी। चूहों में वैक्यूम खिड़की का पहला प्रयोग।
2005 Lamm और Glenny चूहे पूरी छाती दीवार में हटा दिया, 1। खिड़की फेफड़ों से जुड़ी। परावर्तन और एक 20x उद्देश्य के साथ epifluorescent माइक्रोस्कोपी। चूहों में वैक्यूम खिड़की का पहला प्रयोग।
2008 Tabuchi और Keubler चूहे 3 पसलियों उच्छेदन, प्लास्टिक की फिल्म खोलने के लिए आवेदन किया छाती दीवार में छेद सील करने के लिए। एयर intrapleural कैथेटर के माध्यम से हटा दिया। 20X उद्देश्य के साथ epifluorescent माइक्रोस्कोपी। प्लास्टिक की फिल्म का उपयोग करने के लिए सबसे पहले छाती दीवार में खोलने सील करने के लिए।

तालिका 1: गतिविधियों के ऐतिहासिक सर्वेक्षणintravital इमेजिंग फेफड़े Windows के opment। कई उपन्यास intravital इमेजिंग फेफड़ों खिड़कियों सबसे हाल ही में चूहों में उपयोग के लिए छोटी किया जा रहा है, ऊतक स्थिरीकरण के लिए वैक्यूम रोजगार और पर्याप्त उच्च संकल्प को प्राप्त subcellular विस्तार से खुलासा करने में सक्षम होना करने के साथ पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया गया है।

पूरक चित्रा 1: वैक्यूम इमेजिंग खिड़की के ड्राइंग डिजाइन यह आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: वैक्यूम सेटअप के फोटोग्राफ यह आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: डिजाइन Drawiस्टेज प्लेट डालने की एनजी यह आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1
पूरक मूवी 1:। चित्रा 2A में पोस्टरों की मूवी (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

पूरक चित्रा 2
पूरक हटो 2:। 3D पुनर्निर्माण चित्रा 2B में दिखाया अलग कोण को देखने और समय के साथ प्रगति दिखाने का मूवी (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।


पूरक मूवी 3:। फेफड़ों की सतह के नीचे 15 माइक्रोन पर चित्रा 3 ए में दिखाया गया 5x5 पच्चीकारी की मूवी (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

पूरक चित्रा 4
पूरक मूवी 4:। एक एकल कोशिका चित्रा 3 बी में चित्रित फेफड़ों में बँटवारा के दौर से गुजर की मूवी (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

पूरक चित्रा 5
पूरक मूवी 5: चित्रा 4 की मूवी, छोड़ दिया रोड़ा और च दिखा पैनलदंड। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

पूरक चित्रा 6
पूरक मूवी 6:। चित्रा 4 की मूवी, सही पैनल रक्त औसत के बाद संवहनी परिभाषा की वसूली दिखा (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

पूरक कोड फ़ाइल:। मूसा की सिलाई इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक कोड फ़ाइल:। रक्त औसत का प्रदर्शन करना कृपया यहाँ इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

विवो ऑप्टिकल ऐसे प्रोटीन और एंटीबॉडी के रूप में fluorescently लेबल कार्यात्मक टैग के साथ संयुक्त इमेजिंग में उच्च संकल्प नाटकीय रूप से मेटास्टेटिक झरना के बारे में हमारी समझ को बढ़ा दिया है। यह प्रत्यक्ष दृश्य और एकल कोशिका और ट्यूमर कोशिकाओं में उप सेलुलर मापदंडों, मेजबान कोशिकाओं और उनके microenvironment की मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम है। प्राथमिक ट्यूमर के भीतर इस इमेजिंग असतत microenvironments है कि या तो विकास आक्रमण या प्रसार 6.7 का समर्थन कर रहे हैं की खोज करने के लिए, उदाहरण के लिए, प्रेरित किया है। आक्रमण के मामले में, vivo इमेजिंग intravasation 7,50 में मैक्रोफेज और ट्यूमर कोशिकाओं के सह-migrational स्ट्रीमिंग का तरजीही भूमिका सामने आई है।

फेफड़ों की तरह माध्यमिक साइटों, मेटास्टेसिस के शुरुआती दौर में ट्यूमर सेल व्यवहार की गतिशीलता को समझने, पूर्व micrometastasis बोने मंच सहित जब ट्यूमर कोशिकाओं के एकल और छोटे समूहों में आने और, रक्त वाहिका endothelium के साथ बातचीत केवल उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग कर पूरा कर दिया जाएगा। स्टैंडर्ड नैदानिक ​​इमेजिंग तौर तरीकों संकल्प केशिका बिस्तर के ठीक संरचना या एकल कोशिका संकल्प पर आकृति विज्ञान और कोशिकाओं की बातचीत या तो कल्पना करने की जरूरत नहीं है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत इमेजिंग तकनीक के इस चुनौतीपूर्ण कार्य को पूरा।

इस तरह के छिड़काव सहित उचित फेफड़ों के शरीर क्रिया विज्ञान, प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए कनेक्शन को बनाए रखने और सेलुलर गतिशीलता का सिर्फ एक स्थिर दृश्य की तुलना में अधिक की पेशकश के द्वारा तालिका 1 प्रस्ताव में पूर्व vivo फेफड़ों की तैयारियों पर एक महत्वपूर्ण लाभ सूचीबद्ध उन लोगों के रूप intravital इमेजिंग खिड़कियां। वैक्यूम विशेष प्रस्ताव में स्थिर हो खिड़कियों ऊतक स्थिरता का एक स्तर है कि अत्यधिक पंजीकृत छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है, तीन आयामी पुनर्निर्माण (चित्रा 2 बी) और देखें पच्चीकारी इमेजिंग के बड़े क्षेत्र के लिए क्षमता को सक्रिय करने के (छविUre 3 ए)। एक साथ इन, फेफड़ों के विचारों की एक सीमा प्रदान एक histologic प्रकार कम बढ़ाई देखें जो ऊतक आकृति विज्ञान देता है, एक उप सेलुलर का मानना है कि यहां तक कि गुणसूत्र जुदाई पता चलता है और निष्क्रिय और विभाजित ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) भेदभाव कर सकते हैं करने के लिए। एकाधिक अधिग्रहण चैनलों कई प्रकार की कोशिकाओं और उनकी बातचीत एक साथ देखे जा करने के लिए (2A चित्रा) की अनुमति है।

प्रोटोकॉल कुछ महत्वपूर्ण कदम है और अंक के लिए कुछ तकनीकी कौशल, अभ्यास और ध्यान रखना करने के लिए 12 घंटे की प्रक्रिया और इमेजिंग बार की सफलता की दर में सुधार होगा करता है उम्मीद की जा सकती। यह यकीन है कि फेफड़े के ऊतकों में अच्छी तरह से खिड़की (कदम 4.25) पर केंद्रित है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि वैक्यूम फेफड़े के ऊतकों (कदम 4.27) भर में समान रूप से और पूरी तरह से लागू किया जाता है। ऊतक केंद्र में विफलता के ऊतकों की गति में परिणाम होगा। निरोधक दोहन (पूरक चित्रा 2) टी प्रयोग किया जाता हैओ गति प्राकृतिक साँस लेता जानवर के दौरान पसलियों के बीच मांसपेशियों के संकुचन से प्रेरित कम। यह माउस पर चुस्त किया जाना चाहिए, लेकिन छाती सेक नहीं। बहुत ज्यादा संपीड़न माउस का एक कम व्यवहार्यता में फेफड़ों के पालियों के साथ-साथ दिल और परिणाम के सभी पर दबाव डालता है। dextran इंजेक्शन (कदम 5.8) के बाद फेफड़ों वाहिका में बह नहीं मनाया जाता है, फेफड़े के ऊतकों या तो सर्जरी के दौरान अनुचित हैंडलिंग से क्षतिग्रस्त है या वैक्यूम स्तर बहुत अधिक है। 0.5-1 इंच पारा द्वारा वैक्यूम कम अगर प्रवाह बहाल कर रहा है देखने के लिए प्रयास किया जा सकता है। प्रवाह बहाल नहीं किया जाता है, या अगर कोई प्रवाह है, लेकिन dextran extravascularly मनाया जाता है, फेफड़े के ऊतकों है कि इस क्षेत्र में क्षतिग्रस्त हो गया है और यह छवि को देखने का एक अलग क्षेत्र के लिए आवश्यक हो जाएगा। इमेजिंग क्षेत्र में उचित रक्त प्रवाह का रख-रखाव सुनिश्चित करना है कि उचित शरीर क्रिया विज्ञान मापा जा रहा है के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि ऑक्सीजन नहीं अल्वेओली के अंदर से ऊतक के लिए आपूर्ति और वीएएस के माध्यम से किया जाता हैculature, इस्कीमिक हाइपोक्सिया संभावना नहीं है। फिर भी, unperfused वाहिका संभावित 2 का स्तर बदल ऑक्सीजन / सीओ को जन्म दे सकता है और यह भी ब्याज के ऊतकों तक पहुँचने से ल्यूकोसाइट्स घूम कर पाएगा। बहने एरिथ्रोसाइट्स के दृश्य उचित फेफड़े की कार्यक्षमता के एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फेफड़े के ऊतकों बहुत नाजुक है और यह भी तस्वीर क्षति की संभावना है। अन्य क्षेत्रों की तो बाद समय चूक इमेजिंग रक्त प्रवाह imaged क्षेत्र में बंद हो जाता है, लेजर सबसे अधिक संभावना बहुत अधिक है और बाद इमेजिंग शक्ति कम से कम किया जाना चाहिए। जब या तो GFP या तिपतिया घास ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (जो चार बार मतलब चमक है) का उपयोग कर हम नमूना photodamage बिना पर्याप्त उज्ज्वल छवियों का उत्पादन करने में ~ 10-15 मेगावाट पाया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए न्यूनतम चमक स्तर माइक्रोस्कोप मापदंडों और कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर पर बहुत निर्भर कर रहे हैं और अनुभव से परीक्षण किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में, ट्यूमर कोशिकाओं को एक उज्ज्वल cytoplas साथ लेबल रहे हैंmic फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेल शरीर और intracellular रिक्त स्थान है कि प्रोटीन (यानी नाभिक) को बाहर की एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करता है। मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं को एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल syngeneic के उपयोग के द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। दोनों प्रकार के सेल लेबलिंग वास्तविक समय में उनकी सीधी बातचीत के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। इमेजिंग की विस्तारित अवधि आवृत्ति, अवधि और किस हद तक साथ कैंसर की कोशिकाओं को एक physiologically प्रासंगिक संदर्भ में मैक्रोफेज के साथ बातचीत की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, इस प्रक्रिया के लिए 12 घंटे की अवधि के लिए बरकरार फेफड़ों में सक्षम बनाता गति मुक्त, कई चैनल, उच्च संकल्प, एकल कोशिका इमेजिंग। ऐसी इलेक्ट्रॉनिक ज़ूम के लिए 25X 0.95NA और multiphoton की क्षमताओं के रूप में एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस का उपयोग फेफड़ों आज तक देखा में उच्चतम संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग की अनुमति देता है।

Intravascularly इंजेक्शन फ्लोरोसेंट, उच्च आणविक भार dextran पीईसंवहनी अंतरिक्ष लेबलिंग और इसकी अखंडता की पुष्टि करने की दोहरी भूमिका rforms। 155 केडीए dextran interendothelial रिक्त स्थान के माध्यम से प्रसार को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। नाड़ी के प्रवाह की या extravascular अंतरिक्ष में संवहनी रिसाव की कमी का कोई संकेत अनुचित हैंडलिंग या अत्यधिक निर्वात के कारण ऊतकों को नुकसान इंगित करता है।

अंत में, अद्वितीय इमेज प्रोसेसिंग तकनीक नियोजित किया जा सकता इस प्रोटोकॉल के उच्च स्थानिक स्थिरता का लाभ उठाने कि। चूंकि लेबल हटाया गया एरिथ्रोसाइट्स और अन्य ल्यूकोसाइट्स फ्लोरोसेंट dextran बाहर जब वे केशिकाओं के माध्यम से गुजरती हैं, यह संकेत समय के साथ औसतन किया जा सकता चमकती है कि वे बनाने हटा दें। इस वाहिका की एक अच्छी तरह से परिभाषित देखें अन्यथा संभव नहीं है।

इस तकनीक की सीमाएं (जैसे देर से मंच मेटास्टेटिक कैंसर, दोनों सर्जरी, जो संभावित रोगों कौन सा जानवर को कमजोर के अध्ययन के लिए इसके उपयोग पेचीदा की आक्रामक स्वभाव में शामिलतीव्र सिकल सेल एनीमिया), और है, जो सीमा लंबे यद्यपि (12 घंटा तक की यह एक एकल के लिए उपयोग तथ्य यह है कि सर्जरी के टर्मिनल है), इमेजिंग सत्र। इसके अलावा, इमेजिंग सत्र और चूहों 51 से कम यकृत ग्लाइकोजन रिजर्व की लंबी अवधि को देखते हुए, ग्लूकोज पूरकता प्रयोगों में पूर्वाग्रह के संभावित स्रोतों से बचने के लिए दी जा सकती है।

इस प्रोटोकॉल संभावित इंजेक्शन fluorescently लेबल एंटीबॉडी या तो या आदेश वास्तविक समय में अन्य संरचनाओं या सेल प्रकार लेबल करने में dextran के अलावा जगह में साथ संशोधित किया जा सकता है। यह विश्लेषण और सीधे वास्तविक समय में ट्यूमर सेल मेजबान सेल बातचीत और गतिशीलता visualizing द्वारा ट्यूमर microenvironment विदारक के लिए क्षमताओं का विस्तार होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

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Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

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